第5章 分子雜交技術(shù)

PAGEPAGE88第五章分子雜交技術(shù)實(shí)驗(yàn)一組織切片原位雜交一、原理和用途組織原位雜交技術(shù)是利用標(biāo)記的已知序列的核酸探針，與組織中待測核酸進(jìn)行雜交，從而對組織中待測核酸進(jìn)行定性、定位和相對定量分析的一種研究方法。其基本原理是：如果組織中存在與核酸探針堿基序列互補(bǔ)的核酸序列，這種序列可與單鏈探針的核酸序列在一定條件下形成穩(wěn)定的雜交分子，通過對核酸探針?biāo)鶐?biāo)記物的檢測即可檢測出待測核酸，如果探針?biāo)鶐?biāo)記物為核素標(biāo)記，可用核乳膠涂片，放射自顯影，觀察銀粒的分布，對其進(jìn)行初步定位與定量分析；如果探針是用非放射性標(biāo)記，測可通過免疫組織化學(xué)法來檢測。組織原位雜交技術(shù)用于原位檢測細(xì)胞內(nèi)某些正?；虍惓５腄NA、RNA。這項(xiàng)技術(shù)對于研究基因的表達(dá)及其調(diào)控方面尤為重要，通常使用cDNA探針對組織中mRNA進(jìn)行檢測，來研究某基因在組織中的表達(dá)情況。二、實(shí)驗(yàn)材料動物組織切片。三、溶液與緩沖液1．100mmol/LPBS(pH7.2)：Na2HPO2·12H2O61.6gNaH2PO4·2H2O5.6gNaCl9g加ddH2O至2000mL，高壓滅菌。2．200mmol/LPB(pH7.2)：Na2HPO2·12H2O61.6gNaH2PO4·2H2O5.6g加ddH2O至1000mL，高壓滅菌。3．100mmol/L甘氨酸：0.75g甘氨酸溶于100mmol/LPBS，定容至100mL，高壓滅菌。4．4%多聚甲醛：多聚甲醛40g加ddH2O400mL，加熱至70℃左右，用1mol/LNaOH調(diào)pH至7.0，用ddH2O定容至500mL，再加200mmol/LPB500mL，總體積為1000mL。5．16×Denhardt溶液：聚乙烯吡咯酮0.4gBSA0.4g聚蔗糖0.4g加ddH2O至10mL，無菌抽濾、分裝，-20℃保存?zhèn)溆谩?．預(yù)雜交液：去離子甲酰胺10mL、50%硫酸葡聚糖4mL，于50℃促溶后，再依次加入16×Denhardt液0.2mL、1mol/LTris·HCl(pH8.0)0.2mL、5mol/LNaCl1.2mL、0.5mol/LEDTA(pH8.0)0.04mL、0.1mol/L二硫蘇糖醇2mL、ddH2O2.21mL，總體積為20mL。無菌抽濾、分裝，-20℃保存?zhèn)溆?。臨用前加入50mg/mL變性鮭魚精DNA75μgl/mL。7．20×SSC：NaCl175.3g檸檬酸鈉88.2g，用NaOH調(diào)pH至7.0加水到1000mL。高壓滅菌。8．抗體稀釋液：TritonX-10080μL、BSA0.2g，以0.05mol/LPBS定溶至20mL。9．TSM1：1mol/LTris·Cl(pH8.0)10mL5mol/LNaCl2mL1mol/LMgCl21mL加ddH2O100mL10．TSM2（新鮮配制）：1mol/LTris·HCl(pH9.5)10mL5mol/LNaCl2mL1mol/LMgCl21mL加ddH2O100mL。11．顯色液（臨用前現(xiàn)配）：5mLTSM2加顯色液原液（NBT/BCIP）150μL，并加適量左旋咪唑使其終濃度為0.24μg/mL，避光。12．探針：地高辛標(biāo)記NGF的cDNA探針。13．抗體：抗地高辛-抗血清堿性磷酸酶復(fù)合物。14．顯色液原液：NBT/BCIP15．1μg/mL蛋白酶K16．3%戊巴比妥鈉17．