遺傳性疾病的試驗(yàn)診斷

遺傳性疾病的試驗(yàn)診斷遺傳性疾病的分類(lèi)

染色體?。涸谏臣?xì)胞發(fā)生和受精卵早期發(fā)育過(guò)程中發(fā)生差錯(cuò)，產(chǎn)生整條染色體或染色體節(jié)段超過(guò)或少于二倍體數(shù)，表現(xiàn)出先天發(fā)育異常單基因?。浩鹨蛴谥虏』?，在一對(duì)同源染色體上可能其中一條帶有突變基因，也可能同源染色體上的對(duì)應(yīng)位點(diǎn)都是突變基因。有特征性家系傳遞格局遺傳性疾病的分類(lèi)多基因?。阂喾Q(chēng)多因子病，起因于遺傳素質(zhì)和環(huán)境因素，包括一些先天性發(fā)育異常和常見(jiàn)病線粒體遺傳?。壕€粒體基因突變可導(dǎo)致線粒體遺傳病，隨線粒體傳遞，呈細(xì)胞質(zhì)遺傳體細(xì)胞遺傳?。喊┠[起因于體細(xì)胞遺傳物質(zhì)的突變，可表現(xiàn)出家族性癌腫遺傳易感性。有些先天畸形亦屬此類(lèi)。單基因遺傳病的分類(lèi)常染色體連鎖遺傳性疾病：致病基因位于常染色體性染色體連鎖遺傳性疾?。褐虏』蛭挥谛匀旧w常染色體連鎖遺傳性疾病常染色體連鎖隱性遺傳位于一對(duì)常染色體上的兩個(gè)等位基因均發(fā)生突變才能產(chǎn)生臨床癥狀，此時(shí)所導(dǎo)致的相應(yīng)疾病稱(chēng)為常染色體連鎖隱性遺傳性疾病同一對(duì)染色體中只有一個(gè)等位基因發(fā)生突變的個(gè)體稱(chēng)為雜合子，二個(gè)等位基因均發(fā)生突變的個(gè)體稱(chēng)為純合子囊性纖維變：常染色體連鎖隱性遺傳(7q31)常染色體連鎖遺傳性疾病常染色體連鎖顯性遺傳位于一對(duì)常染色體上的二個(gè)等位基因之一發(fā)生突變即產(chǎn)生臨床癥狀，所導(dǎo)致的相應(yīng)疾病稱(chēng)為常染色體連鎖顯性遺傳性疾病特點(diǎn)：家系中患者數(shù)目較多，大多情況下每一代均有患者Huntington舞蹈癥：常染色體顯性遺傳(4p16.3)性染色體連鎖遺傳性疾病X染色體連鎖遺傳大多為隱性遺傳(如甲型血友病、杜氏肌營(yíng)養(yǎng)不良癥)顯性遺傳非常罕見(jiàn)Y染色體連鎖遺傳產(chǎn)前篩查（診斷）在胎兒出生前對(duì)其出生缺陷（包括先天異常和宮內(nèi)感染）進(jìn)行檢查產(chǎn)前篩查包括實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)、影像學(xué)檢查等圍產(chǎn)醫(yī)學(xué)產(chǎn)前篩查的實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)染色體病的實(shí)驗(yàn)室篩查胎兒宮內(nèi)感染的實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)遺傳性疾病的基因檢測(cè)染色體病的實(shí)驗(yàn)室篩查孕早期篩查（孕7～11周）孕中期篩查（孕15～20周）產(chǎn)前篩查只是對(duì)胎兒罹患某一先天性或遺傳性疾病的風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估而非確診中國(guó)出生缺陷現(xiàn)狀中國(guó)每年約有100萬(wàn)缺陷兒出生，其中只有30%可以治愈或糾正全國(guó)累計(jì)近3000萬(wàn)個(gè)家庭曾生育過(guò)出生缺陷和先天殘疾兒，占全國(guó)家庭總數(shù)1/10中國(guó)每年出生約3-5萬(wàn)唐氏兒，10萬(wàn)神經(jīng)管缺陷患兒造成沉重的社會(huì)負(fù)擔(dān)和精神壓力此項(xiàng)支出每年達(dá)到300億每個(gè)唐氏患兒僅醫(yī)藥費(fèi)支出就達(dá)25萬(wàn)1個(gè)患兒平均累及7個(gè)成人關(guān)鍵在于預(yù)防三級(jí)預(yù)防可大幅度減少出生缺陷兒的發(fā)生1級(jí)：孕前保健2級(jí)：孕期保健(產(chǎn)前篩查與診斷)3級(jí)：新生兒篩查(早發(fā)現(xiàn)早干預(yù))篩查指征危害嚴(yán)重發(fā)病率較高，人群分布明確篩查陽(yáng)性有進(jìn)一步明確診斷方法篩查方法較簡(jiǎn)易篩查費(fèi)用明顯低于治療費(fèi)用孕期保健篩查的主要疾病21-三體綜合癥，發(fā)病率為1/700~1/80018-三體綜合癥，發(fā)病率1/6000~1/8000開(kāi)放性神經(jīng)管缺陷，發(fā)病率1/1000~1/2000新生兒篩查的主要疾病先天性甲狀腺功能低下苯丙酮尿癥先天性腎上腺皮質(zhì)增生癥葡萄糖-6-磷酸脫氫酶缺乏采集一滴新生兒足跟末梢靜脈血于濾紙上，干燥后運(yùn)輸至篩查中心統(tǒng)一檢測(cè)。血清學(xué)篩查的基本概念安全性抽取孕婦2ml靜脈血，通過(guò)測(cè)定血清中的特定標(biāo)志物，間接地判斷胎兒患遺傳缺陷疾病的風(fēng)險(xiǎn)度非創(chuàng)傷性篩查對(duì)象原則上為孕9-20+6周的所有孕婦血清學(xué)篩查的基本概念孕婦自愿孕婦接受產(chǎn)前篩查遵循自愿原則，明確產(chǎn)前篩查的內(nèi)容、意義和相應(yīng)風(fēng)險(xiǎn)，并簽署產(chǎn)血清學(xué)前篩查知情同意書(shū)篩查與確診篩查(高危)病例，需進(jìn)一步做絨毛膜(孕早期)或羊水穿刺(孕中期)做染色體核型分析進(jìn)行確診。

