第二章 工業(yè)微生物4

（五）分子育種1.過(guò)量表達(dá)（overexpression)目的：（1）直接生產(chǎn)酶（2）強(qiáng)化代謝途徑方法：（1）游離載體，自主復(fù)制，拷貝數(shù)高，不穩(wěn)定（2）整合型載體，整合到染色體，穩(wěn)定，整合如何做到高拷貝？重復(fù)順序，核糖體RNA基因(rDNA)、轉(zhuǎn)座子。2.基因敲除（knockout）（基因缺失，破壞）（1）基因功能分析（2）菌種選育3.基因定點(diǎn)突變（site-directedmutation)

（1）替換（2）插入（3）缺失4.Knockin;knockoutandknockin定點(diǎn)突變5.基因的直接進(jìn)化(directedevolution)突變

易錯(cuò)PCR（errorpronePCR

），正突變庫(kù)的建立重組

DNAshuffling

，將多個(gè)正突變集合到一起篩選

highthrough-put，基因突變庫(kù)的篩選

步驟：

在分子水平上，對(duì)目標(biāo)基因直接處理，然后通過(guò)高通量的篩選方法，提高目標(biāo)蛋白的性能。易錯(cuò)PCRXXXX

XXXX

XXX

XXXX

XXXXXXX

XXX

XXXX

XXXXXXXX

XXX

XXXX

XXXXXXX

XXXXXXXXXXXXXXXX

FragmentReassembleSelectbestwithDNAseIfragmentsrecombinantsRepeatformultiplecyclesDNAshufflingDNAShuffling:指DNA分子的體外重組，是基因在分子水平上進(jìn)行有性重組(SexualRecombination)。項(xiàng)目進(jìn)化速度進(jìn)化對(duì)象進(jìn)化周期影響對(duì)象突變效率常規(guī)定向進(jìn)化緩慢進(jìn)化整個(gè)基因組多年完整基因組低DNAShuffling快速進(jìn)化特定基因/操縱子/病毒幾天部分基因組高DNAShuffling與常規(guī)定向進(jìn)化的比較類(lèi)型示例特性活性增加倍數(shù)潛在應(yīng)用領(lǐng)域抗體人源抗體親和性400生物制藥酶天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶催化特異性10，000生物制藥β-內(nèi)酰胺酶抗生素抗性32，000抗生素枯草桿菌蛋白酶E耐熱性65℃耐熱時(shí)間17200工業(yè)酶細(xì)胞因子人類(lèi)干擾素抗病毒285，000基因治療腫瘤抑制因子P5337℃半衰期12基因治療代謝途徑砷酸鹽代謝途徑砷酸鹽解毒40生物制藥汞代謝途徑汞解毒12生物制藥部分DNAShuffling技術(shù)的研究成果脂酶拆分2-甲基癸酸硝基苯酯例：PLAPLA光學(xué)拆分選擇性(%)231577581905次錯(cuò)位PCR2次定點(diǎn)突變Reetz(1997)Liebeton(2000)6.基因組重排（genomeshuffling）多親株多輪原生質(zhì)體融合篩選的有效性二、微生物代謝工程的進(jìn)展遺傳修飾設(shè)計(jì)策略代謝分析出發(fā)菌株高效生產(chǎn)菌株代謝工程的基本思路

設(shè)計(jì)策略是基礎(chǔ)遺傳修飾是關(guān)鍵設(shè)計(jì)策略：正向(Constructive)代謝工程

1991年在Science上正式提出，基本思想是：根據(jù)已有的遺傳和生化知識(shí)，找出限速步驟，進(jìn)行遺傳操作正向代謝工程：重新分配中心途徑代謝流PyruvateLactateSugarldhNADHNAD+XNADHNAD+L-alaninealadfromBacillusNH4+AlanineracemaseX乳酸乳球菌以同型發(fā)酵方式，將95%以上的葡萄糖轉(zhuǎn)化為L(zhǎng)-乳酸將乳酸脫氫酶（LDH）敲除，然后再表達(dá)丙氨酸脫氫酶，并敲除丙氨酸消旋酶，可以將原來(lái)到L-乳酸的碳流重新分配到L-丙氨酸（甜味劑）實(shí)現(xiàn)同型乳酸發(fā)酵到同型丙氨酸發(fā)酵。設(shè)計(jì)策略：反向(Inverse)代謝工程1996年首次提出，三個(gè)步驟：1.獲得預(yù)期的表型2.確定其基因型3.選擇工業(yè)菌株并對(duì)其相應(yīng)基因進(jìn)行遺傳操作，以期獲得同樣的表型反向代謝工程：基因組測(cè)序發(fā)現(xiàn)新靶點(diǎn)日本學(xué)者對(duì)兩株谷氨酸棒桿菌（一株是生長(zhǎng)較差但能高產(chǎn)賴氨酸的突變株、另一株為生長(zhǎng)良好的野生型）進(jìn)行全基因組測(cè)序找出突變株與野生型不同、且有可能影響賴氨酸生產(chǎn)的突變基因然后將這些突變導(dǎo)入野生型，結(jié)果獲得了迄今為止最高水平的賴氨酸生產(chǎn)率3gL-1h-1這是利用組學(xué)進(jìn)行反向代謝工程研究的第一個(gè)例子設(shè)計(jì)策略：進(jìn)化(Evolutionary)代謝工程