0.25%乙酸酐/100mmol/L三乙醇四、儀器設(shè)備及耗材冰凍切片機(jī)，移液器，Eppendorf管，PE手套，載玻片，蓋玻片，烘箱，培養(yǎng)箱，水浴鍋，溫度計，臥式染缸，試劑瓶，離心機(jī)，Tip頭，錫箔紙，濾紙，冰箱，移液器架，離心管架，Tip頭架，高壓滅菌鍋，熒光顯微鏡。五、實(shí)驗(yàn)方法1．取材、冰凍切片將動物以3%戊巴比妥鈉麻醉，打開胸腔，暴露心臟，刺破右心耳，將針尖刺入左心室用生理鹽水灌注（灌注量約為動物體重的2倍），再注入等量的4%多聚甲醛。取材（本實(shí)驗(yàn)直接取腦組織），置于4%多聚甲醛中后固定4h。以100mmol/LPBS浸泡沖洗4～5次（換液：1次/h）。將組織塊入30%蔗糖/100mmol/LPBS液（4℃），1～2d后冰凍切片，將切片裱貼于原位雜交專用玻片上，切片厚度為15μm。2．原位雜交反應(yīng)（1）切片于100mmol/LPBS（pH7.2）浸5～10min；（2）0.1mol/L甘氨酸/100mmol/LPBS浸5min；（3）0.3%TritonX-100/100mmol/LPBS浸10～15min；（4）100mmol/LPBS洗5min×3次，加蛋白酶K(1μg/mL)，37℃孵育30min；（5）4%多聚甲醛浸5min；（6）100mmol/LPBS洗5min×2次，浸入新鮮配制的含0.25%乙酸酐/100mmol/L三乙醇胺中10min；（7）預(yù)雜交：滴加適量預(yù)雜交液，42℃30min；（8）雜交：傾去預(yù)雜交液，在每張切片上滴加10～20μL探針與雜交液混合物（將探針變性后稀釋在預(yù)雜交液中，0.5ng/μL），覆以蓋玻片或蠟?zāi)ぃ?2℃過夜。（9）4×SSC、2×SSC、1×SSC、0.5×SSC37℃各洗20min；0.2×SSC37℃洗10min；0.2×SSC與100mmol/LPBS各半洗10min；0.05mol/LPBS洗5min×2次。（10）3%BSA/0.05mol/LPBS包被，37℃30min。（11）滴加抗地高辛-抗血清堿性磷酸酶復(fù)合物（以抗體稀釋液1:5000稀釋）4℃孵育過夜。（12）0.05mol/LPBS洗15min×4次；TSM110min×2次；新鮮配制TSM210min×2次。（13）顯色：在玻片上滴加適量顯色液，4℃避光過夜。（14）顯微鏡下觀察結(jié)果。六、作業(yè)與思考題1．在整個實(shí)驗(yàn)過程中，一定要防止污染，所有實(shí)驗(yàn)用玻璃器皿及鑷子都應(yīng)滅菌、最好戴口罩和消毒手套，為什么？2．甲醛固定有什么作用？實(shí)驗(yàn)二細(xì)菌菌落的原位雜交一、原理及用途用轉(zhuǎn)化細(xì)菌涂布瓊脂平板，經(jīng)數(shù)小時培養(yǎng)使菌落生長至適當(dāng)大小后，將菌落轉(zhuǎn)移到雜交膜上，用堿溶解等方法溶解細(xì)菌并使釋放的DNA變性，用烘烤或紫外線照射等方法將變性的DNA固定在雜交膜上，然后進(jìn)行核酸雜交和信號顯示。通過將雜交信號與原瓊脂平板進(jìn)行對位，便可找出與雜交信號對應(yīng)的陽性菌落。細(xì)菌菌落的原位雜交是篩選重組菌克隆的常用方法之一，也是篩選cDNA文庫的常用方法，目前仍廣泛使用。由于試驗(yàn)?zāi)康牟煌?，涂布瓊脂平板的?xì)菌數(shù)以及隨后的操作可能有所差異，但基本原理和操作過程大同小異。本實(shí)驗(yàn)以中等數(shù)量菌落的原位雜交為例，練習(xí)菌落原位雜交的基本操作。二、實(shí)驗(yàn)材料重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化的大腸桿菌培養(yǎng)物。