天然產(chǎn)物分離材料

常用的天然產(chǎn)物分離材料Chinapharmaceuticaluniversity主要內(nèi)容硅膠聚酰胺MCI凝膠大孔樹(shù)脂Chinapharmaceuticaluniversity一、硅膠硅膠的組成

硅膠(Silica

Gel)的化學(xué)成分是二氧化硅。用作分離介質(zhì)的硅膠是人工合成的多孔二氧化硅，它的特點(diǎn)是其表面含有硅醇基，這是硅膠可以進(jìn)行表面化學(xué)鍵合的基礎(chǔ)。它是一種具有豐富微孔結(jié)構(gòu)，高比表面積、高純度、高活性的優(yōu)質(zhì)吸附材料。Chinapharmaceuticaluniversity硅膠的分類1.按顆粒大小

通用的分析型硅膠基質(zhì)的直徑為5-10μm

高效制備型硅膠，其直徑多為20-40μm2.正反相硅膠正相柱大多以硅膠為柱填料或是在硅膠表面鍵合-CN,-NH3等官能團(tuán)的鍵合相硅膠柱。反相柱填料主要以硅膠為基質(zhì)，在其表面鍵合非極性的鍵合相。如鍵合十八烷基（ODS）稱為C18柱。其它常用的反相柱還有C8,C4,C2和苯基柱等。Chinapharmaceuticaluniversity3.按含水量根據(jù)其吸水量將硅膠分為五級(jí)：0%為一級(jí)，5%為二級(jí)，15%為三級(jí)，25%為四級(jí)，38%為五級(jí)。五級(jí)的含水量最高，此時(shí)相當(dāng)于分配層析。適用于極性比較大的生物堿、酚類化合物、有機(jī)酸、糖類和氨基酸等成分。Chinapharmaceuticaluniversity硅膠的性質(zhì)

硅膠無(wú)毒、無(wú)味，化學(xué)性質(zhì)比較穩(wěn)定。除氫氟酸和強(qiáng)堿外，不溶于水及各種化學(xué)溶劑，物性非常穩(wěn)定。具有較高機(jī)械強(qiáng)度，對(duì)液相和氣相介質(zhì)有很強(qiáng)的吸附性能。 ●硅膠適用PH范圍：pH

1～8

Chinapharmaceuticaluniversity1、正相硅膠硅膠吸附劑是粉末狀多孔固體，其起到氫鍵吸附作用的基團(tuán)是硅醇基上的羥基（吸附中心），這些羥基所處的形態(tài)不同，其吸附能力也不同。Chinapharmaceuticaluniversity作用原理硅膠的使用1.稱量：根據(jù)上樣量確定通常，稱取上樣量30-70倍的硅膠；如果極難分，也可以用100倍量的硅膠H。Chinapharmaceuticaluniversity2.裝柱：（1）濕法：硅膠與同體積的溶劑混合，用玻璃棒充分?jǐn)嚢?。將柱底用棉花塞緊，加入約1/3體積洗脫劑，打開(kāi)柱下活塞，將勻漿一次傾入柱內(nèi)。用洗脫劑將其壓實(shí)（加入更多的洗脫劑，用雙聯(lián)球或氣泵加壓，直至流速恒定。柱床約被壓縮至9/10體積）。Chinapharmaceuticaluniversity（2）干法：將硅膠連續(xù)加入硅膠柱，同時(shí)輕輕敲打柱子兩側(cè)，直至填入硅膠到合適高度，然后墊實(shí)硅膠至硅膠界面不再下降為止。Chinapharmaceuticaluniversity3.上樣：（1）濕法：用少量溶劑將樣品溶解后，再用膠頭滴管沿著層析柱內(nèi)壁均勻加入。然后用少量溶劑洗滌后，再加入。（2）干法：把待分離的樣品用少量溶劑溶解后，在加入少量硅膠，拌勻后再揮去溶劑。如此得到的粉末再小心加到柱子的頂層。上完樣后，需加入空白硅膠，保持柱床的平整。Chinapharmaceuticaluniversity最好就是展開(kāi)劑，如果展開(kāi)劑的溶解度不好，則可以用一極性較大的溶劑，但必須少量關(guān)于拌樣溶劑：如果洗脫劑是石油醚/乙酸乙酯/丙酮體系，就用石油醚拌；如果洗脫劑是氯仿/醇體系，就用氯仿拌。

