體外分析技術(shù)詳解

體外分析技術(shù)詳解演示文稿當(dāng)前1頁(yè)，總共62頁(yè)。（優(yōu)選）體外分析技術(shù)當(dāng)前2頁(yè)，總共62頁(yè)?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)的發(fā)展

疾病診斷的革新可在沒(méi)有任何臨床癥狀，而病人體內(nèi)發(fā)生1.基因表達(dá)異常；2.受體分布異常或受體功能改變；3.器官代謝異常；4.激素水平異常酶、神經(jīng)遞質(zhì)……等異常，可早期發(fā)現(xiàn)。體外分析和影像學(xué)的發(fā)展起了很大作用例如癌癥的早期診斷當(dāng)前3頁(yè)，總共62頁(yè)。Berson&Yalow1960年美國(guó)的Berson和Yalow將核技術(shù)與免疫學(xué)技術(shù)結(jié)合建立了放射免疫分析法。首先用于測(cè)定血漿胰島素濃度，由于該法對(duì)醫(yī)學(xué)的巨大貢獻(xiàn)，1977年Yalow獲得了NobelPrize。YalowBersonHistoryreviewRadioimmunoassay當(dāng)前4頁(yè)，總共62頁(yè)。放射免疫分析法的創(chuàng)立

集中了放射性核素示蹤技術(shù)的高靈敏度和免疫發(fā)應(yīng)的高特異性開(kāi)創(chuàng)了醫(yī)學(xué)生物學(xué)超微量分析方法使人體內(nèi)微量生物活性物質(zhì)的測(cè)量成為可能對(duì)現(xiàn)代醫(yī)學(xué)的發(fā)展起到推動(dòng)作用當(dāng)前5頁(yè)，總共62頁(yè)。R：放射性核素標(biāo)記抗原高靈敏（10-9~-15g/ml）探測(cè)待測(cè)物上的標(biāo)記信號(hào)(標(biāo)記物的放大效應(yīng))I：免疫學(xué)反應(yīng)高特異以抗體為結(jié)合劑B:標(biāo)記抗原與非標(biāo)記抗原競(jìng)爭(zhēng)與同種抗體結(jié)合當(dāng)前6頁(yè)，總共62頁(yè)。定義體外分析技術(shù)是以放射核素標(biāo)記（或其他非放射性標(biāo)記）的配體為示蹤劑，以配體和結(jié)合體的結(jié)合反應(yīng)為基礎(chǔ)，在試管內(nèi)進(jìn)行的微量生物活性物質(zhì)的檢測(cè)技術(shù)。當(dāng)前7頁(yè)，總共62頁(yè)。體外分析技術(shù)是結(jié)合了放射性核素的高靈敏度和特異性結(jié)合反應(yīng)的高特異性的一種超微量分析技術(shù)，具有靈敏度高、特異性強(qiáng)、精密度好、應(yīng)用面廣、方法簡(jiǎn)便等優(yōu)點(diǎn)。當(dāng)前8頁(yè)，總共62頁(yè)。體外分析技術(shù)定量手段放射性測(cè)量技術(shù)酶定量技術(shù)化學(xué)發(fā)光定量技術(shù)當(dāng)前9頁(yè)，總共62頁(yè)。生物學(xué)基礎(chǔ)特異性結(jié)合反應(yīng)：抗原-抗體的免疫結(jié)合反應(yīng)；配基-受體的結(jié)合反應(yīng)；底物-催化酶之間的酶促反應(yīng)；結(jié)合體：抗原--抗體激素--激素結(jié)合球蛋白受體--配體當(dāng)前10頁(yè)，總共62頁(yè)。體外分析技術(shù)體外放射分析體外非放射分析放射性競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合分析放射性非競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合分析放射免疫分析(RIA)免疫放射分析酶免疫分析化學(xué)發(fā)光免疫分析熒光免疫分析(IRMA)(EIA)(CLIA)(FIA)當(dāng)前11頁(yè)，總共62頁(yè)。

