生物芯片與高通量測序技術(shù)

生物芯片與高通量測序技術(shù)HonglinZhu2021-06-04基因組學(xué)技術(shù)開展時間表生物芯片是傳統(tǒng)點雜交技術(shù)的高通量革命！是把大量序列探針集成在同一個基片上,經(jīng)過處理和標(biāo)記的假設(shè)干靶核苷酸序列與芯片特定位點上的探針雜交,通過檢測雜交信號,對生物細(xì)胞或組織中大量的基因信息進(jìn)行分析高通量測序是傳統(tǒng)sanger技術(shù)的高通量革命！一次對幾十萬到幾百萬條DNA分子進(jìn)行序列測定,使得對一個物種的轉(zhuǎn)錄組和基因組進(jìn)行細(xì)致全貌的分析成為可能。概述：芯片與高通量測序1.28cm1.28cm

Upto~1Mfeatures/chip5μm5μm

******Millionsofidentical

probes/feature芯片與高通量測序是兩種重要的高通量基因組學(xué)研究技術(shù),對于揭示基因組的結(jié)構(gòu)與功能已經(jīng)并正在發(fā)揮重要的作用.基因組學(xué)高通量技術(shù)檢測Detection發(fā)現(xiàn)DiscoverMicroarraySEQ概述：芯片與高通量測序研究層次芯片平臺測序平臺用途基因組SNP芯片全基因組重測序、全基因組從頭測序、基因組捕獲測序用于研究各種生物DNA序列的差異和單核苷酸多態(tài)性，同時研究這些差異對疾病、診斷、預(yù)后的影響。CGH芯片用于研究基因拷貝數(shù)的變化，從而明確疾病相關(guān)遺傳基因，闡明其致病機(jī)制轉(zhuǎn)錄組表達(dá)譜芯片DGE、RNA-Seq(針對不同種類RNA的大小及結(jié)構(gòu)特點，可采用不同的方法進(jìn)行分離和富集)用于大規(guī)模分析一定生物對象在特定條件下基因表達(dá)變化的全面信息Exon芯片RNA-Seq表達(dá)譜芯片只能檢測正常表達(dá)的mRNA；外顯子芯片除了檢測表達(dá)的mRNA外，還能檢測可變剪接miRNA芯片miRNA-Seq