Chinapharmaceuticaluniversity4.過(guò)柱和收集:

溶劑系統(tǒng)：根據(jù)TLC選擇，最初的洗脫劑選用樣品的Rf值在0.2左右。極性小的用乙酸乙酯：石油醚系統(tǒng)極性較大的用甲醇：氯仿系統(tǒng)極性大的用甲醇：水：正丁醇：醋酸系統(tǒng)拖尾可以加入少量氨水或冰醋酸Chinapharmaceuticaluniversity收集的例子：10mg上樣量，1g硅膠H，0.5ml收一餾分；1-2g上樣量，50g硅膠（200-300目），20-50ml收一餾分。5.檢測(cè):TLC檢測(cè)：多使用專用顯色劑，也可使用紫外檢測(cè)。紫外的靈敏度一般比顯色劑底1-2個(gè)數(shù)量級(jí)。也可以用HPLC進(jìn)一步的檢測(cè)。●硅膠可進(jìn)行粗分段以及細(xì)分?！翊址帜軌?qū)⒒衔锇礃O性弱→強(qiáng)的流出順序分段●細(xì)分時(shí)，但不適宜極性大化合物的細(xì)分，容易對(duì)性極性過(guò)大的化合物產(chǎn)生死吸附，如酚類，大極性生物堿類。Chinapharmaceuticaluniversity應(yīng)用舉例五味子為木蘭科植物五味子Schisandrachinensis(Turcz.)Baill.或華中五味子SchisandrasphenantheraRehd.etWils.的干燥成熟果實(shí)。前者習(xí)稱北五味子，后者習(xí)稱南五味子。具收斂固澀，益氣生津，補(bǔ)腎寧心的功能。主要有效成分為木脂素類北五味子中提取分離五味子乙素，五味子丙素，五味子酯甲北五味子果實(shí)乙醇熱回流提取三次乙醇提取物減壓回收乙醇浸膏加水混懸，石油醚萃取石油醚部位水層Chinapharmaceuticaluniversity