早期的放射免疫技術(shù)是基于競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合反應(yīng)原理的放射免疫分析(RIA)，稍后又發(fā)展了非競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合的免疫放射分析(IRMA)。該類(lèi)技術(shù)具有靈敏度高、特異性強(qiáng)、重復(fù)性好、樣品及試劑用量少、操作簡(jiǎn)便且易于標(biāo)準(zhǔn)化等優(yōu)點(diǎn)，廣泛應(yīng)用于生物醫(yī)學(xué)研究和臨床診斷領(lǐng)域中各種微量蛋白質(zhì)、激素、小分子藥物和腫瘤標(biāo)志物的定量分析，對(duì)相關(guān)學(xué)科的發(fā)展起到了極大地推動(dòng)作用。

當(dāng)前12頁(yè)，總共62頁(yè)。放射免疫分析法

在體外條件下,利用Ag與定量的*Ag對(duì)限量的特異性Ab的競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合反應(yīng)，通過(guò)測(cè)定放射性復(fù)合物的量來(lái)計(jì)算出Ag量的一種超微量分析技術(shù)。當(dāng)前13頁(yè)，總共62頁(yè)?；驹鞟g-Ab+Ag*AgAbAg++*Ag-Ab+

*Ag(B)(F)*Ag與Ag免疫活性相同*Ag＋Ag>

AbAg=*Ag,AgAb=*AgAbAg>*Ag,AgAb>*AgAb

Ag<*Ag,AgAb<*AgAb

當(dāng)前14頁(yè)，總共62頁(yè)。Ag*AgAb*AgAbAgAb*Ag++++++++++++++++++++當(dāng)前15頁(yè)，總共62頁(yè)。Ag2550100200400800定量*Ag定量AbB%=B/(B+F)B1%B2%B3%B4%B5%B6%123456濃度+當(dāng)前16頁(yè)，總共62頁(yè)。B%標(biāo)準(zhǔn)曲線當(dāng)前17頁(yè)，總共62頁(yè)。常用的有B%（B/B+F)，B/F，F(xiàn)/B，B0/B等這些反應(yīng)變量都可以用作縱坐標(biāo)來(lái)對(duì)應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)抗原的濃度作標(biāo)準(zhǔn)曲線，選用的反應(yīng)變量不同，標(biāo)準(zhǔn)曲線的形狀也不同。但是這些標(biāo)準(zhǔn)曲線都是反映的反應(yīng)變量對(duì)應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)抗原濃度變化而變化的函數(shù)關(guān)系。當(dāng)前18頁(yè)，總共62頁(yè)。當(dāng)前19頁(yè)，總共62頁(yè)。操作基本步驟加樣：加樣總體積要保持一致，所處的介質(zhì)環(huán)境也要一致。孵育：根據(jù)不同的分析對(duì)象孵育的溫度和時(shí)間不同，一般是37℃。分離：選擇好的分離方法分離游離抗原和抗原－抗體復(fù)合物。測(cè)量：測(cè)量游離或結(jié)合物部分的放射性。數(shù)據(jù)處理：繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線和待測(cè)物濃度的計(jì)算。當(dāng)前20頁(yè)，總共62頁(yè)?；痉椒ɑ驹噭?.抗體2.標(biāo)記抗原3.非標(biāo)記標(biāo)準(zhǔn)抗原（標(biāo)準(zhǔn)品）當(dāng)前21頁(yè)，總共62頁(yè)。當(dāng)前22頁(yè)，總共62頁(yè)。2.標(biāo)記抗原1）比活度和放化純度足夠高比活度——每微克抗原上標(biāo)記放射性核素的千貝可數(shù)（KBq/μg）放化純度——具有免疫活性的標(biāo)記抗原占總放射性的百分?jǐn)?shù)。>90%2）半衰期足夠長(zhǎng)3）保持原有抗原的特性大分子：125I小分子：3Hor125I當(dāng)前23頁(yè)，總共62頁(yè)。放射免疫技術(shù)－常用的放射性核素

