H亞型禽流感病毒血凝素單克隆抗體的制備、鑒定及其模擬表位的篩選

報(bào)(Bao)告內(nèi)容文獻(xiàn)綜述研究目的與意義技術(shù)路線結(jié)果與分析小結(jié)第一頁，共二十四頁。文獻(xiàn)(Xian)綜述禽流感病毒血凝素(hemagglutinin,HA)神經(jīng)氨酸酶(neuraminidase,NA)高致病性禽流感H5和H7危害

禽流感第二頁，共二十四頁。禽流感血凝(Ning)素HA功能HA表位[文獻(xiàn)綜述]第三頁，共二十四頁。絲(Si)狀噬菌體具有一條單鏈環(huán)狀DNA基因組外源基因整合到噬菌體基因組中外源蛋白與噬菌體衣殼蛋白融合表達(dá),展示在噬菌體表面噬菌體展示原理[文獻(xiàn)綜述]第四頁，共二十四頁。研究目(Mu)的與意義針對(duì)當(dāng)前禽流感病毒的流行趨勢(shì)，有必要研制良好特異的單克隆抗體，以加強(qiáng)我國Ｈ５亞型高致病性禽流感病原學(xué)的監(jiān)測(cè)工作。HA是刺激機(jī)體產(chǎn)生中和抗體主要抗原，利用中和性的單抗和分子生物學(xué)手段分析流感病毒的中和表位，可以為表位疫苗的研制奠定基礎(chǔ)。第五頁，共二十四頁。制備抗H5亞型禽流感(Gan)病毒HA的單克隆抗體單抗純化單抗鑒定噬菌體淘篩測(cè)序鑒定陽性噬菌體抗血清制備技術(shù)路線HI試驗(yàn)中和試驗(yàn)?zāi)M肽功能確定第六頁，共二十四頁。單克隆抗體(Ti)的制備流程[技術(shù)路線]第七頁，共二十四頁。將抗體固相化，再加入噬菌體肽(Tai)庫與其結(jié)合。通過洗脫，即可收集到帶有目的多肽的重組噬菌體。將這些噬菌體侵染大腸桿菌而得到進(jìn)一步擴(kuò)增。經(jīng)過3～4輪的篩選可獲得與抗體結(jié)合緊密的噬菌體克隆

噬菌體展示技術(shù)“淘篩”過程

[技術(shù)路線]第八頁，共二十四頁。

結(jié)果(Guo)與分析第九頁，共二十四頁。雜交(Jiao)瘤細(xì)胞的制備免疫原：DW毒株

(Ａ/Chicken/Hubei/327/2004)

篩選方法：HI試驗(yàn)

融合２次，共獲得13株單抗

第十頁，共二十四頁。雜交瘤(Liu)細(xì)胞染色體計(jì)數(shù)及相應(yīng)單克隆抗體亞類雜交瘤細(xì)胞株Hybridoma染色體數(shù)目Thenumberofchromosomes單抗亞類Antibodyisotypes1D1186（84-87）IgG2a1H887（86-88）IgG12B790（88-93）IgG2a2C985（83-86）IgG2a2H488（85-90）IgG2a4C986（85-88）IgG11C482（80-85）IgG2a1D484（81-89）IgG2a1E1292（84-96）IgG12E1185（83-90）IgG14C1286（81-88）IgG2a4G293（88-97）IgG15E1284（83-87）IgG1脾細(xì)胞40－SP2/062-68－雜交瘤細(xì)胞染色體數(shù)目均高于兩親本細(xì)胞染色體數(shù)目

第十一頁，共二十四頁。單克(Ke)隆抗體HI效價(jià)單抗1D111H82B72C92H44C9細(xì)胞上清HI效價(jià)212121212422腹水HI效價(jià)2727272821229單抗1C41D41E122E114C124G25E12細(xì)胞上清HI效價(jià)27242425252525腹水HI效價(jià)218210213216214214216

