生產(chǎn)菌種的培養(yǎng)與保存資料

第四章生產(chǎn)菌種的制備和保藏生產(chǎn)菌種的制備過(guò)程生產(chǎn)菌種的保藏生產(chǎn)菌種的質(zhì)量限制

第一節(jié)生產(chǎn)菌種的制備過(guò)程菌種→母斜面→子斜面→搖瓶菌絲→種子罐→發(fā)酵罐

試驗(yàn)室階段：不用種子罐，所用的設(shè)備為培育箱、搖床等試驗(yàn)室常見(jiàn)設(shè)備，在工廠這些培育過(guò)程一般都在菌種室完成，因此現(xiàn)象地將這些培育過(guò)程稱為試驗(yàn)室階段的種子培育。生產(chǎn)車(chē)間階段：種子培育在種子罐里面進(jìn)行，一般在工程歸為發(fā)酵車(chē)間管理，因此形象地稱這些培育過(guò)程為生產(chǎn)車(chē)間階段。種子擴(kuò)大培育是指將保存在砂土管、冷凍干燥管中處休眠狀態(tài)的生產(chǎn)菌種接入試管斜面活化后，再經(jīng)過(guò)扁瓶或搖瓶及種子罐逐級(jí)擴(kuò)大培育,最終獲得確定數(shù)量和質(zhì)量的純種過(guò)程。這些純種培育物稱為種子。種子擴(kuò)培的目的接種量的須要

菌種的馴化

縮短發(fā)酵時(shí)間、保證生產(chǎn)水平種子的要求：總量及濃度能滿足要求

生理狀況穩(wěn)定，個(gè)體與群體活力強(qiáng)，移種至發(fā)酵后，能夠快速生長(zhǎng)

無(wú)雜菌污染一、孢子的制備放線菌孢子的制備：養(yǎng)分要求：養(yǎng)分物質(zhì)含量要低，特殊是氮源培育基：瓊脂斜面培育基培育溫度：28~37℃培育時(shí)間：5~14天斜面含水量：低

棒狀鏈霉菌成熟單菌落生長(zhǎng)豐滿，緊密，菌落呈草帽形，中間突起，氣生菌絲顏色為白色，基內(nèi)菌絲由淺黃到灰黃，都不產(chǎn)生可溶性色素，孢子為暗灰綠色，成熟后，孢子易于刮下棒狀鏈霉菌動(dòng)身菌株單菌落形態(tài)特征棒狀鏈霉菌斜面一般培育四到五天左右產(chǎn)生孢子，六到七天斜面孢子生長(zhǎng)成熟，氣生菌絲顏色為白色，基內(nèi)菌絲由淺黃到灰黃，都不產(chǎn)生可溶性色素，孢子呈暗灰綠色棒狀鏈霉菌動(dòng)身菌株的斜面培育特征霉菌孢子的制備：養(yǎng)分要求：碳、氮含量要低，無(wú)機(jī)鹽適量培育基：自然農(nóng)產(chǎn)品培育溫度：25~28℃培育時(shí)間：4~14天

細(xì)菌種子的制備：養(yǎng)分要求：養(yǎng)分豐富，氮源含量要高培育基：牛肉膏、蛋白胨培育溫度：37℃培育時(shí)間：1~2天（芽孢5~8天）二、搖瓶種子的制備一級(jí)搖瓶→二級(jí)搖瓶→種子罐三、種子罐種子的制備一級(jí)種子罐→二級(jí)種子罐→發(fā)酵罐（三級(jí)發(fā)酵）級(jí)數(shù)的確定：菌種的特性；發(fā)酵罐的體積谷氨酸：三級(jí)發(fā)酵一級(jí)種子（搖瓶）→二級(jí)種子（小罐）→發(fā)酵青霉素：三級(jí)發(fā)酵一級(jí)種子（小罐）→二級(jí)種子（中罐）→發(fā)酵一般由菌絲體培育起先計(jì)算發(fā)酵級(jí)數(shù)，但有時(shí)，工廠從第一級(jí)種子罐起先計(jì)算發(fā)酵級(jí)數(shù)。發(fā)酵級(jí)數(shù)確定的依據(jù)