石油醚部位

上硅膠柱，石油醚-乙酸乙酯梯度洗脫

石油醚-乙酸乙酯=20：1

石油醚-乙酸乙酯=10：1

石油醚-乙酸乙酯=1：1無(wú)色結(jié)晶無(wú)色結(jié)晶無(wú)色結(jié)晶甲醇重結(jié)晶甲醇重結(jié)晶甲醇重結(jié)晶五味子丙素五味子乙素五味子酯甲Chinapharmaceuticaluniversity2.反相硅膠反相硅膠柱填料是在硅膠表面鍵合非極性基團(tuán)的鍵和相。反相柱有C18，C8,C4,C2和苯基柱等。其中C18（Octadecylsilyl，簡(jiǎn)稱ODS）即十八烷基硅烷鍵合硅膠填料，在反相色譜中發(fā)揮著極為重要的作用。Chinapharmaceuticaluniversity作用原理：分配原理：在含水的混合有機(jī)溶劑中，溶質(zhì)在流動(dòng)相中被溶劑化，與吸附在定相表面的烷基官能團(tuán)上的弱極性有機(jī)溶劑分子進(jìn)行置換從而構(gòu)成溶質(zhì)在固定相和流動(dòng)相中的平衡。吸附原理：基于疏溶劑理論，見(jiàn)圖1.溶劑膜2.鍵合相3.化合物極性端4.化合物非極性端使用：使用類似于正相硅膠。裝柱：僅使用濕法上樣：使用洗脫劑溶解濕法上樣洗脫系統(tǒng)：甲醇-水系統(tǒng)Chinapharmaceuticaluniversity●ODS分離時(shí)化合物按極性強(qiáng)→弱的順序流出?！馩DS常用于細(xì)分，適宜分離極性化合物，可對(duì)在硅膠薄層板上分離度不好的樣品的分離?！馩DS也可以用于粗分砍段。二、聚酰胺概述氫鍵吸附原理雙重層析理論聚酰胺的應(yīng)用聚酰胺應(yīng)用實(shí)例Chinapharmaceuticaluniversity1.概述聚酰胺（polyamide，PA）是由酰胺聚合而成的一類高分子物質(zhì)，又叫尼龍、錦綸色譜中常用的聚酰胺有：尼龍-6（己內(nèi)酰胺聚合而成）和尼龍-66（己二酸與己二胺聚合而成）。既親水又親脂，性能較好，水溶性物質(zhì)和脂溶性物質(zhì)均可分離。錦綸11，1010的親水性較差，不能使用含水量高的溶劑系統(tǒng)。Chinapharmaceuticaluniversity概述聚酰胺層析可用于黃酮、酚類、有機(jī)酸、生物堿、萜類、甾體、苷類、糖類、氨基酸衍生物、核苷類等的化合物的分離，尤其是對(duì)黃酮類、酚類、醌類等物質(zhì)的分離遠(yuǎn)比其它方法優(yōu)越。特點(diǎn)：對(duì)黃酮等物質(zhì)的層析是可逆的；分離效果好，可分離極性相近的類似物，其柱層析的樣品容量大，適用于制備分離。Chinapharmaceuticaluniversity氫鍵吸附原理酚、酸的羥基與聚酰胺中羰基形成氫鍵芳香硝基、醌類化合物的硝基或羥基（醌）與聚酰胺中游離氨基形成氫鍵。脫吸附通過(guò)溶劑分子形成新氫鍵取代原有氫鍵而完成。黃酮苷元與苷的分離，用含水溶劑（如甲醇-水）洗脫，苷比苷元先洗脫下來(lái)；而采用非極性溶劑洗脫時(shí)，結(jié)果恰好相反。Chinapharmaceuticaluniversity2.雙重層析原理聚酰胺既有非極性的脂肪鍵，又有極性的酰胺鍵。當(dāng)用含水極性溶劑作流動(dòng)相時(shí)，聚酰胺作為非極性固定相，其色譜行為類似反相分配色譜，所以苷比苷元容易洗脫。當(dāng)用非極性氯仿-甲醇作為流動(dòng)相時(shí)，聚酰胺則作為極性固定相，其色譜行為類似正相分配色譜，所以苷元比其苷容易洗脫。萜類、甾體、生物堿及糖類等難與其形成氫鍵的化合物的分離Chinapharmaceuticaluniversity3.聚酰胺的應(yīng)用聚酰胺柱色譜裝柱：是將顆粒狀聚酰胺混懸于水中濕法裝柱，在用非極性溶劑系統(tǒng)時(shí)，則用組分中低極性的溶劑裝柱。上樣：一般每100ml聚酰胺可上樣1.5-2.5g。樣品先用洗脫溶劑溶解，濃度20%-30%。若不溶解于洗脫劑，可選用易揮發(fā)的有機(jī)溶劑溶解，拌入干淀粉中后將溶劑減壓蒸去，濕法裝入柱頂。洗脫：洗脫劑常采用水，遞增乙醇至濃乙醇液或氯仿、氯仿-甲醇，遞增甲醇至純甲醇洗脫。若仍有物質(zhì)未洗脫下來(lái)，可采用稀氨水或稀甲酸胺溶液洗脫，分段收集。Chinapharmaceuticaluniversity再生：使用過(guò)的聚酰胺一般用5%NaOH洗滌，然后用水洗。再用10%HOAc洗滌，最后用蒸餾水洗至中性即可。若在各種溶劑系統(tǒng)中加入少量酸或堿，可克服色譜中拖尾現(xiàn)象，使斑點(diǎn)清晰。Chinapharmaceuticaluniversity常用展開(kāi)系統(tǒng)化合物類別聚酰胺薄膜層析常用展開(kāi)劑系統(tǒng)黃酮苷元氯仿-甲醇(94:6/96:4);苯-甲醇-丁酮(90:6:4/84:8:8)氯仿-甲醇-丁酮(12:2:1);氯仿-甲醇-甲酸(60:38:2)氯仿-甲醇-吡啶(70:22:8);氯仿-甲醇-苯酚(64:28:8)黃酮苷甲醇-乙酸-水(90:5:5);甲醇-水(4:1);乙醇-水(1:1)丙酮-水(1:1);異丙醇-水(3:2);30%-60%乙酸正丁醇-乙醇-水(1:4:5)；乙酸乙酯-95%乙醇(6:4)氯仿-甲醇(7:3);酚類丙酮-水(1:1);苯-甲醇-乙酸(45:8:4)環(huán)己烷-乙酸(93:7);10%乙酸醌類10%乙酸；正己烷-苯-乙酸(4:1:0.5)石油醚-苯-乙酸(10:10:5)糖類乙酸乙酯-甲醇(8:1)正丁醇-丙酮-乙酸-乙酸(6:2:1:1)生物堿環(huán)己烷-乙酸乙酯-正丙醇-二甲基胺(30:2.5:0.9:0.1)水-乙醇-二甲基胺(88:12:0.1)甾體、萜類己烷-丙酮(4:1);氯仿-丙酮(4:1)甾體苷甲醇-水-甲酸(60:35:5)乙酸乙酯-甲醇-水-甲酸(50:20:25:5)氨基酸衍生物苯-乙酸(8:2/9:1);50%乙酸；甲酸-水(1.5:100/1:1)乙酸乙酯-甲醇-乙酸(20:1:1)；氯仿-乙酸(8:2)二甲基甲酰胺-乙酸-水-乙醇(5:10:30:20)

