基因工程的基本序列

§1.2基因工程的基本操作程序基因工程基本操作的四個(gè)步驟1、目的基因的獲取2、基因表達(dá)載體的構(gòu)建3、將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞4、目的基因的檢測與鑒定原核細(xì)胞的基因結(jié)構(gòu)非編碼區(qū)非編碼區(qū)編碼區(qū)編碼區(qū)上游編碼區(qū)下游與RNA聚合酶結(jié)合位點(diǎn)啟動(dòng)子終止子RNA聚合酶能夠識別結(jié)合位點(diǎn)，并與其結(jié)合。

轉(zhuǎn)錄開始后，RNA聚合酶沿DNA分子移動(dòng)，并以DNA分子的一條鏈為模板合成RNA。

轉(zhuǎn)錄完畢后，RNA鏈釋放出來，緊接著RNA聚合酶也從DNA模板鏈上脫落下來。真核細(xì)胞的基因結(jié)構(gòu)編碼區(qū)非編碼區(qū)非編碼區(qū)與RNA聚合酶結(jié)合位點(diǎn)內(nèi)含子

外顯子

能夠編碼蛋白質(zhì)的序列叫做外顯子

不能夠編碼蛋白質(zhì)的序列叫做內(nèi)含子啟動(dòng)子終止子編碼區(qū)上游編碼區(qū)下游內(nèi)含子：外顯子：原核細(xì)胞真核細(xì)胞不同點(diǎn)編碼區(qū)是_____的編碼區(qū)是間隔的、_____的相同點(diǎn)都由能夠編碼蛋白質(zhì)的______和具有調(diào)控作用的______區(qū)組成的原核細(xì)胞與真核細(xì)胞的基因結(jié)構(gòu)比較思考

編碼相同數(shù)目氨基酸的蛋白質(zhì)，原核細(xì)胞與真核細(xì)胞基因結(jié)構(gòu)一樣長嗎？連續(xù)不連續(xù)編碼區(qū)非編碼一、目的基因的獲取1、目的基因主要是指______________________編碼蛋白質(zhì)的基因2、獲取目的基因的常用方法有哪些?請閱讀P9第一和二兩段(一)從基因文庫中獲取目的基因