級(jí)數(shù)受發(fā)酵規(guī)模、菌體生長(zhǎng)特性、接種量的影響級(jí)數(shù)大，難限制、易染菌、易變異，管理困難，一般2-4級(jí)。在發(fā)酵產(chǎn)品的放大中，反應(yīng)級(jí)數(shù)的確定是特殊重要的一個(gè)方面四、種子制備過(guò)程舉例1、谷氨酸生產(chǎn)的種子制備制備過(guò)程斜面菌種→一級(jí)種子培育→二級(jí)種子培育→發(fā)酵斜面(AS1.299)培育基：蛋白胨1%，牛肉膏1%，氯化鈉0.5瓊脂2%，pH7.0-7.2培育基特點(diǎn)：有利于菌體的生長(zhǎng)，原料比較精細(xì)培育條件：32℃，生長(zhǎng)18-24小時(shí)生長(zhǎng)斜面要求：生長(zhǎng)良好，所運(yùn)用斜面連續(xù)傳代不超過(guò)3次一級(jí)種子（搖瓶）培育條件：于1000ml三角瓶中，裝液200-250ml,32℃培養(yǎng)12小時(shí)培育基：葡萄糖2%，尿素0.5%，玉米漿2.5%，K2HPO40.1%培育基特點(diǎn)：有利于菌體的生長(zhǎng)，所運(yùn)用的原料已經(jīng)基本接近于發(fā)酵培育基二級(jí)種子(種子罐)培育條件：在種子罐中培育（容積為發(fā)酵罐的1%），32℃培育7-10個(gè)小時(shí)培育基：和一級(jí)種子相像，其中葡萄糖用水解糖代替，濃度為2.5%培育基的特點(diǎn)：長(zhǎng)菌體，更接近于發(fā)酵培育基種子的質(zhì)量要求：108-109個(gè)/ml大小勻整，呈單個(gè)或八字排列pH7.0-7.2時(shí)結(jié)束，6.8→8→7.0-7.2活力旺盛2、青霉素生產(chǎn)的種子制備制備過(guò)程安培管→斜面孢子→大米孢子→一級(jí)種子→二級(jí)種子→發(fā)酵斜面孢子培育基：甘油、葡萄糖、蛋白胨等培育基特點(diǎn)：有利于長(zhǎng)孢子，用量少而精細(xì)培育條件：25℃、7天,留意濕度50%左右大米孢子培育基：大米及氮源（玉米漿）培育基的特點(diǎn)：成本低、米粒之間結(jié)構(gòu)疏松提高比表面積和氧的傳質(zhì)，養(yǎng)分適當(dāng)（要求大米的白點(diǎn)?。┯欣阪咦拥纳L(zhǎng)。培育條件：25℃、7天，限制濕度大米孢子的要求：1粒米含1.4*106個(gè)孢子一級(jí)種子培育基：（葡萄糖、乳糖、蔗糖）、玉米漿目的：長(zhǎng)菌體培育條件：27℃，40小時(shí)接種量：200億孢子/噸二級(jí)種子培育基：同上培育條件：27℃、10-14小時(shí)接種量：10%種子的質(zhì)量要求菌絲長(zhǎng)稠呈絲狀、菌絲團(tuán)很少，有中小空孢，處于Ⅲ—Ⅳ期青霉素發(fā)酵菌絲體的生長(zhǎng)共分為6個(gè)期，1-4為年青期，4-6期合成青霉素的實(shí)力最強(qiáng)其次節(jié)生產(chǎn)菌種的質(zhì)量限制一、影響孢子質(zhì)量的因素1.培育基養(yǎng)分成分滅菌的質(zhì)量斜面培育基的含水量2.培育溫度和濕度的影響菌體生長(zhǎng)溫度范圍寬些28~37℃，孢子形成溫度窄27、28℃3.培育時(shí)間過(guò)短：孢子不成熟；低溫保藏時(shí)、易死亡過(guò)長(zhǎng)：菌體代謝活力降低，產(chǎn)量低4.保藏時(shí)間一般不超過(guò)一星期5.接種量在母斜面上形成單菌落，在子斜面上形成一層菌落二、影響種子質(zhì)量的因素及限制措施1.影響因素：①培育基②培育條件③培育時(shí)間最適種齡：對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期后期