三、溶液與緩沖液含適當(dāng)抗菌素（如氨芐青霉素）的LB瓊脂平板印度墨汁DNA變性溶液：1.5mol/LNaCl0.5mol/LNaOH中和溶液：1.5mol/LNaCl0.5mol/LTris（pH7.4）10%SDS2×SSC或SSPE預(yù)雜交/雜交液：見附錄5×SSC5×Denhardt溶液1%（W/V）SDS使用前補(bǔ)加100ug/mL變性的鮭魚精DNA）標(biāo)記探針封閉液：10mmol/LTris-Cl150mmol/LNaCl0.05%(V/V)Tween-206×SSC或SSPE預(yù)洗液：見附錄2×SSC/0.1%SDS1×SSC/0.1%SDS0.1×SSC/0.1%SDS四、儀器設(shè)備及耗材雜交爐或水浴搖床，真空烘烤爐或紫外交聯(lián)儀，水浴箱，雜交用尼龍膜，專用塑料袋或雜交玻璃管，Whatman3MM環(huán)形濾紙，玻璃或塑料盤等。五、實(shí)驗(yàn)方法用軟質(zhì)鉛筆將90mm直徑的雜交膜編號，然后用平頭鑷將其放在盛有蒸餾水的玻璃容器中，待其濕潤后，夾在兩張濾紙的中間，再用錫箔紙包裝，高壓滅菌（1.05kg/cm2，10min）后備用。用重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化的大腸桿菌涂布90mm直徑的LB瓊脂平板（含特定抗菌素，制備后2~3d內(nèi)的瓊脂平板效果最佳），細(xì)菌培養(yǎng)物的稀釋倍數(shù)及用量以產(chǎn)生2000~2500個菌落為宜（通過預(yù)試驗(yàn)確定）。將瓊脂平板在37℃培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，使菌落生長至平均大小為1.5mm左右。此瓊脂平板用塑料薄膜包裹，暫存于4℃?zhèn)溆?。在無菌環(huán)境下打開長有菌落的瓊脂平板，用兩個消毒鑷子（左右手各一）夾取消毒后的雜交膜，使其對準(zhǔn)瓊脂平板，并小心地與瓊脂表面的菌落接觸，直到雜交膜完全濕潤為止（見圖5-1）。此操作的關(guān)鍵之一是盡量避免在瓊脂與雜交膜之間形成氣泡，具體做法是使雜交膜微微曲折，從中間開始逐漸與瓊脂表面接觸。在雜交膜濕潤過程中，用蘸有墨汁的大號針頭穿透雜交膜和瓊脂培養(yǎng)基，從而產(chǎn)生3個不對稱的孔洞，作為雜交信號與菌落對位的標(biāo)記。用平頭鑷夾取雜交膜的一邊，并輕輕且平穩(wěn)地將其從瓊脂培養(yǎng)基表面揭下，并立即轉(zhuǎn)移到另一瓊脂平板內(nèi)（菌落面朝上），連同原瓊脂平板（簡稱母板）一起在37℃培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)5~7h，使菌落生長至2~3mm。培養(yǎng)后的母板用塑料薄膜包裹，反轉(zhuǎn)放置于4℃冰箱內(nèi)備用。用平頭鑷將雜交膜從瓊脂平板中取出，在10%SDS浸透的濾紙上放置3min，以防止變性和中和過程中質(zhì)粒DNA的擴(kuò)散。將90mm直徑的Whatman3MM或同等濾紙置于3個清潔的玻璃盤內(nèi)，每盤3張，分別向盤內(nèi)加入DNA變性液、中和液和2×SSC，將多余的液體倒出，并用玻璃吸管趕去濾紙與容器間的氣泡。用鑷子夾取上述（操作步驟6）雜交膜，依次平放于變性液、中和液和2×SSC飽和的濾紙上，每次放置時間各為5min。在雜交膜向下一盤濾紙轉(zhuǎn)移前，應(yīng)使其與盤的邊緣接觸，然后使其一角與吸水紙接觸，以便吸去多余的液體。DNA與雜交膜固定結(jié)合的方法有烘烤法和紫外交聯(lián)法。前者是較為經(jīng)典的方法，雖然需時較長，但效果可靠。具體做法是將上述雜交膜在濾紙上室溫干燥至少30min，然后夾在兩張濾紙的中間，在80℃真空干燥爐內(nèi)烘烤1~2h。