腹水HI效價(jià)要比上清高6～11個(gè)滴度

第十二頁，共二十四頁。HI試驗(yàn)(Yan)分析單抗的特異性

抗體

病毒

單抗（Mcab）

1D111H82B72C92H44C91C41D41E122E114C124G25E12AIV-H5+

+

+

+

+

+

+

+

+

+

+

+

+

AIV-H9-

-

-

-

-

-

-------AIV-H7-

-

-

-

-

-

-------NDV-

-

-

-

-

-

-------IBV-

-

-

-

-

-

-------注：+表示HI試驗(yàn)陽性，―表示HI試驗(yàn)陰性

第十三頁，共二十四頁。AIVH5中和效價(jià)（Neutralizationtiter）1H81D112B72C92H44C9A/CK/Hubei/327/20041:731:7241:2048>1:163841:14451:2048A/Goose/ZF/ZFE/20041:109>1:40961:1624>1:163841:40961:5236A/CK/XF/XFJ/20041:271:6311:100>1:163841:1781:128A/Duck/XF/XFY/20041:256>1:4096>1:4096>1:163841:81921:6457第1批6株單抗對(duì)4株禽流感病毒(Du)的中和效價(jià)

微量中和試驗(yàn)１第十四頁，共二十四頁。中和效價(jià):高(Gao)低微量中和試驗(yàn)２第2批單抗對(duì)病毒A/CK/Hubei/327/2004的中和效價(jià)單抗McAbs1C41D41E122E114C124G25E12中和效價(jià)Neutralizationtiter>1:327681:47321:22387>1:327681:10000>1:32768>1:327681C42E124G25E121E124C121D41C42E12,5E124G24C121E121D4HI效價(jià):高低第十五頁，共二十四頁。M：

proteinmarker1：

Mcab1C4單抗1C4提純后(Hou)SDS（12％）電泳圖提純后的抗體可見有兩條帶，一條重鏈帶50Kd左右，一條輕鏈帶27Kd左右第十六頁，共二十四頁。輪數(shù)Round加入物Input洗脫物Output產(chǎn)出率Vield第一輪firstround1.32×10111.46×1021.11×10－9第二輪secondround1.2×10111.17×1039.75×10－9第三輪thirdround1.95×1011

6.4×1053.28×10－6第四輪fourthround1.98×1011

6.3×1073.18×10－4

四輪親和篩選對(duì)噬菌體(Ti)的富集

以純化單抗1C4為篩選配基，進(jìn)行了四輪淘篩，隨著淘篩次數(shù)增加，產(chǎn)出率都在提高

第十七頁，共二十四頁。噬(Shi)菌體結(jié)合活性分析大部分噬菌體克隆都與單抗1C4有反應(yīng)，而與BSA反應(yīng)很弱，其中有6個(gè)克?。?1，#7，#8，#10，#11，#14）反應(yīng)的A差值較大（>0.6）,因此將這6個(gè)噬菌體克隆測(cè)序。第十八頁，共二十四頁。噬菌體DNA測(cè)序及同(Tong)源性比較6個(gè)序列高度一致，翻譯成肽序列為DHTLYTPYHTHP．用ClustaW軟件比較12肽和HA的同源性：沒有發(fā)現(xiàn)完全一致的序列，但在306－312處有相似序列PXHXXHP。提示這一段區(qū)域可能與抗體識(shí)別位點(diǎn)相關(guān)。

第十九頁，共二十四頁。

競(jìng)爭(zhēng)抑制實(shí)(Shi)驗(yàn)結(jié)果競(jìng)爭(zhēng)抑制試驗(yàn)

取其中陽性噬菌體擴(kuò)增液上清與不同濃度的H5亞型禽流感病毒等體積混合，加入到單抗1C4包被的酶標(biāo)板中，其余操作步驟同ELISA

抑制率＝（未抑制Ａ630-抑制Ａ630）/未抑制Ａ630×100％。率制抑病毒稀釋倍數(shù)

%第二十頁，共二十四頁。小鼠免(Mian)疫試驗(yàn)結(jié)果組別HI抗體效價(jià)（log2）中和效價(jià)陽性噬菌體01：16陽性噬菌體+佐劑01：20原始肽庫擴(kuò)增液0陰性空白（PBS）0陰性HI試驗(yàn)表明未能產(chǎn)生HI抗體中和試驗(yàn)表明有較低的中和抗體產(chǎn)生，且使用佐劑并不能顯著提高抗體產(chǎn)生水平第二十一頁，共二十四頁。

小(Xiao)結(jié)共獲得13株特異性的針對(duì)HA的單克隆抗體，其中有5株單抗的HI效價(jià)大于214，最高可達(dá)218。這些單抗具有良好的亞型特異性，為流感診斷方法的建立提供了有效的手段。從噬菌體隨機(jī)十二肽庫