基因組重排于2002年正式提出引發(fā)NatureBiotechnol.評(píng)論進(jìn)化代謝工程：泰樂(lè)菌素菌種改良自然適應(yīng)和進(jìn)化代謝工程遺傳修飾：基因敲除DNAGene1Gene2Gene3Enzyme1Enzyme2Enzyme3ABCDADNAXXX遺傳修飾：基因表達(dá)DNAGene1Gene2Gene3Enzyme1Enzyme2Enzyme3ABCDADNAXXXGene4Enzyme4E代謝分析：代謝網(wǎng)絡(luò)模型和代謝組學(xué)JochenForsteretal.GenomeRes.2003;13:244-253代謝分析：代謝通量分析E’??????A?C?EABCDEv1v2v3v4v5v6v7ABCDEMetaboliteidentificationPathwayreconstructionMetabolicfluxanalysisv1?v3??v6v7其基本原理是假設(shè)胞內(nèi)代謝物濃度都處于擬穩(wěn)態(tài)，根據(jù)物質(zhì)平衡得到一系列關(guān)于通量的數(shù)學(xué)方程，然后通過(guò)測(cè)定其中一些通量的變化，來(lái)獲得整個(gè)代謝網(wǎng)絡(luò)的通量分布[5]。MFA已在許多微生物的代謝工程中得到應(yīng)用。代謝分析：互相作用關(guān)系綜合設(shè)計(jì)策略：1,3-丙二醇3-磷酸甘油醛丙酮酸葡萄糖TCA循環(huán)磷酸二羥丙酮3-磷酸甘油甘油酵母的甘油途徑大腸桿菌自身的代謝途徑1,3-丙二醇3-羥基丙醛肺炎桿菌的1,3-丙二醇途徑

修飾了>70個(gè)基因，最后工程菌中有18個(gè)基因被敲除或過(guò)量表達(dá)

1,3-丙二醇產(chǎn)量135g/L，生產(chǎn)率3.5g/L，h1A（1）B（2）2A（1）B（2）C（3）通用轉(zhuǎn)錄機(jī)器工程第三節(jié)工業(yè)生產(chǎn)菌種的復(fù)壯與保藏一、退化現(xiàn)象及原因二、復(fù)壯三、菌種的保藏一、工業(yè)生產(chǎn)菌種的退化現(xiàn)象及原因什么是菌種退化?表現(xiàn)：產(chǎn)量性狀及與產(chǎn)量性狀相關(guān)的形態(tài)上和生理上的變化抗不良條件能力的下降，如抗噬菌體，耐溫性能等量變到質(zhì)變的逐漸演化過(guò)程（一）菌種退化的原因基因突變（回復(fù)突變）分離現(xiàn)象Letter:Genome-widenon-mendelianinheritanceofextra-genomicinformationinArabidopsisSusanJ.Lolle,JenniferL.Victor,JessicaM.YoungandRobertE.Pruittdoi:10.1038/nature03380回復(fù)突變（二）菌種退化的防治1.菌種選育方面：使用孢子或單核菌株，避免對(duì)多核菌株進(jìn)行處理較高的誘變劑量，減少回復(fù)突變充分的中間培養(yǎng)及分離純化2.控制傳代次數(shù)3.創(chuàng)造良好的培養(yǎng)條件4.利用不易衰退的細(xì)胞傳代，孢子5.有效的菌種保藏方法傳代次數(shù)每代斜面保存時(shí)間/d回復(fù)子比例