注意不要烘烤過度，以免雜交膜損壞和出現(xiàn)非特異雜交信號；紫外交聯(lián)法是將上述雜交膜在2×SSC內(nèi)浸透，或直接置于干燥濾紙上（根據(jù)產(chǎn)品說明），在354nm波長的紫外線下照射3~5min。為便于雜交信號與相應(yīng)克隆的準(zhǔn)確對位，也避免因雜交背景過低而無法顯示針頭打孔的位置，常在高溫烘烤或紫外交聯(lián)前，以針頭打孔為頂點(diǎn)將雜交膜剪出3個不對稱的三角形缺口，并在母板上畫出同樣的缺口標(biāo)記。將上述尼龍膜漂浮在一盤6×SSC的液面，待其由下而上完全濕潤后，浸入液體內(nèi)泡2min以上。預(yù)雜交/雜交可在專用雜交轉(zhuǎn)管及雜交爐中進(jìn)行，也可在塑料袋及水浴搖床中進(jìn)行。本實(shí)驗(yàn)練習(xí)在塑料袋的雜交方法，具體做法是：將尼龍膜裝入略大的塑料袋中，向袋中加入預(yù)熱的預(yù)雜交液（約0.2mL/cm2），盡量擠出袋中的氣泡，然后用加熱封口機(jī)封口，在68℃水浴搖床內(nèi)孵育1~2h。培養(yǎng)培養(yǎng)母板長有菌落的雜交膜影印平板培養(yǎng)尼龍膜變性處理培養(yǎng)培養(yǎng)瓊脂平板（母板）轉(zhuǎn)化菌帶有DNA的雜交膜圖5-1菌落從瓊脂平板向雜交膜轉(zhuǎn)移示意圖。將雙鏈標(biāo)記探針在100℃加熱5min使其變性（單鏈探針不需變性），然后冰浴冷卻2min。將塑料袋取出，剪去一角，并加入變性探針后再次封口，注意擠去氣泡。將塑料袋重新放回68℃水浴搖床中，繼續(xù)雜交過夜。雜交結(jié)束后取出塑料袋，剪去其一角，將雜交液倒在專用容器內(nèi)，剪開塑料袋并取出雜交膜，將膜在裝有數(shù)百毫升0.5%SDS/2×SSC的塑料盒中室溫下浸泡5min，再在0.1%SDS/2×SSC中浸泡15min。倒出盒中液體，向其中加入預(yù)熱至68℃的0.5%SDS/0.1×SSC，并在同樣溫度的搖床中洗滌30~60min。在此過程中，可用手提式放射性探測儀測定膜上的放射活性，并根據(jù)情況決定洗滌時間。將雜交膜在室溫的0.1×SSC中過洗，然后置于吸水紙上吸去多余液體（不必晾干，以備在需要的情況下再次洗滌）。用塑料薄膜包裹雜交膜，適當(dāng)標(biāo)記后在暗房內(nèi)放入裝有X-光膠片的暗盒，然后將暗盒置于黑色塑料袋中，在-70℃冰箱內(nèi)暴光10~24h。在暗房內(nèi)取出膠片，用常規(guī)方法顯影和定影，并用吹風(fēng)或室溫下晾干。將一張透明塑料紙貼在顯影后的X-光膠片上，用記號筆標(biāo)出3個不對稱缺口和陽性信號的位置，然后與保存的母板對位，找出相應(yīng)的陽性克?。ň洌?。用消毒牙簽挑取可疑的陽性克隆，以便進(jìn)行細(xì)菌培養(yǎng)、質(zhì)粒DNA制備和其它試驗(yàn)。菌落原位雜交篩選陽性克隆的準(zhǔn)確性受多種因素影響，包括菌落的密度、母板及雜交膜的位置標(biāo)記是否正確、雜交背景及非特異信號的強(qiáng)弱和個人實(shí)踐經(jīng)驗(yàn)等，必要時需進(jìn)行兩輪或多輪雜交，才能明確鑒定出真正的陽性克隆。一旦獲得陽性克隆，應(yīng)及時進(jìn)行菌種的培養(yǎng)和保存。六、作業(yè)與思考題1．反復(fù)進(jìn)行菌落從瓊脂平板向雜交膜轉(zhuǎn)移的實(shí)驗(yàn)操作。2．影響菌落原位雜交篩選陽性克隆準(zhǔn)確性的因素有哪些？實(shí)驗(yàn)三基因定位的染色體原位雜交一、原理和用途熒光原位雜交（FISH）技術(shù)最早出現(xiàn)于1969年，起初是對爪蟾卵母細(xì)胞中的核糖體序列作圖，后來，用于對果蠅多線染色體上的重復(fù)序列作圖。