種齡是指種子罐中培育的菌體起先移入下一級(jí)種子罐或發(fā)酵罐時(shí)的培育時(shí)間。原則：對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期末，細(xì)胞活力強(qiáng)，菌體濃度相對(duì)較大，但是最終由試驗(yàn)結(jié)果定。菌齡過(guò)小：延遲期長(zhǎng)，菌體生長(zhǎng)緩慢，生物合成期縮短，產(chǎn)量降低種齡長(zhǎng)：易老化④接種量接入種子液的體積接入后培育液體積接種量范圍：1~25%，但是一般認(rèn)為大一點(diǎn)好過(guò)大：菌體過(guò)度生長(zhǎng)，養(yǎng)分物質(zhì)及溶氧不能滿足菌體須要，使菌體蒼老、自溶過(guò)?。荷a(chǎn)期延長(zhǎng)，以產(chǎn)生菌絲結(jié)團(tuán)，產(chǎn)量降低接種量=×100%雙種：兩個(gè)種子罐接種到一個(gè)發(fā)酵罐中。倒種：一部分種子來(lái)源于種子罐，一部分來(lái)源于發(fā)酵罐。2.種子質(zhì)量的限制指標(biāo)菌體的形態(tài)碳、氮、磷的代謝狀況菌株的生產(chǎn)實(shí)力特殊酶活力3.種子異樣分析菌絲生長(zhǎng)過(guò)慢：培育基質(zhì)量不好；滅菌質(zhì)量不好；通入空氣的溫度過(guò)低菌絲結(jié)團(tuán)：接種量??；培育基粘度不當(dāng)；攪拌不好菌絲粘壁：攪拌不好；裝料系數(shù)少；泡沫多第三節(jié)生產(chǎn)菌種的保藏一、微生物菌種的保藏要求要求：①是廣泛收集各種探討、教學(xué)和生產(chǎn)性菌種，滿足各方面需求；②高質(zhì)量保藏，即要求保藏的菌種不死亡、活性不蒼老、特性不變異、分類(lèi)不紊亂；③隨時(shí)可供應(yīng)保持有原始特性的菌種用于交換和運(yùn)用。二、菌種保藏原理原理：將微生物菌種保存在不利于微生物活躍生長(zhǎng)和代謝的不良環(huán)境中，如干燥、低溫、缺氧、黑暗、養(yǎng)分饑餓等等，使微生物代謝速率極為緩慢或處于休眠狀態(tài)。而一旦復(fù)原所保存菌種生長(zhǎng)的正常環(huán)境和養(yǎng)分條件，即可獲得具有高生理活性和保持原種優(yōu)良性狀的菌種培育物。三、微生物菌種保藏的常用方法菌種保藏的方法有多種多樣，常用方法簡(jiǎn)介如下：

1、斜面低溫保藏法

2、

液體石蠟封藏法

3、

沙土管保藏法

4、甘油低溫保存法

5、真空冷凍干燥保藏法

6、液氮超低溫保藏法

1、斜面低溫保藏法

4℃保存，1~3月2、

液體石蠟封藏法石蠟→滅菌→冷卻→加入試管中

3、

沙土管保藏法

1mol/L酸洗→1mol/L堿洗→蒸餾水洗→烘干→過(guò)篩→混合（3：2或1：1）→分裝沙土管→

干接法：接孢子后，低溫抽真空濕接法：接孢子懸液后，低溫抽真空取沙取土（沙:20~40目）（土:40~60目）4、

甘油低溫保藏法

等體積混合→-20℃以下保存孢子懸液或菌體30~40%甘油

假如待保藏菌種生長(zhǎng)在斜面上，則可用含10％甘油的新配制液體培育基洗滌收獲。超低溫冰箱的冷凍速度一般限制在1-2℃／min。若干細(xì)菌和真菌菌種可通過(guò)此保藏方法保藏5年而活力不受影響。通過(guò)在減壓條件下使凍結(jié)的細(xì)胞懸液中的水分升華，使培育物干燥。此法是微生物菌種長(zhǎng)期保藏的最為有效的方法之一。冷凍干燥過(guò)程中必需運(yùn)用冷凍疼惜劑，目前國(guó)內(nèi)常用脫脂乳和蔗糖，國(guó)外尚有應(yīng)用動(dòng)物血清等的。大部分微生物菌種可以在凍干狀態(tài)下保藏10年之久而不丟失活力。而且經(jīng)凍干后的菌株無(wú)需進(jìn)行冷凍保藏，便于運(yùn)輸。5、真空冷凍干燥保藏法