125I

3H射線γβ理化性活潑差核素豐度>90%－半衰期60.2d12.3y標(biāo)記方法簡(jiǎn)單復(fù)雜標(biāo)記設(shè)備低廉昂貴測(cè)量條件簡(jiǎn)單復(fù)雜常用標(biāo)記核素當(dāng)前24頁(yè)，總共62頁(yè)。125碘-標(biāo)記物的制備－標(biāo)記125I-化學(xué)或酶促反應(yīng)，將放射性負(fù)電碘離子氧化成碘原子或正電碘離子，通過(guò)取代反應(yīng)置換被標(biāo)記物分子上的氫原子。125I或125I+125I-標(biāo)記物（混合物）Ch-T、LPO氧化取代反應(yīng)放射免疫技術(shù)－標(biāo)記物制備當(dāng)前25頁(yè)，總共62頁(yè)。125碘-標(biāo)記物的制備－純化凝膠過(guò)濾法離子交換層析法

聚丙烯酰胺凝膠電泳

高效液相色譜法

聚合、損傷物標(biāo)記蛋白游離125I當(dāng)前26頁(yè)，總共62頁(yè)。3.非標(biāo)記抗原（標(biāo)準(zhǔn)品）化學(xué)結(jié)構(gòu)、免疫活性與被測(cè)抗原相同高純度當(dāng)前27頁(yè)，總共62頁(yè)。B和F的分離1.第一類(lèi)2.第二類(lèi)雙抗體沉淀法固相第二抗體法（洗滌）+AgAb(1)Ab(2)Ab(2)Ab(1)Ag可溶性復(fù)合物可沉淀復(fù)合物試管試管當(dāng)前28頁(yè)，總共62頁(yè)。分離方法的要求分離完全、快速。不影響免疫反應(yīng)的平衡，即是要求在分離過(guò)程中不使抗原-抗體復(fù)合物解離或形成新的復(fù)合物。受環(huán)境因素（溫度、pH值等）的影響小。操作簡(jiǎn)便，分離劑來(lái)源豐富、價(jià)廉。當(dāng)前29頁(yè)，總共62頁(yè)。測(cè)量、數(shù)據(jù)處理晶體閃爍計(jì)數(shù)器包括了NaI閃爍晶體、光電倍增管以及計(jì)數(shù)器測(cè)量的放射性信號(hào)是儀器輸出的電脈沖數(shù)：每分鐘計(jì)數(shù)(cpm)

計(jì)算參數(shù)cpmB/T(%)F/T(%)B/F(%)B/B0(%)擬合注：T即是B與F的總和當(dāng)前30頁(yè)，總共62頁(yè)。RIA小結(jié)靈敏度高特異性好精確的定量方法操作簡(jiǎn)便當(dāng)前31頁(yè)，總共62頁(yè)。免疫放射分析法*Ab+Ag-*Ab

