NY/T 679-2003豬繁殖與呼吸綜合癥免疫酶試驗(yàn)方法

犐犆犛１１．２２０

犅４１

中華人民共和國(guó)農(nóng)業(yè)行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)

犖犢／犜６７９—２００３

豬繁殖與呼吸綜合癥免疫酶試驗(yàn)方法

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２００３０７３０發(fā)布２００３１００１實(shí)施

中華人民共和國(guó)農(nóng)業(yè)部發(fā)布

書

犖犢／犜６７９—２００３

前言

本標(biāo)準(zhǔn)的附錄Ａ為規(guī)范性附錄。

本標(biāo)準(zhǔn)由農(nóng)業(yè)部畜牧獸醫(yī)局提出并歸口。

本標(biāo)準(zhǔn)起草單位：農(nóng)業(yè)部獸醫(yī)診斷中心。

本標(biāo)準(zhǔn)主要起草人：王宏偉、王傳彬、陳西釗、田克恭。

Ⅰ

書

犖犢／犜６７９—２００３

豬繁殖與呼吸綜合癥免疫酶試驗(yàn)方法

１范圍

本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了豬繁殖與呼吸綜合癥（ＰＲＲＳ）免疫酶試驗(yàn)和免疫酶組織化學(xué)方法。

本標(biāo)準(zhǔn)適用于檢測(cè)豬血清中的豬繁殖與呼吸綜合癥病毒（ＰＲＲＳＶ）抗體和組織中的ＰＲＲＳＶ抗原。

２免疫酶試驗(yàn)

２．１材料準(zhǔn)備

２．１．１試劑

２．１．１．１磷酸鹽緩沖液（ＰＢＳ）：配制見第Ａ．１章。

２．１．１．２抗原涂片的制備：ＰＲＲＳＶ接種于生長(zhǎng)至７０％～８０％單層的Ｍａｒｃ１４５細(xì)胞。接種后３ｄ～

４ｄ，病變達(dá)５０％～７５％時(shí)，用胰蛋白酶消化分散感染的細(xì)胞單層，ＰＢＳ洗滌三次后，稀釋至１×１０６個(gè)細(xì)

胞／ｍＬ。取印有１０個(gè)～４０個(gè)小孔的室玻片，每孔滴加１０μＬ。室溫自然干燥后，冷丙酮（４℃）固定

１０ｍｉｎ。密封包裝，置－２０℃?zhèn)溆谩?/p>

２．１．１．３標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性血清：ＰＲＲＳＶ試驗(yàn)感染豬制備的血清。

２．１．１．４標(biāo)準(zhǔn)陰性血清：無(wú)ＰＲＲＳＶ感染、未經(jīng)免疫的豬血清。

２．１．１．５酶結(jié)合物：辣根過(guò)氧化物酶（ＨＲＰ）標(biāo)記的葡萄球菌Ａ蛋白（ＳＰＡ）。

２．１．１．６底物溶液：配制見第Ａ．２章。

２．１．２器材

ａ）普通光學(xué)顯微鏡；

ｂ）印有１０個(gè)～４０個(gè)小孔的室玻片；

ｃ）微量加樣器，容量５μＬ～５０μＬ；

ｄ）３７℃恒溫培養(yǎng)箱或水浴箱。

２．１．３樣品

采集被檢豬血液，分離血清。血清應(yīng)新鮮、透明、不溶血、無(wú)污染，密裝于滅菌小瓶?jī)?nèi)，４℃或－３０℃

保存或立即送檢。試驗(yàn)前將被檢血清統(tǒng)一編號(hào)，并用ＰＢＳ作１０倍稀釋。

２．２操作方法

２．２．１取出抗原涂片，室溫干燥后，滴加１０倍稀釋的待檢血清和標(biāo)準(zhǔn)陰性血清、標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性血清，每份血

清加兩個(gè)病毒細(xì)胞孔和一個(gè)正常細(xì)胞孔，置濕盒內(nèi)，３７℃３０ｍｉｎ。

２．２．２ＰＢＳ漂洗三次，每次５ｍｉｎ，室溫干燥。

２．２．３滴加適當(dāng)稀釋的酶結(jié)合物，置濕盒內(nèi)，３７℃３０ｍｉｎ。

２．２．４ＰＢＳ漂洗三次，每次５ｍｉｎ。

２．２．５將室玻片放入底物溶液中，室溫下顯色５ｍｉｎ～１０ｍｉｎ。ＰＢＳ漂洗兩次，再用蒸餾水漂洗—次。

２．２．６吹干后，在普通光學(xué)顯微鏡下觀察，判定結(jié)果。

２．３結(jié)果判定

２．３．１在陰性血清對(duì)照、陽(yáng)性血清對(duì)照成立的情況下：即陰性血清與正常細(xì)胞和病毒感染細(xì)胞反應(yīng)均

無(wú)色；陽(yáng)性血清與正常細(xì)胞反應(yīng)無(wú)色，與病毒感染細(xì)胞反應(yīng)呈棕黃色至棕褐色，即可判定結(jié)果；否則應(yīng)

重試。

２．３．２待檢血清與正常細(xì)胞和病毒感染細(xì)胞反應(yīng)均呈無(wú)色，即可判為