針刺及艾灸對(duì)M3受體mRNA表達(dá)的調(diào)節(jié)作用,針灸推拿論文

針刺及艾灸對(duì)M3受體mRNA表達(dá)的調(diào)節(jié)作用,針灸推拿論文我們通過(guò)藥物烏頭堿誘發(fā)家兔心律失常，利用RT-PCR法檢測(cè)不同組別的家兔心臟M3受體mRNA的表示出變化，討論針刺及艾灸對(duì)M3受體mRNA表示出的調(diào)節(jié)作用，為針刺和艾灸治療心律失常提供實(shí)驗(yàn)根據(jù)。1、材料與方式方法1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物新西蘭家兔，雄性，3～4月齡，體質(zhì)量2～3kg，清潔級(jí)，上海生旺實(shí)驗(yàn)動(dòng)物養(yǎng)殖有限公司提供，合格證號(hào)：SCXK〔滬〕2007-0007。1.2主要試劑烏頭堿〔中國(guó)藥品生物制品檢驗(yàn)所，批號(hào)：110720-200410〕；烏來(lái)糖〔國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，批號(hào)：20060323〕；總RNA提取試劑盒、RT試劑盒〔美國(guó)Invitrogen試劑公司〕；引物由上海生工生物工程有限公司合成；PCR試劑盒〔中國(guó)Tiangen公司〕。1.3主要儀器PTC-200PCR儀〔美國(guó)ABI公司〕；RM6240B多道生理信號(hào)采集處理系統(tǒng)〔成都儀器廠〕；AllegraTM64R低溫高速離心機(jī)〔美國(guó)Beckman公司〕；DYY-III2水平電泳儀〔北京六一儀器廠〕；DU530紫外分光光度計(jì)〔美國(guó)Beckman公司〕；ZF-90紫外透射儀〔上海顧村電光儀器廠〕；GENEGENIUS生物成像系統(tǒng)〔美國(guó)Syngene公司〕；BCM-1000超凈工作臺(tái)〔蘇州凈化設(shè)備有限公司〕。1.4方式方法1.4.1動(dòng)物分組新西蘭家兔40只，隨機(jī)分為對(duì)照組、藥物組、針刺內(nèi)關(guān)穴組、艾炙組4組，每組10只。每組家兔腹腔注射烏來(lái)糖1.1g／kg麻醉后，用標(biāo)準(zhǔn)肢體Ⅱ?qū)?lián)連接，連續(xù)記錄心電。藥物組：耳緣靜脈注射烏頭堿25g／kg；對(duì)照組：耳緣靜脈注射等容量的生理鹽水；針刺內(nèi)關(guān)穴組：耳緣靜脈注射烏頭堿25g／kg后，電針內(nèi)關(guān)穴，電針20min，頻率3Hz，變頻10Hz，強(qiáng)度以家兔能夠耐受，保持平靜，不引起掙扎為度；艾灸組：耳緣靜脈注射烏頭堿25g／kg后，在內(nèi)關(guān)穴用特制固定器點(diǎn)燃艾條，在所取范圍往返溫和熏灸，艾條與穴位距離以家兔能耐受為度，艾灸時(shí)間20min。1.4.2心肌組織M3受體mRNA表示出的檢測(cè)4組家兔24h后處死，迅速取下左心室，剪成1cm1cm。用總RNA提取試劑盒提取總RNA，利用瓊脂糖甲醛變性凝膠電泳分析其質(zhì)量，并用紫外分光光度計(jì)測(cè)定其純度和含量。取3g總RNA進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反響，取3L逆轉(zhuǎn)錄反響產(chǎn)物進(jìn)行PCR反響。引物：M3上游引物：5-GGTGT-GATGATTGGTCTGGC-3，下游引物：5-TTC-CAACTGTCACTGCTGCT-3，擴(kuò)增片段為458bp。同時(shí)設(shè)置－actin為內(nèi)參，上游引物：5-CTCAT-GAAGATCCTCACCGA-3，下游引物：5-ATCTC-CTTCTGCATCCTGTC-3，擴(kuò)增片段為387bp。PCR反響條件為：預(yù)變性94℃3min，94℃45s，58℃45s，72℃1min，循環(huán)30次后，72℃末端延伸10min。PCR產(chǎn)物上樣于1.2%的瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳，UV照相和密度掃描。1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)處理數(shù)據(jù)用xs表示，用SPSS15.