+

*Ab（IRMA）B%Ag（B）（F）在體外,利用Ag與過(guò)量的*Ab的非競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合反應(yīng)，通過(guò)測(cè)定放射性復(fù)合物的量來(lái)計(jì)算出Ag量。標(biāo)記抗體，抗體是過(guò)量的。當(dāng)前32頁(yè)，總共62頁(yè)。IRMA與RIA工作原理的主要區(qū)別RIAIRMA競(jìng)爭(zhēng)性抗原抗體結(jié)合反應(yīng)非競(jìng)爭(zhēng)性抗原抗體結(jié)合反應(yīng)采用標(biāo)記抗原采用標(biāo)記抗體三種主要反應(yīng)試劑二種主要反應(yīng)試劑所用抗體是限量的所用抗體是過(guò)量的*AgAb的量與待測(cè)Ag的量呈負(fù)相關(guān)Ag*Ab的量與待測(cè)Ag的量呈正相關(guān)反應(yīng)到達(dá)平衡慢反應(yīng)到達(dá)平衡快非特異結(jié)合主要影響高劑量區(qū)非特異結(jié)合主要影響低劑量區(qū)低劑量區(qū)有不確定因素低劑量區(qū)無(wú)不確定因素當(dāng)前33頁(yè)，總共62頁(yè)。單位點(diǎn)IRMA先用過(guò)量標(biāo)記抗體與待測(cè)抗原進(jìn)行反應(yīng)，形成抗原抗體復(fù)合物；用固相抗原結(jié)合未結(jié)合標(biāo)記抗體并將其分離,測(cè)定上清液的放射量當(dāng)前34頁(yè)，總共62頁(yè)。雙位點(diǎn)IRMA先用固相抗體與抗原結(jié)合，再用過(guò)量的標(biāo)記抗體與抗原的另一決定簇結(jié)合，形成固相抗體-抗原-標(biāo)記抗體復(fù)合物，洗棄剩余標(biāo)記抗體，測(cè)固相上放射性。當(dāng)前35頁(yè)，總共62頁(yè)。B%B%擬合的標(biāo)準(zhǔn)曲線擬合的NSB擬合的標(biāo)準(zhǔn)曲線擬合的NSBIRMA的標(biāo)準(zhǔn)曲線及非特異結(jié)合曲線RIA的標(biāo)準(zhǔn)曲線及非特異結(jié)合曲線當(dāng)前36頁(yè)，總共62頁(yè)。放射免疫分析技術(shù)的靈敏度高、特異性強(qiáng)、精密度好,常用于各種激素、微量蛋白質(zhì)、腫瘤標(biāo)志物和藥物等微量物質(zhì)的測(cè)定。但由于放射污染和危害，常用核素半衰期短，試劑盒穩(wěn)定期不長(zhǎng)等諸多不足,RIA將逐漸被取代。放射免疫分析技術(shù)的應(yīng)用當(dāng)前37頁(yè)，總共62頁(yè)。非放射性標(biāo)記免疫分析技術(shù)酶標(biāo)記免疫分析技術(shù)化學(xué)發(fā)光免疫分析技術(shù)時(shí)間分辨熒光免疫分析技術(shù)當(dāng)前38頁(yè)，總共62頁(yè)。酶標(biāo)記免疫分析技術(shù)

用酶分子代替放射性核素標(biāo)記抗原或抗體，進(jìn)行競(jìng)爭(zhēng)性或非競(jìng)爭(zhēng)性免疫分析的技術(shù)。其中應(yīng)用最多的就是酶聯(lián)免疫吸附分析法（ELISA）。是結(jié)合了抗原抗體高特異性和酶促反應(yīng)的高敏感性的檢測(cè)技術(shù)。當(dāng)前39頁(yè)，總共62頁(yè)。ELISA方法是用酶分子標(biāo)記抗體，進(jìn)行與IRMA相似的夾心法免疫反應(yīng)，反應(yīng)結(jié)束后分離結(jié)合部分和游離部分，利用結(jié)合部分上的酶分子的催化活性將底物轉(zhuǎn)化為特定的顏色，用分光光度計(jì)測(cè)定，顏色的深淺和酶量成正比，而酶量又和復(fù)合物的量成正比。

常用的酶是辣根過(guò)氧化物酶，底物是四甲基聯(lián)苯胺(TMB)，反應(yīng)后顯黃色。當(dāng)前40頁(yè)，總共62頁(yè)?；瘜W(xué)發(fā)光免疫分析技術(shù)化學(xué)發(fā)光免疫分析技術(shù)是以化學(xué)發(fā)光物質(zhì)代替放射性核素作為示蹤物的超微量分析技術(shù)?；瘜W(xué)發(fā)光物質(zhì)在氧化劑或催化劑的作用下能形成激發(fā)態(tài)產(chǎn)物，并在退激時(shí)將能量轉(zhuǎn)化為光子的物質(zhì)。當(dāng)前41頁(yè)，總共62頁(yè)。1.化學(xué)發(fā)光免疫分析是用化學(xué)發(fā)光物質(zhì)作為標(biāo)記物，標(biāo)記抗原或抗體，反應(yīng)以后，利用堿性條件下化學(xué)發(fā)光物質(zhì)在氧化物作用下可以發(fā)生單光子放射。檢測(cè)光子的數(shù)量就可以反映復(fù)合物的量。常用的化學(xué)發(fā)光物質(zhì)是異魯米那和吖啶酯。