以后，隨著各種技術(shù)的改進(jìn)，發(fā)展到用于對動、植物染色體上的單拷貝基因的作圖。熒光原位雜交（FISH）技術(shù)使用熒光標(biāo)記與檢測系統(tǒng)代替了放射性標(biāo)記與檢測。探針標(biāo)記物多采用生物素或地高辛等半抗原，而以分別與它們具有特異性高度親合力的抗生物素和抗地高辛抗體為檢測配體，在配體上分別連接不同的熒光物質(zhì)，如異硫氰酸熒光素（FITC）或德克薩斯紅（texasred）等。探針經(jīng)過變性為單鏈DNA，與已變性的染色體DNA進(jìn)行雜交，探針與靶DNA結(jié)合成雙鏈，再用檢測配體與探針上的生物素或地高辛結(jié)合，由于配體上連接熒光物質(zhì)，在不同的激發(fā)光下，熒光物質(zhì)發(fā)出不同熒光，背景染色用PI、DAPI等熒光染料染色，在熒光顯微鏡下，可觀察到探針?biāo)谖恢?，就是目?biāo)DNA。檢測配體可以再接檢測配體，進(jìn)行信號二次放大，增加檢測靈敏度。熒光原位雜交是細(xì)胞遺傳學(xué)與分子遺傳學(xué)之間的橋梁，廣泛應(yīng)用于分子生物學(xué)和遺傳學(xué)領(lǐng)域。二、實(shí)驗(yàn)材料常規(guī)染色體標(biāo)本制片。三、溶液與緩沖液70%甲酰胺/2×SSC：35mL甲酰胺5mL20×SSC10mLddH2O50%甲酰胺/2×SSC：100mL甲酰胺20mL20×SSC80mLddH2O 洗脫液：100mL20×SSC加Tween20500L加水至500mL。4．BlockingI：3%BSA4×SSC0.1%Tween-205．BlockingII：3%BSA4×SSC5%goatserum0.1%Tween206．20×SSC：NaCl175.3g檸檬酸鈉88.2g用NaOH調(diào)pH至7.0加水到1000mL，高壓滅菌。7．雜交液：40L25%硫酸葡聚糖（DS）20L20×SSC40LddH2O取上述混合物50L，與5L去離子甲酰胺（DF）混合。8．探針：生物素標(biāo)記小鼠Y染色體的長臂探針9．Rubbercement粘合劑：四、儀器設(shè)備及耗材移液器，EP管，一次性手套，塑料膜，烘箱，培養(yǎng)箱，水浴鍋，溫度計，立式染缸，試劑瓶，離心機(jī)（冷凍和常規(guī)），Tip頭，錫箔紙，濾紙，冰箱，培養(yǎng)皿，移液器架，離心管架，Tip頭架，高壓滅菌鍋，熒光顯微鏡。五、實(shí)驗(yàn)方法1．常規(guī)染色體標(biāo)本制片（注意：制片時固定時間加長，最后一次固定采用甲醇：冰醋酸=1：1的固定液）；染色體標(biāo)本預(yù)處理(1)染色體本于50℃烤片至少2h。(2)標(biāo)本置70～75℃，70%甲酰胺/2×SSC中變性2～3min。(3)立即按順序?qū)?biāo)本經(jīng)-20℃的系列冰乙醇70%，90%，100%中脫水各5min。(4)室溫干燥，涼干。3．原位雜交(1)探針變性：2L探針加8L雜交液，于75℃水浴變性5min，立即置0℃，5～10min。(2)將已變性的DNA探針滴在已變性并脫水的玻片標(biāo)本上，蓋上蓋玻片，Rubbercement封片，置于潮濕暗盒中，37℃雜交過夜（約15～17h）。4．洗脫、熒光檢測與信號放大將標(biāo)本從37℃溫箱中取出，去掉封片膠和蓋玻片，于42℃～50℃的50%甲酰胺/2×SSC中洗滌4次，每次5min。于42～50℃的1×SSC中洗滌3次，每次5min。玻片在室溫下，于2×SSC中輕洗一下。（注意：每一步在轉(zhuǎn)入下一步之時，都應(yīng)用吸水紙吸一下玻片底邊的液體）加100L封閉液I于標(biāo)本上，蓋上塑料膜，37℃溫育20min。加100Lavidin-FITC于標(biāo)本上，蓋上塑料膜，37℃繼續(xù)溫育40min。