年齡曾是唐氏綜合征產(chǎn)前篩查的指標(biāo)

產(chǎn)前篩查的血清標(biāo)志物1984年首次報(bào)道懷有染色體異常特別是DS胎兒的孕婦血清AFP水平偏低，建議將AFP作為35歲以下孕婦胎兒染色體異常的篩查指標(biāo)1987年報(bào)道懷有DS胎兒的母血中人絨毛膜促性腺激素（HCG）的水平是正常孕婦的2倍；非結(jié)合雌三醇（uE3）的水平比正常低25%，提示可以作為另兩個(gè)篩查指標(biāo)1991年報(bào)道妊娠相關(guān)血漿蛋白A（PAPP-A）與DS有關(guān)1996年，抑制素A(inhibinA)成為第四個(gè)血清檢測(cè)指標(biāo)以上單個(gè)指標(biāo)進(jìn)行唐氏綜合征的篩查，檢出率均太低(30%左右)將AFP、HCG、uE3和InhibinA四項(xiàng)指標(biāo)聯(lián)合檢測(cè)稱(chēng)為四聯(lián)篩查對(duì)14-20周的孕婦進(jìn)行篩查，檢出率為81%，假陽(yáng)性率約5%目前國(guó)內(nèi)孕中期血清學(xué)產(chǎn)前篩查模式(Second-trimester

maternalserumscreening)