(分離出miRNA)用于研究miRNA的功能及其在動植物生長發(fā)育、細(xì)胞分化和凋亡以及人類疾病的發(fā)生等過程中的作用蛋白組蛋白芯片-用于檢測某一特定的生理或病理過程相關(guān)蛋白的表達(dá)豐度，目前主要用于信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、蛋白質(zhì)組學(xué)、腫瘤及其它疾病相關(guān)研究。表觀遺傳學(xué)ChIp-on-chip芯片ChIp-Seq用于研究蛋白質(zhì)與DNA的相互作用。從而闡明真核生物基因表達(dá)機(jī)制。DNA甲基化芯片BisulfiteSequencingMBD-Sequencing在全基因組水平研究DNA甲基化在發(fā)育、染色體失活以及人類疾病中的變化芯片和高通量測序目前已有的商業(yè)平臺Deepsequencing-basedexpressionanalysisshowsmajoradvancesinrobustness,resolutionandinter-labportabilityoverfivemicroarrayplatforms.PeterA.C.’tHoen1,*,YavuzAriyurek1,HeleneH.Thygesen1,ErnoVreugdenhil2,RolfH.A.M.Vossen1,etcNucleicAcidsResearch,2021,Vol.36,No.21芯片與二代測序技術(shù)平臺比較-----數(shù)字表達(dá)譜與五種芯片平臺五種芯片平臺，產(chǎn)生的數(shù)據(jù)與NGS數(shù)據(jù)相關(guān)性很低？本文中測試的NGS與RealtimePCR相關(guān)性：R=0.35MAQC系列實驗中，芯片數(shù)據(jù)與Realtime相關(guān)性不小于0.8TheMicroArrayQualityControl(MAQC)projectshowsinter-andintraplatformreproducibilityofgeneexpressionmeasurements.2006,NatureBiotechnology-----數(shù)字表達(dá)譜與五種芯片平臺芯片與二代測序技術(shù)平臺比較NATUREMETHODS|VOL.6NO.5|MAY2021mRNA-Seqwhole-transcriptomeanalysisofasinglecellFuchouTang1,3,CatalinBarbacioru2,3,YangzhouWang2,EllenNordman2,ClarenceLee2,NanlanXu2,XiaohuiWang2,JohnBodeau2,BrianBTuch2,AsimSiddiqui2,----利用單細(xì)胞表達(dá)譜測序芯片與二代測序技術(shù)平臺比較二輪放大之后的樣品分別采用：芯片、測序和Taqman探針法進(jìn)行檢測。“二代測序技術(shù)〞發(fā)現(xiàn)了不同樣品中外顯子的不同表達(dá)豐度結(jié)果顯示：技術(shù)之間已開始具有良好相關(guān)性測序?qū)τ跈z測極低豐度轉(zhuǎn)錄本具有優(yōu)勢----利用單細(xì)胞表達(dá)譜測序芯片與二代測序技術(shù)平臺比較以生物學(xué)材料作為實驗對象，對樣品本身的真實情況缺乏客觀評估。該項研究利用人工合成的microRNApool比較芯片與高通量測序檢測microRNA的定量效果和發(fā)現(xiàn)新信息的能力。QuantitativemiRNAexpressionanalysis:Comparingmicroarrayswithnext-generationsequencingHANNIWILLENBROCK,JESPERSALOMON,ROLFS?KILDE,KIMBUNDVIGBARKEN,THOMASN?HRHANSEN,FINNCILIUSNIELSEN,4S?RENM?LLER,1andTHOMASLITMARNA(2021),15:2028–2034.----利用人工合成的microRNAPool芯片與二代測序技術(shù)平臺比較但兩種技術(shù)顯示出較高的相關(guān)性R=0.93相比較芯片方法，測序在定量上稍遜一籌人工樣品庫的制備：16個合成的microRNAPool形成從0.0625到16倍的濃度梯度，log2范圍從-4到4.檢測兩種方法的定量能力。----利用人工合成的microRNAPool芯片與二代測序技術(shù)平臺比較Mapping/AlignmentDenovoassemblyBiologicalverificationandinterpretationBiologicalquestionExperimentaldesignMicroarrayexperimentSequencingRawintensityRawreadsQC+preprocessFusedgenesAlternativespliceidentifyDEanalysisGO&PathwayClusterAnalyzecSNPcallingSSRdepthanalysis…芯片與二代測序技術(shù)分析流程比較〔以ExpressionArrayvsRNA-Seq為例〕NormalizationRMAPLIERQuantileLOWESSRPMRPKM等測序的開展對計算和數(shù)據(jù)分析提出了挑戰(zhàn)高通量測序技術(shù)產(chǎn)生的速度超過目前計算科學(xué)的開展速度高性能計算+高速網(wǎng)絡(luò)+高效能存儲芯片是一個封閉的檢測系統(tǒng)，只能檢測的信息；測序是一個開放的發(fā)現(xiàn)系統(tǒng)，可以發(fā)現(xiàn)新的信息；芯片平臺經(jīng)過了近20年的開展，具有完整成熟的質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)和分析手段；測序系統(tǒng)的數(shù)據(jù)質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)和分析方法有待更完善和標(biāo)準(zhǔn)化芯片平臺比較穩(wěn)定，在檢測上與Realtime吻合性較高，測序平臺準(zhǔn)確性正逐步提高，并且對于檢測極低豐度轉(zhuǎn)錄本或低頻SNP位點具有優(yōu)勢芯片數(shù)據(jù)分析PC機(jī)可以完成，測序分析需要“高性能計算+高速網(wǎng)絡(luò)+高效能存儲〞整套解決方案芯片與二代測序技術(shù)平臺比較※※※※比較結(jié)論：芯片在TargetedSequencing中發(fā)揮作用二代測序獲得許多未知序列物種信息，利用芯片可以進(jìn)行大量樣本研究芯片與二代測序聯(lián)合應(yīng)用TargetedSequencing采用Targetenrichment〔Agilent〕+NGS(solexa)的技術(shù)，對一個疾病，F(xiàn)reeman-Sheldonsyndrome進(jìn)行捕獲測序。通過采用多步驟分類檢測法，濾掉普通變異和個人獨具的變異后，研究人員從4名Freeman-Sheldon綜合征患者的DNA中準(zhǔn)確找出了致病基因(MYH3)變異。