取出標(biāo)本，于42℃～45℃，4×SSC/0。1%Tween20中洗滌3次，每次5min。加BlockingII于標(biāo)本上，蓋上塑料膜，37℃溫育20min。加100Lantiavidin于標(biāo)本上，37℃溫育30～60min。取出標(biāo)本，于42～45℃，4×SSC/0.1%Tween20中洗滌3次，每次5min。加100LBlockingI于標(biāo)本上，蓋膜，37℃溫育20min。加100Lavidin-FITC于標(biāo)本上，蓋膜，37℃溫育40min。取出標(biāo)本，42～45℃，4×SSC/0.1%Tween20中洗滌3次，每次5min；再于2×SSC中室溫輕洗一下。玻片于洗滌液中取出，自然干燥，加PI/antifade10uL復(fù)染，蓋上蓋玻片。5．觀察：在熒光顯微鏡下，選擇適合觀察PI和FITC的熒光濾片進(jìn)行觀察。六、作業(yè)與思考題1．拍攝染色體照片并分析實(shí)驗(yàn)結(jié)果。2．影響熒光原位雜交的因素有哪些？實(shí)驗(yàn)操作中應(yīng)注意哪些問題？實(shí)驗(yàn)四Southern雜交分析一、原理及用途用限制性內(nèi)切酶將DNA消化成一定大小的片段，用瓊脂糖凝膠電泳分離消化片段，再用毛細(xì)管轉(zhuǎn)移等方法將變性的DNA片段轉(zhuǎn)移到雜交膜上，最后用標(biāo)記探針對固定在雜交膜上的DNA進(jìn)行雜交，通過放射自顯影等方法顯示消化產(chǎn)物中與標(biāo)記探針序列互補(bǔ)的目的條帶。Southern雜交法由英國Southern氏建立，是最常用的高級分子生物學(xué)技術(shù)之一，并在此基礎(chǔ)上衍生出檢測mRNA的Northern雜交法和檢測蛋白多肽的Western雜交法。Southern雜交分析的用途很廣，主要用于基因組DNA消化片段、相互關(guān)系及長度多樣性分析，轉(zhuǎn)基因生物基因組中外源基因整合及整合位點(diǎn)的鑒定，以及基因操作過程中復(fù)雜基因構(gòu)件的分析鑒定。二、實(shí)驗(yàn)材料純化的基因組DNA三、溶液和緩沖液限制性內(nèi)切酶及其緩沖液TAE電泳液：50×貯存液，pH約8.5：Tris堿242g冰醋酸57.1mLNa2EDTA·2H2O37.2g加H2O至1000mL1×工作液：40mmol/LTris·Ac2mmol/LEDTA1mg/mLBSA（可選）DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)6×DNA加樣液TE緩沖液（pH8.0）溴化乙錠染色液0.2mol/L鹽酸溶液DNA變性液：1.5mol/LNaCl0.5mol/LNaOH中和液：1.5mol/LNaCl0.5mol/LTris（pH7.4）20×SSC10%SDS預(yù)雜交/雜交液放射性標(biāo)記探針雜交膜洗滌液四、儀器設(shè)備及耗材水浴箱，水平電泳槽，電泳儀，玻璃或塑料盤，Whatman3MM或同等濾紙，雜交尼龍膜，水浴搖床，手提式放射性檢測儀，X-光膠片及顯影暗盒，EP離心管，微量移液器及吸頭等。五、實(shí)驗(yàn)方法1．在EP離心管中建立下列消化反應(yīng)：基因組DNA20g10緩沖液5LEcoRI酶100U去離子水至50LEP離心管經(jīng)短暫離心后，在37℃水浴中孵育4～8h。將對于標(biāo)準(zhǔn)的Southern交來說，每凝膠孔的加樣量約為10g基因組DNA，考慮到消化過程中需進(jìn)行電泳檢查等因素，每消化反應(yīng)需用約20gDNA。反應(yīng)體系的體積應(yīng)適當(dāng)大些，以便基因組DNA充分溶解，必要時可用酒精沉淀消化產(chǎn)物，然后溶于20L左右的TE緩沖液中?