將含有某種生物不同基因的許多DNA片斷，導(dǎo)入到受體菌的群體中，各個(gè)受體菌分別含有這種生物的不同基因，稱為基因文庫基因文庫

基因組文庫部分基因文庫（如:cDNA文庫）1.基因文庫2.基因文庫的構(gòu)建方法①鳥槍法：供體細(xì)胞中的DNA許多DNA片段運(yùn)載體限制酶與載體連接載入受體細(xì)胞產(chǎn)生特定性狀導(dǎo)入外源DNA擴(kuò)增目的基因分離(直接分離法)(一)從基因文庫中獲取目的基因目的基因的mRNA雜交雙鏈(單鏈RNA/單鏈DNA)單鏈DNA反轉(zhuǎn)錄酶核酸酶H2.基因文庫的構(gòu)建方法DNA聚合酶雙鏈DNA(目的基因)求異思維你能推測出由mRNA反轉(zhuǎn)錄形成cDNA的過程大致分為哪些步驟嗎？反轉(zhuǎn)錄酶既可以利用DNA又可以利用RNA作為模板合成與之互補(bǔ)的DNA鏈。像其他DNA聚合酶一樣，反轉(zhuǎn)錄酶也以5′→3′方向合成DNAcDNA合成過程是：第一步，反轉(zhuǎn)錄酶以RNA為模板合成一條與RNA互補(bǔ)的DNA單鏈，形成RNA-DNA雜交分子。第二步，核酸酶H使RNA-DNA雜交分子中的RNA鏈降解，使之變成單鏈的DNA。第三步，以單鏈DNA為模板，在DNA聚合酶的作用下合成另一條互補(bǔ)的DNA鏈，形成雙鏈DNA分子。③根據(jù)已知的氨基酸序列合成DNA法：蛋白質(zhì)的氨基酸序列mRNA的核苷酸序列結(jié)構(gòu)基因的核苷酸序列推測推測目的基因化學(xué)合成2.基因文庫的構(gòu)建方法上述三種目的基因提取的方法有何優(yōu)缺點(diǎn)？優(yōu)點(diǎn)缺點(diǎn)鳥槍法反轉(zhuǎn)錄法根據(jù)已知氨基酸合成DNA法操作簡便廣泛使用工作量大，盲目，分離出來的有時(shí)并非一個(gè)基因?qū)Ｒ恍詮?qiáng)操作過程麻煩，mRNA很不穩(wěn)定，要求的技術(shù)條件較高專一性最強(qiáng)僅限于合成核苷酸對較少的簡單基因?qū)じ鶈柕?.為什么要構(gòu)建基因文庫？直接從含有目的基因的生物體內(nèi)提取不行嗎？構(gòu)建基因文庫是獲取目的基因的方法之一，并不是惟一的方式。如果所需要的目的基因序列已知，就可以直接獲得，也可以通過反轉(zhuǎn)錄，用PCR方式從mRNA中獲得，不一定要構(gòu)建基因文庫。但如果所需要的目的基因的序列完全不知，或只知道目的基因序列的一段，或想從一種生物體內(nèi)獲得許多基因，或者想知道這種生物與另一種生物之間有多少基因不同，或者想知道一種生物在個(gè)體發(fā)育的不同階段表達(dá)的基因有什么不同，或者想得到一種生物的全基因組序列，往往就需要構(gòu)建基因文庫。(二)利用PCR技術(shù)擴(kuò)增目的基因①概念：PCR全稱為_______________，是一項(xiàng)在生物____復(fù)制___________的核酸合成技術(shù)③條件：_______________________、

_______________、___________(做啟動(dòng)子)、___________.前提條件：②原理：__________④方式：以_____方式擴(kuò)增，即____（n為擴(kuò)增循環(huán)的次數(shù)）⑤結(jié)果：選修1P60聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)體外特定DNA片段DNA復(fù)制已知基因的核苷酸序列四種脫氧核苷酸一對引物DNA聚合酶指數(shù)2n使目的基因的片段在短時(shí)間內(nèi)成百萬倍地?cái)U(kuò)增(二)利用PCR技術(shù)擴(kuò)增目的基因b、PCR（聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)）技術(shù)擴(kuò)增由穆里斯等人于1988年發(fā)明，并于1993年獲得若貝爾化學(xué)獎(jiǎng)。PCR反應(yīng)的過程：（變性、退火、延伸、多次重復(fù)）變性退火延伸結(jié)果：雙鏈DNA分子數(shù)為2n可獲取大量目的基因⑥過程：a、DNA變性（90℃-96℃）：雙鏈DNA模板在熱作用下，_____斷裂，形成___________b、退火（復(fù)性25℃-65℃）：系統(tǒng)溫度降低，引物與DNA模板結(jié)合，形成局部________。c、延伸（70℃-75℃）：在Taq酶的作用下，從引物的5′端→3′端延伸，合成與模板互補(bǔ)的________。氫鍵單鏈DNA雙鏈DNA鏈二、基因表達(dá)載體的構(gòu)建尋根問底將目的基因直接導(dǎo)入受體細(xì)胞不是更簡便嗎？如果這么做，結(jié)果會怎樣？有人采用總DNA注射法進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化，即將一個(gè)生物中的總DNA提取出來，通過注射或花粉管通道法導(dǎo)入受體植物，沒有進(jìn)行表達(dá)載體的構(gòu)建，這種方法針對性差，完全靠運(yùn)氣，也無法確定什么基因?qū)肓耸荏w植物,不好檢測與篩選,同時(shí)也無法增強(qiáng)目的基因的表達(dá)水平,也不能確定目的基因產(chǎn)物的存在部位。構(gòu)建基因表達(dá)載體的目的a、使目的基因在受體細(xì)胞中穩(wěn)定遺傳的b、使目的基因復(fù)制并遺傳給下一代c、同時(shí)使目的基因能表達(dá)和發(fā)揮作用。1.用一定的_________切割質(zhì)粒，使其出現(xiàn)一個(gè)切口，露出____________。2.用_____________切斷目的基因，使其產(chǎn)生_________________。(二)基因表達(dá)載體的構(gòu)建——