他們的研究說明，對于單個基因變異引起的疾病，外顯子測序同樣可以準(zhǔn)確找到致病基因。外顯子測序也可用于多重基因變異引起的常見疾病，如糖尿病和癌癥的研究中，來揭示該種疾病的致病基因。應(yīng)用案例一：應(yīng)用案例二：AlexanderHoischen等用AgilentSureselecthumanexomekits結(jié)合SOLiD測序技術(shù)分別對無血緣關(guān)系的4名Schinzel-Giedion綜合癥患者的外顯子組序列進(jìn)行了測序，發(fā)現(xiàn)這4個樣本在SETBP1位點均存在雜合新生突變〔heterozyousdenovomutation〕，用Sanger法對另外8個患兒的SETBP1位點進(jìn)行測序驗證，亦發(fā)現(xiàn)該位點同時出現(xiàn)了突變，而所有的點突變集中在高度保守的11nt的外顯子區(qū)域。隨后的研究說明，這些突變引發(fā)了Schinzel-Giedion綜合癥。NatureGenetics?VOLUME42|NUMBER6|JUNE2021NicholasAK,KhurshidM,DésirJ,CarvalhoOP,CoxJJ,ThorntonG,KausarR,AnsarM,AhmadW,VerloesA,PassemardS,MissonJP,LindsayS,GergelyF,DobynsWB,RobertsE,AbramowiczM,WoodsCG.WDR62isassociatedwiththespindlepoleandismutatedinhumanmicrocephaly.NatGenet,2021,42(11):1010–1014.SunY,AlmomaniR,AtenE,CelliJ,vanderHeijdenJ,VenselaarH,RobertsonSP,BaronciniA,FrancoB,Basel-VanagaiteL,HoriiE,DrutR,AriyurekY,denDunnenJT,BreuningMH.TerminalosseousdysplasiaiscausedbyasinglerecurrentmutationintheFLNAgene.AmJHumGenet,2021,87(1):146–153.NikopoulosK,GilissenC,HoischenA,vanNouhuysCE,BoonstraFN,BloklandEA,ArtsP,WieskampN,StromTM,AyusoC,TilanusMA,BouwhuisS,MukhopadhyayA,SchefferH,HoefslootLH,VeltmanJA,CremersFP,CollinRW.Next-generationsequencingofa40MblinkageintervalrevealsTSPAN12mutationsinpatientswithfamilialexudativevitreoretinopathy.AmJHumGenet,2021,86(2):240–247.RehmanAU,MorellRJ,BelyantsevaIA,KhanSY,BogerET,ShahzadM,AhmedZM,RiazuddinS,KhanSN,RiazuddinS,FriedmanTB.Targetedcaptureandnext-generationsequencingidentifiesC9orf75,encodingtaperin,asthemutatedgeneinnonsyndromicdeafnessDFNB79.AmJHumGenet,2021,86(3):378–388.Rosa-RosaJM,Gracia-AznárezFJ,HodgesE,PitaG,RooksM,XuanZY,BhattacharjeeA,BrizuelaL,SilvaJM,HannonGJ,BenitezJ.Deepsequencingoftargetlinkageassay-identifiedregionsinfamilialbreastcancer:methods,analysispipelineandtroubleshooting.PLoSOne,2021,5(4):e9976.ChouLS,LiuCSJ,BoeseB,ZhangXM,MaoR.DNAsequencecaptureandenrichmentbymicroarrayfollowedbynext-generationsequencingfortargetedresequencing:neurofibromatosistype1geneasamodel.ClinChem,2021,56(1):62–72.2021年1月10日，Illumina公司宣布推出HiSeq2500，這款新一代測序系統(tǒng)讓研究人員和臨床醫(yī)生能夠在大約24小時內(nèi)完成整個基因組的測序，即“一天一個基因組〞。HiSeq2500充分利用了HiSeq2000和MISeq平臺上不斷的技術(shù)進(jìn)步。公司預(yù)計在2021年下半年全面出售HiSeq2500，標(biāo)價74萬美元，也可從HiSeq2000升級，升級價格5萬美元。英國牛津納米孔公司亮相的比手掌還小的測序儀2021年2月25日，英國牛津納米孔技術(shù)公司在佛羅里達(dá)州基因組生物學(xué)與技術(shù)會議上宣布了一個爆炸性消息，即推出GridION和MinION兩款基于新一代DNA測序技術(shù)的便攜式基因組測序儀，后者僅有U盤大小，可插入電腦USB端口完成測序，價格僅900美元。兩個儀器都是基于納米孔測序技術(shù)，采用一種特殊的蛋白在薄膜結(jié)構(gòu)上打出納米級小洞或小孔，在膜的一側(cè)施加電壓將單條DNA鏈〔帶負(fù)電〕拉進(jìn)納米孔。當(dāng)DNA的化學(xué)堿基通過時，引起細(xì)微的電流變化，測量這種變化即可識別出不同的堿基〔T、C、G和A〕組成順序，然后通過電腦將每一局部的結(jié)果編織在一起呈現(xiàn)。2021年測序儀市場動態(tài)在基因測序儀器裝備上，美國宣稱要在2021年底推出第三代基因測序儀，英國、日本和其它歐洲國家也有相關(guān)的研發(fā)方案。中國，在2021年12月，中科院與浪潮集團(tuán)宣布聯(lián)手共同研制國產(chǎn)第三代基因測序儀，并方案在3年內(nèi)問世。如假設(shè)成功，將有望緩解目前國內(nèi)研究所使用的基因測序儀完全依賴進(jìn)口、價格昂貴的窘境，并填補(bǔ)我國在基因測序根底裝備領(lǐng)域的空白。第三代測序的開展第三代測序基因測序儀開展中科院與浪潮集團(tuán)宣布聯(lián)手共同研制國產(chǎn)第三代基因測序儀第三代測序技術(shù)原理〔基于納米孔單分子讀取〕

在納米孔測序技術(shù)中，DNA分子依靠被稱為核酸外切酶的蛋白質(zhì)以一次一個堿基的速度通過小孔。這個酶能清楚地區(qū)分出4個DNA堿基編碼：A、C、G、T，也可以檢測出該堿基是否被甲基化。納米孔嚴(yán)格限制了DNA單鏈可以通過的空間,每次只允許一個核苷酸按照原有的次序通過.DNA分子通過納米孔時,它們的序列會被逐一分辨出。

納米孔技術(shù)不需要熒光標(biāo)記物并且很可能不需要進(jìn)行擴(kuò)增，能直接并快速“讀〞出DNA，