；蚪MDNA是否消化完全除與限制酶的用量（一般為5U/gDNA）有關(guān)外，還與消化時間有關(guān)，一般采取少用酶延長消化時間的方法。2．制備0.7%瓊脂糖凝膠，在較低電壓（≤1V/cm膠）下電泳分離消化的DNA片段。3．電泳結(jié)束后，取出凝膠，并進(jìn)行溴化乙錠染色。4．如果消化后的DNA片段大于15kb，將凝膠在0.2mol/L鹽酸溶液中浸泡30min，以便提高DNA片段的轉(zhuǎn)移效率。小于15kb的DNA片段不需處理。凝膠浸泡于10倍體積的DNA變性液中，在室溫和緩慢搖動下變性45min。上述凝膠取出，經(jīng)去離子水短暫漂洗后浸泡于10倍體積的中和液中，在室溫和緩慢搖動下中和30min，然后改換新鮮中和液，繼續(xù)中和15min。剪取一塊較凝膠略大的電中性尼龍膜，將其漂浮在一盤去離子水的液面，直至由下而上完全濕潤，然后再在轉(zhuǎn)移液中浸泡5min以上。為了便于位置和方向的辨認(rèn)，通常將膜及凝膠的同一角切去一個同樣大小的缺口。凝膠中DNA向雜交膜的轉(zhuǎn)移有電轉(zhuǎn)移法和毛細(xì)管轉(zhuǎn)移法。后者是較為經(jīng)典的方法，有朝上和朝下轉(zhuǎn)移之分。朝上轉(zhuǎn)移的操作如下：取一個較大的玻璃或塑料盒，中間以一塊玻璃板為橋，盒中加以適量的10×SSC，將一張濾紙與玻璃橋板呈十字形交叉放置，兩端浸入轉(zhuǎn)移液中，用吸管吸取轉(zhuǎn)移液將濾紙澆濕，并用吸管趕去濾紙與玻璃板之間的氣泡。將上述凝膠（操作步驟6）反轉(zhuǎn)置于玻璃板上濕潤的濾紙上，凝膠的四周圍以一層塑料薄膜或用過的X-光膠片條（與凝膠重疊3～5mm），用吸管吸取轉(zhuǎn)移液使凝膠濕潤，將上述尼龍膜（步驟7）放在凝膠上，再將轉(zhuǎn)移液飽和的4片濾紙放在膜的上面。在上述操作過程中，應(yīng)用吸管趕去濾紙-凝膠-尼龍膜-濾紙之間的氣泡。最后將5～8cm高的一疊吸水紙巾置于濕潤濾紙上，上面放置一塊玻璃板，板上壓以約400g重的物體（圖5-2），在室溫下轉(zhuǎn)移過夜。轉(zhuǎn)移結(jié)束后，按與上述相反的步驟拆去轉(zhuǎn)印裝置，對轉(zhuǎn)移后的凝膠可進(jìn)行染色，以判定DNA是否轉(zhuǎn)移完全。頂部重物頂部重物吸水紙巾吸水紙巾凝膠濾紙凝膠濾紙濾紙橋尼龍膜濾紙橋尼龍膜轉(zhuǎn)印液轉(zhuǎn)印液支持物支持物圖5-2DNA從凝膠向尼龍膜轉(zhuǎn)移示意圖圖5-2DNA從凝膠向尼龍膜轉(zhuǎn)移示意圖DNA與尼龍膜結(jié)合的方法有烘烤法和紫外交聯(lián)法。前者先將尼龍膜在室溫的6×SSC中浸泡1min，在吸水紙上晾干后，夾在兩層濾紙的中間，在80℃真空烘烤爐中烘烤1～2h；后者的做法是將潮濕的尼龍膜置于一張濾紙上，在254nm波長紫外光下照射3～5min。將交聯(lián)后的尼龍膜在6xSSC中浸泡2min后，即可以進(jìn)行雜交，也可包裝后保存?zhèn)溆?，將上述尼龍膜送入雜交管內(nèi)（DNA面向管腔），如多張尼龍膜在同一管內(nèi)同時雜交，其間可用塑料羅衣（mesh）隔開。向管內(nèi)加入預(yù)熱的預(yù)雜交液，用量約為0.1mL/cm2膜，蓋緊管蓋，檢查無滲漏現(xiàn)象，然后在預(yù)熱至68℃的雜交爐中預(yù)雜交1～～2h。將放射性同位素標(biāo)記探針煮沸5min，并在冰浴中冷卻2min。從雜交爐中取出雜交管，打開管蓋，小心地加入變性探針，蓋緊管蓋，檢查無滲漏現(xiàn)象，繼續(xù)雜交過夜。