AFP+freeβHCG/HCGAFP+freeβHCG/HCG+uE3AFP+freeβHCG/HCG+uE3+InhA全球篩查模式模式孕周項(xiàng)目?jī)?yōu)勢(shì)缺點(diǎn)孕早期聯(lián)合篩查(1stTrimesterCombined)9~13＋6NT+PAPP-A+fβhCG/βhCG時(shí)間早：篩查在14周前結(jié)束具有超聲影像支持盡可能早做出決策得到證實(shí)的檢出率：90％DR/5%FPR(1TCombined)必須具備開(kāi)展NT的條件和技術(shù)25％孕婦錯(cuò)過(guò)了早期篩查時(shí)間,中國(guó)尤甚必須具備CVS的條件和技術(shù)孕中期篩查(2ndTrimester)14-20+64聯(lián)：AFP，hCG(Total或Free)，uE3，Inhibin-A已得到廣泛應(yīng)用，成熟模式所有孕婦都可以進(jìn)行中期篩查檢出率高:81%DR/5%FPR決策時(shí)間晚無(wú)超聲監(jiān)測(cè)終止妊娠不夠安全血清學(xué)整合篩查(Serumintegrated)(孕早期不出報(bào)告)9~13＋6&14-20+6孕早期：PAPP-A孕中期：4聯(lián)僅生化測(cè)試，簡(jiǎn)單易行無(wú)需NT，DR/FPR與孕早期篩查類(lèi)似可據(jù)此建立孕早期篩查項(xiàng)目檢出率高:86%DR/5%FPR決策時(shí)間晚無(wú)超聲監(jiān)測(cè)不能提供完整的孕早期數(shù)據(jù)整合篩查(Integrated)(孕早期不出報(bào)告)9~13＋6&14-20+6孕早期：NT&PAPP-A孕中期：4聯(lián)降低FPR(2%)/90%DR－減少羊水穿刺率建立孕早期篩查項(xiàng)目決策時(shí)間晚保留風(fēng)險(xiǎn)較高的結(jié)果,如NT>3mm終止妊娠不夠安全不能提供完整的孕早期數(shù)據(jù)序貫篩查(Stepwisesequential)(僅高危病例在孕早期出報(bào)告)9~13＋6&14-20+6孕早期：NT+PAPP-A+fβhCG/βhCG孕中期：4聯(lián)建立孕早期篩查項(xiàng)目早期高風(fēng)險(xiǎn)結(jié)果進(jìn)行診斷性檢查同樣的DR(90%)，F(xiàn)PR降低(3.7%)只有很少部分(1%)孕婦在孕早期結(jié)束篩查終止妊娠時(shí)間晚，不安全遺傳咨詢(xún)難度高酌情篩查(Contingent)(僅灰色區(qū)域風(fēng)險(xiǎn)孕婦進(jìn)行孕中期篩查)9~13＋6&14-20+6孕早期：NT+PAPP-A+fβhCG/βhCG孕中期：4聯(lián)可建立完整的孕早期篩查項(xiàng)目80％以上孕婦在孕早期結(jié)束篩查對(duì)高危組，中間組和低危組的界定可能導(dǎo)致中間組孕婦焦慮：須等待4周我國(guó)開(kāi)展篩查的現(xiàn)狀及可選方案我國(guó)開(kāi)展現(xiàn)狀：對(duì)孕早期篩查的重要意義認(rèn)識(shí)不足，孕中期篩查仍為主流孕早期篩查技術(shù)不成熟，尤其規(guī)范NT檢測(cè)有相當(dāng)難度大多數(shù)孕婦孕中期才參加產(chǎn)前保健大多數(shù)中心僅限于傳統(tǒng)的中期兩項(xiàng)篩查產(chǎn)篩質(zhì)量管理意識(shí)有待加強(qiáng)針對(duì)我國(guó)國(guó)情推薦參考方案：積極宣傳孕早期篩查的重要意義，產(chǎn)篩未來(lái)發(fā)展趨勢(shì)在不具備規(guī)范NT檢測(cè)情況下，建議進(jìn)行孕中期四聯(lián)篩查，使其成為國(guó)內(nèi)產(chǎn)篩的基礎(chǔ)性工作有條件的地區(qū)開(kāi)展酌情、序貫或血清整合等多種模式篩查，為孕婦提供更多選擇胎兒宮內(nèi)感染的實(shí)驗(yàn)室檢查T(mén)ORCH綜合征的孕前和產(chǎn)前檢測(cè)TORCH綜合征是病原微生物感染引起胎兒異常的一組疾病弓形蟲(chóng)（toxoplasma,TOXO）風(fēng)疹病毒（rubellavirus,RV）巨細(xì)胞病毒（humancytomegalovirus,CMV）單純皰疹病毒（herpessimplevirus,HSV）其他病原微生物（other,O）孕婦為易感人群，感染途徑與一般人相同可發(fā)生在妊娠各期，宮內(nèi)感染可造成嚴(yán)重后果感染后除免疫缺陷者外，機(jī)體均產(chǎn)生特異性抗體。采集孕婦外周血檢測(cè)相關(guān)病原體的特異性抗體IgG和IgM，以判斷孕婦是否曾經(jīng)或正在感染某一病原體抗體檢測(cè)：免疫學(xué)方法血清學(xué)檢測(cè)的局限性抗體產(chǎn)生時(shí)間判斷胎兒感染須謹(jǐn)慎孕前篩查更為重要免疫缺陷者可能檢測(cè)不到相應(yīng)抗體單基因遺傳病的基因診斷單基因遺傳病中常見(jiàn)的分子異常遺傳性疾病的產(chǎn)生是由于一個(gè)（或數(shù)個(gè)）基因發(fā)生異常導(dǎo)致這些基因所載有的遺傳信息受到改變，而發(fā)病是通過(guò)遺傳物質(zhì)的表達(dá)產(chǎn)物——蛋白質(zhì)（或酶）的表現(xiàn)異常所致。基因突變主要包括點(diǎn)突變、片段性突變和動(dòng)態(tài)性突變。點(diǎn)突變(pointmutation)包括錯(cuò)義突變、無(wú)義突變、移碼突變各種點(diǎn)突變所造成的后果：蛋白質(zhì)分子量改變蛋白質(zhì)合成量下降無(wú)蛋白質(zhì)合成片段性突變(fragememtalmutation)核苷酸的丟失和增多缺失：基因中鹼基（遺傳物質(zhì)）的丟失插入：外來(lái)基因片段插入某一基因序列中倍增：基因內(nèi)部某一段序列發(fā)生重復(fù)基因重排：基因組中原來(lái)不在一起的基因由于某些原因重新排列動(dòng)態(tài)性突變(dynamicmutation)

