口腔基礎醫(yī)學進展：7 熒光素酶報告基因系統(tǒng)

熒光素酶報告基因系統(tǒng)課程內(nèi)容實驗原理實驗儀器設備實驗試劑及耗材操作步驟應用舉例重點內(nèi)容Luciferase報告基因系統(tǒng)以熒光素(luciferin)為底物來檢測螢火蟲熒光素酶(firefly

luciferase)活性的一種報告系統(tǒng)。熒光素酶可以催化luciferin氧化成oxyluciferin，在luciferin氧化的過程中，會發(fā)出生物熒光(bioluminescence)。然后可以通過熒光測定儀也稱化學發(fā)光儀(luminometer)或液閃測定儀測定luciferin氧化過程中釋放的生物熒光。熒光素和熒光素酶這一生物發(fā)光體系，可以極其靈敏、高效地檢測基因的表達。雙熒光素酶報告基因測試結合螢火蟲和海腎熒光素酶的共報告基因測試技術在用螢火蟲熒光素酶定量基因表達時,通常采用第二個報告基因來減少實驗的變化因素。體外分泌的熒光素基因:目前NEB公司提供新型的可在細胞外分泌的熒光素酶,分別是Gluc和Cluc,具體使用幫助可在NEB官方網(wǎng)站找到.轉(zhuǎn)錄因子活性檢測實驗原理（1）構建一個將靶啟動子的特定片段插入到熒光素酶表達序列前方的報告基因質(zhì)粒，如pGL3-basic等（2）將要檢測的轉(zhuǎn)錄因子表達質(zhì)粒，與報告基因質(zhì)粒和對照質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染。如果此轉(zhuǎn)錄因子能夠激活靶啟動子則熒光素酶基因就會表達，熒光素酶的表達量與轉(zhuǎn)錄因子的作用強度呈正比。（3）加入特定的熒光素酶底物，熒光素酶與底物反應，產(chǎn)生熒光，通過檢測熒光的強度可以測定熒光素酶的活性，從而判斷轉(zhuǎn)錄因子是否能與此靶啟動子片段有作用。生物信息分析序列插入和質(zhì)粒構建質(zhì)粒轉(zhuǎn)染和細胞培養(yǎng)miRNA活性檢測實驗原理（1）構建一個將靶3’-UTR的特定片段插入到熒光素酶表達序列后方的報告基因質(zhì)粒，如pGL3-basic等（2）將要檢測的miRNA，與報告基因質(zhì)粒和對照質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染。如果此miRNA能夠抑制靶3’-UTR則熒光素酶基因表達降低，熒光素酶的表達量與轉(zhuǎn)錄因子的作用強度呈反比。（3）加入特定的熒光素酶底物，熒光素酶與底物反應，產(chǎn)生熒光，通過檢測熒光的強度可以測定熒光素酶的活性，從而判斷miRNA是否能與此靶3’-UTR片段有作用。生物信息分析序列插入和質(zhì)粒構建質(zhì)粒轉(zhuǎn)染和細胞培養(yǎng)實驗試劑及耗材雙熒光素酶報告基因試劑盒：實驗試劑及耗材轉(zhuǎn)染試劑HEK293細胞（人腎上皮細胞系）實驗儀器設備轉(zhuǎn)錄因子活性檢測實驗步驟（1）用生物信息學方法分析并預測啟動子區(qū)可能的轉(zhuǎn)錄因子結合位點。（2）設計引物用PCR法從基因組DNA中克隆所需的靶啟動子片段，將此片段插入熒光素酶報告基因質(zhì)粒pGL3-basic（3）篩選陽性克隆，測序。擴增克隆并提純質(zhì)粒備用。（4）擴增轉(zhuǎn)錄因子質(zhì)粒，提純備用。同時準備相應的空載質(zhì)粒對照，提純備用（5）培養(yǎng)目的細胞，并接種于24孔板中，生長10-24小時（80%匯合度）。（6）將報告基因質(zhì)粒與轉(zhuǎn)錄因子表達質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染細胞（7）提取蛋白并用于熒光素酶檢測。（8）加入底物，測定熒光素酶的活性。（9）計算相對熒光強度，并與空載對照比較。http://www.cbs.dtu.dk/services/Promoter/3’UTR序列查詢3’UTR序列查詢3’-UTR生物信息分析序列插入和質(zhì)粒構建質(zhì)粒轉(zhuǎn)染和細胞培養(yǎng)儀器使用應用舉例應用舉例活體動物成像原理：以熒光素酶標記細胞或動物模型應用優(yōu)點和缺點本次課程重點內(nèi)容應用熒光素酶報告基因系統(tǒng)檢測轉(zhuǎn)錄因子活性實驗原理應用熒光素酶報告基因系統(tǒng)檢測miRNA活性實驗原理轉(zhuǎn)錄因子活性檢測實驗原理（1）構建一個將靶啟動子的特定片段插入到熒光素酶表達序列前方的報告基因質(zhì)粒，如pGL3-basic等（2）將要檢測的轉(zhuǎn)錄因子表達質(zhì)粒，與報告基因質(zhì)粒和對照質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染。如果此轉(zhuǎn)錄因子能夠激活靶啟動子則熒光素酶基因就會表達，熒光素酶的表達量與轉(zhuǎn)錄因子的作用強度呈正比。（3）加入特定的熒光素酶底物，熒光素酶與底物反應，產(chǎn)生熒光，通過檢測熒光的強度可以測定熒光素酶的活性，從而判斷轉(zhuǎn)錄因子是否能與此靶啟動子片段有作用。miRNA活性檢測實驗原理（1）構建一個將靶3’-UTR的特定片段插入到熒光素酶表達序列后方的報告基因質(zhì)粒，如pGL3-basic等（2）將要檢測的miRNA，與報告基因質(zhì)粒和對照質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染。如果此miRNA能夠抑制靶3’-UTR則熒光素酶基因表達降低，熒光素酶的表達