雜交結(jié)束后，從雜交爐中取出雜交管，打開管蓋，倒出雜交液，借助鑷子將尼龍膜轉(zhuǎn)移到裝有數(shù)百毫升0.5%SDS/2×SSC的容器內(nèi)，在水平轉(zhuǎn)臺上和室溫下緩慢洗滌5min。將上述尼龍再用室溫的0.1%SDS/2×SSC洗滌15min。向雜交管內(nèi)加入預(yù)熱至65℃的0.1%SDS/0.1×SSC（約1mL/cm2膜），用鑷子將尼龍膜轉(zhuǎn)移到雜交管內(nèi)，在65℃雜交爐內(nèi)洗滌30～60min。在洗滌過程中，可用手提式放射性檢測儀測定膜上的放射活性，估計洗滌的具體時間或是否需要繼續(xù)洗滌。洗滌結(jié)束后，取出尼龍膜，經(jīng)室溫的0.1×SSC短暫漂洗后，用吸水紙吸去多余液體，再用塑料薄膜包裹，并作必要標(biāo)記，然后在暗室內(nèi)放入裝有X-光膠片的暗盒內(nèi)，蓋緊暗盒，放入黑色塑料袋內(nèi)，在-70℃冰箱內(nèi)暴光16～24min（根據(jù)雜交信號強(qiáng)弱而定）。在暗室內(nèi)打開暗盒，用常規(guī)方法沖洗膠片，晾干后便可進(jìn)行結(jié)果觀察與記錄。注意：在用放射性同位素標(biāo)記探針進(jìn)行核酸雜交實(shí)驗(yàn)過程中，必須嚴(yán)格遵守相關(guān)的操作規(guī)程，并采取必要的自身防護(hù)措施。基本的防護(hù)措施包括對操作者進(jìn)行相關(guān)知識和技能的培訓(xùn)，在專用房間和防護(hù)屏風(fēng)后操作，帶防護(hù)手套，將一切污染廢棄物存放于專用容器內(nèi)，操作后用放射性檢測儀檢查操作臺面、地面、移液器和自身手臂等處有無放射性污染，一旦發(fā)現(xiàn)應(yīng)按規(guī)定的去污染程序進(jìn)行妥善處理，并堅持使用記錄。六、作業(yè)與思考題1．參考相關(guān)書籍或文獻(xiàn)，談?wù)劵蚪MDNA消化時應(yīng)注意哪些事項(xiàng)？2．在轉(zhuǎn)印前，凝膠中的DNA為什么要進(jìn)行變性處理？3．參考相關(guān)書籍，談?wù)勲娹D(zhuǎn)移和毛細(xì)管轉(zhuǎn)移的優(yōu)缺點(diǎn)。4．怎樣進(jìn)行放射性防護(hù)和去污染？實(shí)驗(yàn)五Northern雜交分析一、原理和用途Northern雜交的基本原理和程序與Southern雜交類似，其基本過程包括RNA的提取、瓊脂糖凝膠電泳分離、從凝膠向?yàn)V膜的轉(zhuǎn)移、與濾膜的結(jié)合、雜交及信號顯示。Northern雜交主要用來檢測真核基因的轉(zhuǎn)錄水平、轉(zhuǎn)錄子的分子量及相對豐度。由于轉(zhuǎn)錄是基因表達(dá)的首要步驟，因此Northern雜交是研究真核細(xì)胞基因（包括導(dǎo)入的外源基因）表達(dá)的強(qiáng)有力手段。值得主要的是，RNA（特別是mRNA）極易降解，而RNA酶不僅無處不在，而且很難消除，所以在操作過程中必須采取必要的措施，包括使用專門準(zhǔn)備的用具、試劑和溶液等，所有溶液盡量用DEPC（RNA酶滅活劑）處理后高壓消毒的高質(zhì)量去離子水配制，操作人員必須帶防護(hù)手套（手汗中含有大量的RNA酶）。二、實(shí)驗(yàn)材料提取的RNA樣品。三、溶液與緩沖液1．放射性同位素標(biāo)記探針2．RNA加樣液3．0.05mol/LNaOH4．亞甲藍(lán)染色液5．預(yù)雜交/雜交液6．20×SSC7．6×SSC8．10%SDS（V/V）9．1%SDS/0.2×SSC10．0.1%SDS/1×SSC11．0.1%SDS/0.5×SSC四、儀器設(shè)備及耗材Whatman3MM濾紙或同等濾紙，吸水紙，干烤消毒玻璃器皿，塑料小盒，水平旋轉(zhuǎn)臺，真空烘烤爐，電中性尼龍膜，水浴箱，