人教-選修1-固定化酵母細(xì)胞及蔗糖酶的檢測(cè)1

固定化酵母細(xì)胞及蔗糖酶的檢測(cè)實(shí)驗(yàn)?zāi)康牧私饷概c細(xì)胞固定化方法并掌握一種酵母細(xì)胞固定化技術(shù)。了解蔗糖酶活力的測(cè)定原理及還原糖的定性檢測(cè)法。實(shí)驗(yàn)原理固定化酶和固定化細(xì)胞是利用物理及化學(xué)的處理方法，將水溶性酶或細(xì)胞與固體的水不溶性支持物（或稱載體）相結(jié)合，使其既不溶于水，又能保持酶和微生物的活性。它們?cè)诠滔酄顟B(tài)下增加了機(jī)械強(qiáng)度，穩(wěn)定性提高，可回收反復(fù)使用，并在貯存較長(zhǎng)時(shí)間后依然保持酶和微生物的活性不變。常用的固定化方法有：（1）物理吸附法；（2）交聯(lián)法；（3）包埋法。相對(duì)于固定化酶，微生物細(xì)胞固定化技術(shù)的優(yōu)點(diǎn)是可避免復(fù)雜的酶提取和純化過程，也降低了成本，同時(shí)也解決了酶的不穩(wěn)定性問題，操作穩(wěn)定性也較好。微生物細(xì)胞固定化常用的載體有：①多糖類（纖維素、瓊脂、葡萄糖凝膠、海藻酸鈣、K-角叉膠、DEAE-纖維素等）；②蛋白質(zhì)（骨膠原、明膠等）；③無(wú)機(jī)載體（氧化鋁、活性炭、陶瓷、磁鐵、二氧化硅等）。蔗糖酶活力的檢測(cè)原理是利用了蔗糖酶可以催化蔗糖水解生成果糖和葡萄糖，而單糖含有游離羰基，具有弱還原性。某些弱氧化劑（如硫酸銅的堿性溶液，即斐林試劑）與單糖在煮沸的條件下，會(huì)有溶液的顯色變化過程：淺藍(lán)色→棕色→磚紅色（氧化亞沉淀，）而蔗糖不能與斐林試劑發(fā)生顏色反應(yīng)。且葡萄糖溶液濃度越高，顏色越深。儀器和試劑儀器：試管、2mL吸管2支、水浴鍋、漏斗試劑：海藻酸鈉若干克；卡氏酵母液；4%CaCl2；10%蔗糖液100mL；斐林試劑甲、乙液。實(shí)驗(yàn)步驟

1．酵母細(xì)胞固定化：稱取海藻酸鈉1克加入100ml水中，微火加熱溶解后冷卻到30℃左右，將預(yù)先準(zhǔn)備好的卡氏酵母液10~15mL（若濃度低，可提高加入量）加入混勻。然后倒入下邊裝有膠管與止血夾的漏斗中，讓其慢慢滴入4%的150~200ml氯化鈣溶液中，制成直徑2~3mm的球形固定化酵母。剛形成的凝膠珠應(yīng)在CaCl2溶液中浸泡一段時(shí)間，以便形成穩(wěn)定的結(jié)構(gòu)。

檢驗(yàn)?zāi)z珠的質(zhì)量是否合格，可以使用下列方法。一是用鑷子夾起一個(gè)凝膠珠放在實(shí)驗(yàn)桌上用手?jǐn)D壓，如果凝膠珠不容易破裂，沒有液體流出，就表明凝膠珠的制作成功。二是在實(shí)驗(yàn)桌上用力摔打凝膠珠，如果凝膠珠很容易彈起，也能表明制備的凝膠珠是成功的。將固定化酵母細(xì)胞裝入玻璃柱中（柱下端口塞上棉花），從柱上端加入10~20ml10%的蔗糖液，靜止反應(yīng)10min?？刂埔欢ǖ牧魉偈顾馓且旱稳霟?。2．蔗糖酶的檢測(cè)：吸取上述水解液2mL于干凈試管中，加入斐林試劑2mL，浸入沸水浴中約1~2min，觀察顏色變化。有氧化亞銅沉淀的說(shuō)明蔗糖已被水解，管中有蔗糖酶的存在。以10%蔗糖液作空白對(duì)照。注意事項(xiàng)

1．酵母細(xì)胞的活化：在缺水的狀態(tài)下，微生物會(huì)處于休眠狀態(tài)。酵母細(xì)胞所需要的活化時(shí)間較短，一般需要0.5～1h，需提前做好準(zhǔn)備。此外，酵母細(xì)胞活化時(shí)體積會(huì)變大，因此活化前應(yīng)該選擇體積足夠大的容器，以避免酵母細(xì)胞的活化液溢出容器外。2．加熱使海藻酸鈉溶化是操作中最重要的一環(huán)，涉及到實(shí)驗(yàn)的成敗，海藻酸鈉的濃度涉及到固定化細(xì)胞的質(zhì)量。如果海藻酸鈉濃度過高，將很難形成凝膠珠；如果濃度過低，形成的凝膠珠所包埋的酵母細(xì)胞的數(shù)目少，影響實(shí)驗(yàn)效果?？梢酝ㄟ^觀察凝膠珠的顏色和形狀來(lái)判斷：如果制作的凝膠珠顏色過淺、呈白色，說(shuō)明海藻酸鈉的濃度偏低，固定的酵母細(xì)胞數(shù)目較少；如果形成的凝膠珠不是圓形或橢圓形，則說(shuō)明海藻酸鈉的濃度偏高，