核心3.將切下的目的基因片段插入質(zhì)粒的______處，再加入適量___________，形成了一個(gè)重組

DNA分子（重組質(zhì)粒）限制酶黏性末端同一種限制酶的黏性末端切口DNA連接酶相同質(zhì)粒DNA分子限制酶處理一個(gè)切口兩個(gè)黏性末端兩個(gè)切口獲得目的基因DNA連接酶重組DNA分子（重組質(zhì)粒）——

核心同一種(二)基因表達(dá)載體的構(gòu)建4.過程:5.基因表達(dá)載體的組成：復(fù)制原點(diǎn)+目的基因+啟動(dòng)子+終止子+標(biāo)記基因它們有什么作用？(三)將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞轉(zhuǎn)化——方法將目的基因?qū)胫参锛?xì)胞將目的基因?qū)雱?dòng)物細(xì)胞將目的基因?qū)胛⑸锛?xì)胞農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法基因槍法花粉管通道法——顯微注射法——感受態(tài)細(xì)胞目的基因進(jìn)入_________內(nèi)，并且在受體細(xì)胞內(nèi)維持_____和_____的過程受體細(xì)胞穩(wěn)定表達(dá)1、將目的基因?qū)胫参锛?xì)胞的方法：農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法（1）農(nóng)桿菌介紹（2）原理及適用范圍(三)將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞根據(jù)農(nóng)桿菌可將目的基因?qū)腚p子葉植物的機(jī)理，你能分析出農(nóng)桿菌不能將目的基因?qū)雴巫尤~植物的原因嗎？若想將一個(gè)抗病基因?qū)雴巫尤~植物，如小麥，從理論上說，你應(yīng)該如何做？思考：原因：研究證明，主要酚類誘導(dǎo)物為乙酰丁香酮和羧基乙酰丁香酮，這些物質(zhì)主要在雙子葉植物細(xì)胞壁中合成，通常不存在于單子葉植物中，這也是單子葉植物不易被根瘤農(nóng)桿菌侵染的原因。如果想將一個(gè)抗病毒基因轉(zhuǎn)入小麥，也可以用農(nóng)桿菌，但要注意兩點(diǎn)：①要選擇合適的農(nóng)桿菌菌株，因?yàn)椴皇撬械霓r(nóng)桿菌菌株都可以侵染單子葉植物；②要加趨化和誘導(dǎo)的物質(zhì)，一般為乙酰丁香酮等，目的是使農(nóng)桿菌向植物組織的受傷部位靠攏（趨化性）和激活農(nóng)桿菌的Vir區(qū)（誘導(dǎo)）的基因，使T-DNA轉(zhuǎn)移并插入到染色體DNA上。2、將目的基因?qū)雱?dòng)物細(xì)胞（1）方法：顯微注射法（2）程序：(三)將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞3、將目的基因?qū)胛⑸锛?xì)胞（1）思考：為什么選用微生物作為受體細(xì)胞？（2）方法：(四)目的基因的檢測與鑒定——檢查是否成功檢測—鑒定——①檢測轉(zhuǎn)基因生物染色體的DNA

上是否插入了目的基因②檢測目的基因是否轉(zhuǎn)錄出了mRNA③檢測目的基因是否翻譯成蛋白質(zhì)抗蟲鑒定、抗病鑒定、活性鑒定等方法——方法——方法——DNA分子雜交分子雜交（注意與上不同之處）抗原抗體雜交四、目的基因的檢測和鑒定