0.05mol/L磷酸鈉-乙醇(3:1)影響吸附的因素：分子中羥基的數(shù)目、位置溶劑與化合物或與聚酰胺之間形成氫鍵締合的能力的大小。如溶劑分子與聚酰胺或化合物形成氫鍵締合能力越強(qiáng)，則聚酰胺對(duì)化合物的吸附作用將減弱。Chinapharmaceuticaluniversity聚酰胺應(yīng)用中的問(wèn)題（1）沖洗速度慢。預(yù)先用篩篩去細(xì)粉或與硅藻土（1：2）混合物裝柱，以及加壓或減壓沖洗等法予以克服。（2）小分子量的聚酰胺等雜質(zhì)混入。用5％甲醇或10%鹽酸預(yù)先洗滌除去。（3）粒度不均勻。裝柱前過(guò)篩。Chinapharmaceuticaluniversity3.聚酰胺應(yīng)用實(shí)例照山白葉70%乙醇回流提取，加等量水沉淀過(guò)夜抽濾，減壓濃縮①100ml水分散用②聚酰胺柱120cm×10cm，濕法裝柱③水洗至無(wú)梫木毒素反應(yīng)④乙醇-水梯度洗脫10%和30%乙醇部分甲醇重結(jié)晶浸膏127.5g50%和95%乙醇部分化合物Ⅰ和Ⅱ硅膠柱，氯仿-甲醇梯度洗脫制備液相，C18柱，乙腈-1%醋酸梯度洗脫化合物Ⅳ母液蒸干，硅膠柱，氯仿-甲醇梯度洗脫制備液相，C18柱，乙腈-1%醋酸梯度洗脫化合物Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ、ⅥChinapharmaceuticaluniversity金絲桃苷楊梅苷槲皮苷槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖苷山奈酚槲皮素三、MCI-GEL系列MCIGEL分離材料概述MCI-GEL反相填料的特點(diǎn)MCI-GEL反相填料的使用MCI-GEL反相填料應(yīng)用舉例Chinapharmaceuticaluniversity1.概述MCIGEL系列精細(xì)分離填料是在三菱化學(xué)Diaion和Sepabeads大孔吸附樹(shù)脂基礎(chǔ)上設(shè)計(jì)的，是聚合物基質(zhì)的分離填料。主要包括以聚苯乙烯基苯為基體和以甲基丙烯酸酯為基體的各種系列?？捎糜陔x子交換色譜、尺寸排阻色譜、反相色譜、以及疏水作用色譜等。MCI-GEL有從4微米到300微米粒徑分布的多種產(chǎn)品。Chinapharmaceuticaluniversity分離機(jī)制填料應(yīng)用離子交換樹(shù)脂柱MCIGELCK/CA和CDR10系列糖、有機(jī)酸、氨基酸和核酸MCIProtex系列（包括ProtExDEAE和ProtEx-SP）蛋白質(zhì)尺寸排阻MCIGELCQP系列蛋白質(zhì)、水溶性聚合物、生物聚合物MCIGelCKO寡糖MCIGelCQP多肽疏水作用色譜柱MCIGelCQH蛋白質(zhì)和生物聚合物反相色譜柱MCIGELCHP/CHPMG天然產(chǎn)物、蛋白質(zhì)和生物聚合物配體交換柱用于光學(xué)拆分MCIGELCRS-氨基酸和-羥基羧酸MCI-GEL反相填料MCIGEL?