以三核苷酸為單位的重復(fù)序列在傳遞過(guò)程中不穩(wěn)定，會(huì)發(fā)生擴(kuò)展，即子代的重復(fù)次數(shù)往往較親代大為增加，因此又稱(chēng)動(dòng)態(tài)性突變。脆性X綜合征：CGG重復(fù)少年脊髓型共濟(jì)失調(diào)：GAA重復(fù)亨廷頓?。篊AG重復(fù)X染色體（）的脆性位點(diǎn)脆性X綜合征是遺傳性智力缺陷最常見(jiàn)的一種。致病基因FMR-1的5’端有CGG三核苷酸重復(fù)區(qū)。普通男性群體中的患病率為1/4000。普通女性群體中的患病率為1/6000?；颊咧橇Φ拖隆⒄Z(yǔ)言障礙、行為異常、呈特殊面容。正常個(gè)體：CGG重復(fù)次數(shù)6~52次，中國(guó)人群以(CGG)28為多見(jiàn)。前突變(premutation)：(CGG)

53~230為攜帶者，雖表型正常，但在傳遞過(guò)程中易發(fā)生進(jìn)一步擴(kuò)展，使后代的CGG重復(fù)次數(shù)大大增加，并有異常表型。全突變：(CGG)≥230時(shí)，100%的男性表現(xiàn)為典型的脆性X綜合征,53%的女性表現(xiàn)為程度不同的智力低下。遺傳性疾病基因診斷的策略（一）直接診斷策略