腺苷產(chǎn)量/(g/L)1（147）1/4.5×10613.22（133）（14）1/2.4×10614.96（47）（3）（9）（3）（71）（14）1/2.2×10510.77（47）（3）（9）（3）（13）（58）（14）1/3.5×10613.19（47）（3）（9）（3）（13）（8）（3）（47）（14）1/5.3×1038.112(47)（3）（9）（3）（13）（8）（3）（4）（14）（6）（6）（31）1/1.0×1037.4二、生產(chǎn)菌種的復(fù)壯純種分離淘汰已衰退的個(gè)體選擇合適的培養(yǎng)條件三、工業(yè)生產(chǎn)菌種的保藏保藏的意義：存活健在避免退化，保證高產(chǎn)穩(wěn)產(chǎn)保證研究結(jié)果良好的重現(xiàn)性基本措施降低營(yíng)養(yǎng)成分，低溫，干燥，缺氧等條件，使其處于生長(zhǎng)停滯或休眠狀態(tài)常用保藏方法斜面保藏和穿刺保藏（好氣性）沙土管干燥保藏產(chǎn)孢子的絲狀真菌或放線菌，或產(chǎn)芽孢的細(xì)菌真空冷凍干燥保藏方法安瓿管的處理保護(hù)劑的使用，目前國(guó)內(nèi)常用脫脂乳和蔗糖，國(guó)外尚有運(yùn)用動(dòng)物血清等的。低溫保藏普通冷凍保藏技術(shù)(-20℃)超低溫冷凍保藏技術(shù)(-60一-80℃)液氮冷凍保藏技術(shù)保護(hù)劑的的使用，甘油，二甲基亞砜不同保藏方法的比較菌種保藏的注意事項(xiàng)菌種在保藏前所處的狀態(tài)菌種保藏所用的基質(zhì)操作過(guò)程對(duì)細(xì)胞結(jié)構(gòu)的損害國(guó)內(nèi)外菌種保藏機(jī)構(gòu)國(guó)外：ATCC（AmericanTypeCultureCollection）

ATCCisaglobalbioresourcecenterthatstoresanddistributesbiologicalmaterialssuchascelllines,bacteria,animalandplantvirusesandantisera,fungi,protozoa,algae,clonesandothermoleculargenomicmaterialsATCC(AmericanTypeCultureCollection）美國(guó)典型菌種保藏中心

ATCC主要從事農(nóng)業(yè)、遺傳學(xué)、應(yīng)用微生物、免疫學(xué)、細(xì)胞生物學(xué)、工業(yè)微生物學(xué)、菌種保藏方法、醫(yī)學(xué)微生物學(xué)、分子生物學(xué)、植物病理學(xué)、普通微生物學(xué)、分類(lèi)學(xué)、食品科學(xué)等的研究。

該中心保藏有藻類(lèi)111株，細(xì)菌和抗生素16865株，細(xì)胞和雜合細(xì)胞4300株，絲狀真菌和酵母46000株，植物組織79株，種子600株，原生動(dòng)物1800株，動(dòng)物病毒、衣原體和病原體2189株，植物病毒1563種。

另外，該中心還提供菌種的分離、鑒定及保藏服務(wù)。該中心保藏的菌種可出售。ARSCultureCollection-NRRL/WelcometothenewARS(NRRL)CultureCollectionwebsite.TheCollectionishousedwithintheMicrobialGenomicsandBioprocessingResearchUnitattheNationalCenterforAgriculturalUtilizationResearch(NCAUR)inPeoria,Illinois.ThiswebsitecontainsinformationspecifictotheARSCultureCollection,butadditionalinformationregardingtheResearchUnitandNCAUR---NorthernRegionalResearchLaboratoryAgriculturalResearchServiceCultureCollection

NationalCenterforAgriculturalUtilizationResearch

Peoria,IllinoisUSANRRL(AgriculturalResearchServiceCultureCollection)美國(guó)農(nóng)業(yè)研究菌種保藏中心

NRRL是由美國(guó)農(nóng)業(yè)部農(nóng)業(yè)研究中心支持的政府性質(zhì)的菌種保藏中心。主要從事農(nóng)業(yè)、應(yīng)用微生物、基因工程、工業(yè)微生物、菌種保藏方法、環(huán)境保護(hù)、分子生物學(xué)、食品安全、普通微生物、分類(lèi)學(xué)的研究。

該中心保藏有細(xì)菌10500株，真菌45000株，酵母14500株，放線菌9500株。

另外，該中心還提供細(xì)菌、真菌、酵母的鑒定服務(wù)。

CBS(CentraalbureauvoorSchimmelcultures)荷蘭微生物菌種保藏中心網(wǎng)址：www.cbs.knaw.nl/.CBS是半政府性質(zhì)的主要保藏真菌、酵母菌種保藏中心。

該中心主要從事菌種保藏方法、分類(lèi)學(xué)、分子生物學(xué)、醫(yī)學(xué)微生物學(xué)等的研究。

該中心保藏有真菌35000株、酵母5500株。該中心保藏的菌種可出售。NBRC33023

AspergillusnigervanTieghemSynonym:Aspergilluscinnamomeus,Aspergillusnigervar.altipes,Aspergillusschiemanni

←IFO33023←CBS554.65

=ATCC16888=BCRC31130=CBS554.65=IAM15058=IMI50566=IMI50566ii=JCM10254=JCM1864=NRRL326=RIB2641

Source:tannin-gallicacidf