反相填料所用的聚合物主要包括聚苯乙烯和聚甲基丙烯酸脂兩種基質(zhì)。Chinapharmaceuticaluniversity2.

MCI-GEL反相填料特點(diǎn)吸附量高、顆粒均勻、機(jī)械強(qiáng)度好、穩(wěn)定性好(pH1-14)、不易破碎、殘留物少、預(yù)處理方便具有較為均一的疏水表面，可在等度或梯度條件下進(jìn)行常規(guī)反相分離比反相ODS填料便宜，無(wú)硅羥基裸露相關(guān)問(wèn)題自行裝柱方法簡(jiǎn)單、重復(fù)性高高選擇性、無(wú)特異性吸附。水溶性和非水溶性成分的分離均可使用。Chinapharmaceuticaluniversity3.MCI-GEL反相填料的使用1)

將色譜填料浸泡在甲醇，乙醇或丙酮中。2)

充分?jǐn)嚢璩蓜驖{裝柱，用選定的溶劑沖洗壓縮柱床層。3)

用多倍柱體積的上述溶劑沖洗柱，直至填料中的交聯(lián)劑洗脫干凈。4)

用選定的洗脫液平衡色譜柱，備用。5）流動(dòng)相選擇：適用于所有乙腈、甲醇、乙醇、丙酮等以及所有酸、堿、鹽配比的水溶液。ChinapharmaceuticaluniversityMCI的再生：一般可用甲醇再生，若柱子上保留較多，可用乙腈、丙酮等洗脫再生，特殊情況下可以考慮用1mol/L的鹽酸或1mol/L的NaOH溶液洗脫，最后用水沖洗到中性即可。Chinapharmaceuticaluniversity使用經(jīng)驗(yàn)在水較多的情況下，MCI顆?？赡軙?huì)漂浮，故建議裝柱時(shí)最好用有機(jī)溶劑。

層析流動(dòng)相選擇可以將RP-18或反相TLC的條件中有機(jī)相濃度提高10%-15%即可。由于大部分的葉綠素具有較強(qiáng)的疏水性，MCIGEL裝填柱在脫除葉綠素等色素方面有非常好的效果。樣品的水溶性差，盡可能使含醇量高的洗脫液ChinapharmaceuticaluniversityMCIGEL填裝柱的處理雖然較RP-18容易的多，但比起大孔樹(shù)脂如DA-101來(lái)說(shuō)要麻煩一些。所以如果粗提物能夠先用大孔樹(shù)脂等顆粒較大的材料脫除葉綠素等水溶性較小的各類物質(zhì)（比如直接用85％的甲醇水溶液洗脫，脫除色素以及氧化度很小的三萜或甾體，合并洗液并濃縮后再上MCIGEL填裝柱進(jìn)行分離），分離效果將會(huì)好的多。Chinapharmaceuticaluniversity烏藥莖粗粉(8.0kg)

①60%丙酮-水冷浸②減壓濃縮混懸液石油醚(脫脂)

水層溶液冷凍干燥凍干粉①乙醇溶解②SephadexLH-20

用乙醇洗脫

組分A組分B組分C組分D

①M(fèi)CI-gelCHP20P①M(fèi)CI-gelCHP20P①M(fèi)CI-gelCHP20P(甲醇-水