基因診斷的直接策略是通過(guò)各種分子生物學(xué)技術(shù)檢測(cè)基因的遺傳缺陷，因此直接診斷的前提是被檢測(cè)基因的正常序列和結(jié)構(gòu)必須被闡明。直接診斷由于是直接揭示遺傳缺陷，因而比較可靠。

直接診斷常用技術(shù)Southern印跡技術(shù)將基因組DNA用限制性?xún)?nèi)切酶水解，經(jīng)凝膠電泳分離用堿處理使凝膠中的DNA變性為單鏈，轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜或尼龍膜上用標(biāo)記的特異性探針與變性單鏈雜交，可使特異條帶顯影實(shí)驗(yàn)結(jié)果為限制性長(zhǎng)度片段多態(tài)性分析（restrictionfragmentlengthpolymorphism,RFLP）直接診斷常用技術(shù)聚合酶鏈反應(yīng)（polymerasechainreaction,PCR）在突變點(diǎn)二側(cè)設(shè)計(jì)引物，經(jīng)擴(kuò)增后可得含有突變點(diǎn)的擴(kuò)增產(chǎn)物以突變篩查技術(shù)找出突變點(diǎn)SSCP、DGGEMeltingcurveanalysisDNAsequencing

DMD的基因檢測(cè)Duchennemusculardystrophy(DMD)是一種高發(fā)病率、高致殘、高致死的X連鎖的遺傳性疾病，平均每3500個(gè)活產(chǎn)男嬰中即有一個(gè)患者DMD基因的全長(zhǎng)為250kb，有79個(gè)外顯子DMD的最主要遺傳缺陷是外顯子缺失，約占突變的60%~70%用多重PCR技術(shù)對(duì)外顯子進(jìn)行篩查DMD基因外顯子的檢測(cè)（二）間接診斷策略

間接診斷是在家系中進(jìn)行連鎖分析，通過(guò)分析可確定個(gè)體來(lái)自雙親的同源染色體中的哪一條為致病染色體（與致病基因連鎖），從而判斷該個(gè)體是否帶有致病基因間接診斷不是尋找DNA的遺傳缺陷，而是通過(guò)分析DNA的遺傳標(biāo)志的多態(tài)性估計(jì)被檢者患病的可能性遺傳標(biāo)志及其多態(tài)性單拷貝序列在基因組中僅出現(xiàn)一次或少數(shù)幾次，大多數(shù)基因(50%~80%)在單倍體中都為單拷貝重復(fù)序列真核生物染色體DNA中存在許多不同程度的重復(fù)序列，按照孟德?tīng)栠z傳定律傳遞大多存在于基因的非編碼區(qū)根據(jù)DNA序列重復(fù)出現(xiàn)頻率的不同而分為不同類(lèi)型中度重復(fù)序列短分散片段(shortinterspersedsegments,SINEs)平均長(zhǎng)度300bp，拷貝數(shù)可達(dá)10萬(wàn)左右長(zhǎng)分散片段(longinterspersedsegments,LINEs)平均長(zhǎng)度3500~5000bp，拷貝數(shù)達(dá)1萬(wàn)左右在人類(lèi)基因組中約占12%中度重復(fù)序列大多數(shù)不編碼蛋白質(zhì),與單拷貝基因間隔排列有些是編碼蛋白質(zhì)或RNA的結(jié)構(gòu)基因（HLA、rRNA、tRNA、組蛋白、免疫球蛋白基因）可存在于結(jié)構(gòu)基因之間、基因簇之中、內(nèi)含子內(nèi)部高度重復(fù)序列存在于基因組的間隔區(qū)和基因的內(nèi)含子等非編碼區(qū)重復(fù)頻率可高達(dá)106以上，不轉(zhuǎn)錄具高度多態(tài)性，成為有效的遺傳標(biāo)志，已廣泛用于基因定位和基因診斷小衛(wèi)星序列也稱(chēng)數(shù)量可變的串聯(lián)重復(fù)序列(VariableNumberofTandemRepeat,VNTR)以6-70bp為單位，可重復(fù)數(shù)次至數(shù)十次，以串聯(lián)形式排列微衛(wèi)星序列(microsatellite)又稱(chēng)短串聯(lián)重復(fù)序列(STR)以2-6bp為單位，重復(fù)次數(shù)可達(dá)幾十次在基因組中出現(xiàn)的數(shù)目和頻率不同，分布廣泛，具高度多態(tài)性