細(xì)菌的檢測，將每個(gè)受體細(xì)胞單獨(dú)培養(yǎng)形成菌落，檢測菌落中是否有目的基因的表達(dá)產(chǎn)物。淘汰無表達(dá)產(chǎn)物的菌落，保留有表達(dá)產(chǎn)物的進(jìn)一步培養(yǎng)、研究。無表達(dá)產(chǎn)物無表達(dá)產(chǎn)物有表達(dá)產(chǎn)物無表達(dá)產(chǎn)物返回四、目的基因的檢測和鑒定多細(xì)胞生物的檢測，將每個(gè)受體細(xì)胞單獨(dú)培養(yǎng)并誘導(dǎo)發(fā)育成完整個(gè)體，檢測這些個(gè)體是否攝入目的基因，攝入的基因是否表達(dá)（是否表現(xiàn)出相應(yīng)的性狀）。淘汰無變化的個(gè)體，保留有相應(yīng)變化的個(gè)體進(jìn)一步培養(yǎng)、研究。例：用棉鈴飼喂棉鈴蟲，如蟲吃后不出現(xiàn)中毒癥狀，說明未攝入目的基因或攝入目的基因未表達(dá)。如蟲吃后中毒死亡，則說明攝入了抗蟲基因并得到表達(dá)。返回（從個(gè)體水平鑒定）DNA分子雜交示意圖

采用一定的技術(shù)手段，將兩種生物的DNA分子的單鏈放在一起，如果這兩個(gè)單鏈具有互補(bǔ)的堿基序列，那么，互補(bǔ)的堿基序列就會結(jié)合在一起，形成雜合雙鏈區(qū)；在沒有互補(bǔ)堿基序列的部位，仍然是兩條游離的單鏈。P15思考與探究基因工程操作流程圖小結(jié)：1）以下說法正確的是（）

A、所有的限制酶只能識別一種特定的核苷酸序列

B、質(zhì)粒是基因工程中唯一的運(yùn)載體

C、運(yùn)載體必須具備的條件之一是：具有多個(gè)限制酶切點(diǎn)，以便與外源基因連接

D、基因控制的性狀都能在后代表現(xiàn)出來C練習(xí)2）不屬于質(zhì)粒被選為基因運(yùn)載體的理由是

A、能復(fù)制（）

B、有多個(gè)限制酶切點(diǎn)

C、具有標(biāo)記基因

D、它是環(huán)狀DNAD練習(xí)3）有關(guān)基因工程的敘述中，錯(cuò)誤的是（）

A、DNA連接酶將黏性末端的堿基對連接起來

B、限制性內(nèi)切酶用于目的基因的獲得

C、目的基因須由運(yùn)載體導(dǎo)入受體細(xì)胞

D、人工合成目的基因不用限制性內(nèi)切酶A練習(xí)4）有關(guān)基因工程的敘述正確的是（）

A、限制酶只在獲得目的基因時(shí)才用

B、重組質(zhì)粒的形成在細(xì)胞內(nèi)完成

C、質(zhì)粒都可作為運(yùn)載體

D、蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)可為合成目的基因提供資料D練習(xí)5）基因工程是在DNA分子水平上進(jìn)行設(shè)計(jì)施工的。在基因操作的基本步驟中，不進(jìn)行堿基互補(bǔ)配對的步驟是（）

A、人工合成目的基因

B、目的基因與運(yùn)載體結(jié)合

C、將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞

D、目的基因的檢測和表達(dá)C練習(xí)思考與探究1.作為基因工程表達(dá)載體，只需含有目的基因就可以完成任務(wù)嗎？為什么？不可以。因?yàn)槟康幕蛟诒磉_(dá)載體中得到表達(dá)并發(fā)揮作用，還需要有其他控制元件，如啟動(dòng)子、終止子和標(biāo)記基因等。必須構(gòu)建上述元件的主要理由是：（1）生物之間進(jìn)行基因交流，只有使用受體生物自身基因的啟動(dòng)子才能比較有利于基因的表達(dá)；（2）通過cDNA文庫獲得的目的基因沒有啟動(dòng)子，只將編碼序列導(dǎo)入受體生物中無法轉(zhuǎn)錄；（3）目的基因是否導(dǎo)入受體生物中需要有篩選標(biāo)記；（4）為了增強(qiáng)目的基因的表達(dá)水平，往往還要增加一些其他調(diào)控元件，如增強(qiáng)子等；