等體積混合→分裝凍干管→冷凍至15℃以下→抽真空→封口→低溫保存脫脂牛奶孢子懸液（洗凈）凍干菌種的保藏與再生1．保藏：冷凍干燥后的培育物在低于5℃下保藏。較低的保藏溫度(-20～-70℃)對(duì)于培育物的長(zhǎng)期穩(wěn)定更好。2．復(fù)蘇：(1)在超凈工作臺(tái)中用70％酒精棉球擦洗安瓿，然后用砂輪在安瓿中銼一道溝。(2)用無(wú)菌紗布或無(wú)菌毛巾包好安瓿，然后用手掰開(kāi)安瓿．(3)在安瓿中加入0.5～1ml養(yǎng)分液體培育基，漸漸旋轉(zhuǎn)安瓿。然后將此轉(zhuǎn)接到一含有再生培育基的無(wú)菌試管中，或干脆接種瓊脂斜面或涂布平板。(4)在指管中凍干的菌種通常為絮粉狀，可以將此干脆振落入盛有l(wèi)～2ml液體培育基的試管中，輕輕振蕩5～l0min，然后用此懸液接種適宜的再生培育基。6、液氮超低溫保藏法

10%甘油懸液→降溫至0℃→緩慢降溫至-35℃→放入液氮缸中→

液相：-196℃

（氣相：-150℃

）孢子懸液、(一)冷凍疼惜劑在液氮冷凍保藏中，最常用的冷凍疼惜劑是二甲亞砜和甘油，最終運(yùn)用濃度一般為甘油10％、二甲亞砜5％。所運(yùn)用的甘油一般用高壓蒸汽滅菌，而二甲亞砜最好為過(guò)濾滅菌。

(二)液氮冷凍保藏微生物菌種的步驟1．待冷凍保藏菌種懸液的制備(1)從生長(zhǎng)斜面制備菌懸液：每一斜面加入5ml含10％甘油的養(yǎng)分液體培育；吹吸斜面制成孢子及菌體細(xì)胞懸液；0.5～1ml分裝玻璃安瓿或液氮冷藏專用塑料瓶，(2)從浸沒(méi)培育物制備菌懸液：在浸沒(méi)培育液中加入等體積20%無(wú)菌甘油；輕輕振蕩混勻培育液，假如菌體絮凝較緊，則需先用玻璃珠打散；0.5-1ml分裝玻璃安瓿或液氮冷藏專用塑料瓶，玻璃安瓿用酒精噴燈封口；將全部封好的安瓿置于5℃冰箱中3min，以使細(xì)胞和懸浮培育基之間達(dá)到平衡。

2．控速冷凍(1)將安瓿或液氮瓶置于鋁盒或布袋中，然后置于一較大的金屬容器中；(2)將此金屬容器置于控速冷凍機(jī)的冷凍室中；(3)以1-2℃/min的致冷速度降溫，直到溫度達(dá)到相對(duì)溫度之上幾度的細(xì)胞凍結(jié)點(diǎn)(通常為-30℃)；(4)補(bǔ)加確定量的液氮至系統(tǒng)中，使細(xì)胞在凍結(jié)點(diǎn)時(shí)盡可能快地發(fā)生相變；(5)細(xì)胞凍結(jié)后，將致冷速度降為1℃/min，直到溫度達(dá)-50℃；(6)將安瓿快速移入液氮罐中于液相(-196℃)或氣相(-156℃)中保存。假如無(wú)控速冷凍機(jī)，則一般可將安瓿或液氮瓶置于-70℃冰箱中冷凍4h，然后快速移入液氮罐中保存。(三)復(fù)蘇1．從液氮罐中取出所需的安瓿，立刻置于冰浴中；2．快速將安瓿置于37-40℃水浴中，并輕輕搖動(dòng)以加速解凍；3．用巴氏吸管將安瓿中貯存培育物移接入含有2ml無(wú)菌液體培育基的試管中，用同一支吸管反復(fù)抽吸數(shù)次，然后取0.1-0.2ml(約4、8滴)轉(zhuǎn)接入瓊脂斜面上。常用菌種保藏方法的比較方法原理適宜菌種保藏時(shí)間特點(diǎn)冰箱低溫（4℃）低溫各大類(lèi)微生物3-6個(gè)月簡(jiǎn)便石蠟油封藏低溫、缺氧各大類(lèi)微生物1-2年簡(jiǎn)便砂土保藏干燥、無(wú)營(yíng)養(yǎng)產(chǎn)芽孢細(xì)菌、產(chǎn)孢子的放線菌、霉菌1-10年簡(jiǎn)便有效冷凍干燥保藏干燥、低溫、無(wú)氧各大類(lèi)微生物5-15年以上繁而高效基因工程菌的保藏由載體質(zhì)粒等攜