堿基組成不同于其他部分，用密度梯度離心可將其與主體DNA分開(kāi)重復(fù)序列的檢測(cè)PCR技術(shù)在重復(fù)序列二側(cè)設(shè)定引物，經(jīng)PCR擴(kuò)增用凝膠電泳分離擴(kuò)增產(chǎn)物根據(jù)產(chǎn)物片段大小即可決定重復(fù)序列的重復(fù)次數(shù)遺傳咨詢(xún)和產(chǎn)前基因診斷遺傳咨詢(xún)明確診斷先證者，確定引起疾病的分子異常了解本病傳遞至下代的風(fēng)險(xiǎn)率判斷胎兒是否患病遺傳咨詢(xún)和產(chǎn)前基因診斷產(chǎn)前基因診斷羊水細(xì)胞（16~20周）絨毛膜細(xì)胞（8~12周）非創(chuàng)傷性取樣母體外周血中胎兒游離DNA遺傳咨詢(xún)戰(zhàn)略路線（以DMD為例）MD是否由Dystrophin缺陷所致?是。孕婦是否攜帶者？是?；蚩赡苁?。胎兒性別？男孩。分子生物學(xué)研究不是。尋找引起本病的原因不是。不進(jìn)行產(chǎn)前基因診斷，但應(yīng)研究家系中其他有風(fēng)險(xiǎn)者女孩。不進(jìn)行分子生物學(xué)研究C50:C49:C45:C44:Cjp:11223C50:C49:C45:C44:Cjp:1221221313C50:C49:C45:C44:Cjp:2112121313C50:C49:C45:C44:Cjp:2112121313C50:C49:C45:C44:Cjp:2112112212C50:C49:C45:C44:Cjp:12212C50:C49:C45:C44:Cjp:21313C50:C49:C45:C44:Cjp:1122312212C50:C49:C45:C44:Cjp:21313C50:C49:C45:C44:Cjp:213131234567891011121314151617181920212223DMD家系分析125.82.83.40.9NNN4.84.85552.83.44.5NNNN4.84.855551234血友病Ａ家系分析間接診斷的不確定性遺傳標(biāo)志所帶的信息性有限（多態(tài)性程度不高）新突變基因重組（若遺傳標(biāo)志離致病基因的遺傳距離為5cM,此時(shí)基因重組的可能性為5%）家系成員不完整單基因病遺傳缺陷的實(shí)驗(yàn)診斷

肢帶型肌營(yíng)養(yǎng)不良(LGMD2)是一類(lèi)常染色體連鎖隱性遺傳病，已有LGMD2A~2H8種類(lèi)型。由于遺傳學(xué)和臨床表現(xiàn)具高度異質(zhì)性，臨床診斷和分類(lèi)十分困難家系資料致病基因的定位

用已報(bào)道的LGMD2A~2H8個(gè)基因所在位點(diǎn)附近共14個(gè)STR標(biāo)記對(duì)家系成員DNA樣本進(jìn)行連鎖分析，尋找與該家系連鎖的致病基因

連鎖基因標(biāo)志位點(diǎn)基因位置LGMD2AD15S99415q15.1-15.3LGMD2AD15S778LGMD2AD15S779LGMD2BD2S3372p13LGMD