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行處理，不同組間的數(shù)據(jù)用單因素方差分析和LSD檢驗(yàn)，P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。2、結(jié)果2.1模型制備模型組耳緣靜脈注射烏頭堿25g／kg，觀察心電圖的變化，記錄心律失常的發(fā)生情況。2.2電針干涉對(duì)家兔心肌M3受體mRNA表示出的影響表1。結(jié)果顯示，與正常對(duì)照組比擬，藥物組M3受體的mRNA表示出明顯增加，針刺內(nèi)關(guān)穴后，M3受體的mRNA表示出與藥物組比擬有明顯降低，P＜0.05。2.3艾灸干涉對(duì)家兔心肌M3受體mRNA表示出的影響表2。結(jié)果顯示，與正常對(duì)照組比擬，藥物組M3受體的mRNA表示出明顯增加，P＜0.05。艾灸組與藥物組比擬，M3受體的mRNA表示出有明顯降低P＜0.05，但較針刺內(nèi)關(guān)穴組，M3受體的mRNA表示出有所升高，差異不顯著。3、討論3.1心律失常的病因復(fù)雜，可由多種因素引起心肌電生理的異常。烏頭堿能直接興奮心肌，激活Na+通道，促進(jìn)Na+內(nèi)流，對(duì)L型Ca2+通道也有明顯的通透作用，加速細(xì)胞膜的去極化，提高心房傳導(dǎo)組織和房室束-浦肯野系統(tǒng)等快反響細(xì)胞的自律性，這是烏頭堿致心律失常的主要機(jī)制。心臟在交感神經(jīng)和副交感神經(jīng)的精細(xì)控制下完成正常的生理功能，心臟迷走神經(jīng)通過(guò)刺激M型乙酰膽堿受體，調(diào)節(jié)心臟收縮力、興奮性和傳導(dǎo)。近些年發(fā)現(xiàn)，M3受體不僅具有負(fù)性肌力和負(fù)性頻率的作用，還能夠介導(dǎo)一種新的鉀電流，并且在充血性心力衰竭、缺血性心律失常等疾病的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮著重要作用。當(dāng)前，越來(lái)越多的證據(jù)表示清楚，心臟M3受體是一種新型的抗心律失常藥物靶點(diǎn)。研究表示清楚M3受體在病理狀態(tài)下和生理狀態(tài)下的功能性表示出是不同的。ShiH等分別在充血性心力衰竭犬的心房肌細(xì)胞和健康犬的心房肌細(xì)胞上，通過(guò)Westernblotting比擬M3受體的密度，全細(xì)胞膜片鉗技術(shù)比擬M3受體沖動(dòng)的延遲整流鉀電流〔IKM3〕的電流密度，發(fā)現(xiàn)M3受體密度和IKM3的電流密度在充血性心力衰竭犬的心房肌細(xì)胞上明顯增加。由此可見，心肌M3受體在病理狀態(tài)下，功能性表示出明顯增加。宋娟等研究也發(fā)現(xiàn)烏頭堿誘發(fā)心律失常后，大鼠心肌M3受體mRNA的表示出加強(qiáng)。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)烏頭堿誘發(fā)新西蘭家兔心律失常后，通過(guò)半定量RT-PCR法檢測(cè)心臟M3受體mRNA的表示出變化，結(jié)果也發(fā)現(xiàn)心肌M3受體mR-NA的表示出加強(qiáng)。3.2內(nèi)關(guān)穴是手厥陰心包經(jīng)的絡(luò)穴，又是八脈交會(huì)穴，通陰維脈；心包經(jīng)和手少陽(yáng)三焦經(jīng)相表里，故針刺內(nèi)關(guān)能夠通三焦，調(diào)諸臟。心居上焦，亦受其調(diào)節(jié)。所以，針刺或艾灸內(nèi)關(guān)穴對(duì)心律失常有調(diào)整作用。與臨床常用的抗心律失常藥相比，針刺和艾灸具有使用安全、費(fèi)用低廉、副作用小的優(yōu)點(diǎn)。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表示清楚針刺內(nèi)關(guān)穴組的M3受體mRNA表示出較藥物組低，艾灸組的M3受體mRNA表示出也較藥物組低，證實(shí)了針刺或艾灸內(nèi)關(guān)穴能夠在一定的程度上降低M3受體的表示出，提示針刺或艾灸內(nèi)關(guān)穴治療心律失常與M3受體的介入有關(guān)。以下為參考文獻(xiàn)：［1］