當(dāng)前42頁(yè)，總共62頁(yè)。2.化學(xué)發(fā)光酶免疫分析和ELISA相似，用堿性磷酸酶標(biāo)記抗體，經(jīng)夾心法免疫反應(yīng)后，帶有酶的復(fù)合物作用于特殊的底物--金剛烷，使底物發(fā)射出光子。此法光子發(fā)射持續(xù)時(shí)間較長(zhǎng)，可靠性比較好。當(dāng)前43頁(yè)，總共62頁(yè)。時(shí)間分辨熒光免疫分析技術(shù)

（time-resolvedfluoroimmunoassay）時(shí)間分辨熒光免疫分析采用稀土元素標(biāo)記抗體，利用時(shí)間分辨熒光儀特定的延遲時(shí)間測(cè)量，獲得稀土元素的特異熒光信號(hào)，同時(shí)消除非特異性熒光物質(zhì)的干擾。當(dāng)前44頁(yè)，總共62頁(yè)。標(biāo)記物為具有獨(dú)特?zé)晒馓匦缘?/p>

稀土金屬—鑭系元素鑭系元素共有15種，應(yīng)用在時(shí)間分辨熒光免疫技術(shù)種有四種釤（Sm），銪（Eu），鏑（Dy），鋱（Te）鑭系元素?zé)晒庵匾攸c(diǎn)：1.極長(zhǎng)的熒光衰退時(shí)間銪：730000ns，釤：50000ns，一般熒光物質(zhì)：10ns2.200nm的Stokes位移銪：激發(fā)光340nm，發(fā)射光613nm熒光素的Stokes位移為273nm3.狹窄的發(fā)射峰4.解離-增強(qiáng)技術(shù)可使其熒光性提高100萬(wàn)倍當(dāng)前45頁(yè)，總共62頁(yè)。時(shí)間分辨熒光免疫分析技術(shù)

（time-resolvedfluoroimmunoassay）基本原理鑭系元素（15）：銪（Eu），釤（Sm），鏑（Dy），鋱（Te）Eu+EuEu+增強(qiáng)液+Eu“解離增強(qiáng)鑭系熒光免疫分析”當(dāng)前46頁(yè)，總共62頁(yè)。時(shí)間分辨熒光檢測(cè)的基本原理示意圖熒光衰退時(shí)間銪：730000ns釤：50000ns一般熒光物質(zhì)：10ns銪的熒光當(dāng)前47頁(yè)，總共62頁(yè)。TrFIA的特點(diǎn)1.最大限度提高測(cè)量方法的靈敏度2.有與RIA相似的特異性和精密度3.可同時(shí)測(cè)定兩種以上的抗原4.無(wú)輻射污染當(dāng)前48頁(yè)，總共62頁(yè)。質(zhì)量控制就是使用合適的方法以檢查、表示和消除來(lái)自試劑藥盒和測(cè)量體系的誤差，并使這種誤差降低到某一允許水平。具體作用有：1．檢查誤差的程度，決定測(cè)定結(jié)果的取舍。2．識(shí)別誤差的來(lái)源并消除其原因。3．改進(jìn)測(cè)定方法的設(shè)計(jì)以提高質(zhì)量。

體外標(biāo)記免疫分析的質(zhì)量控制當(dāng)前49頁(yè)，總共62頁(yè)。1.精密度（precision）同一測(cè)定方法在同樣下對(duì)檢測(cè)樣品進(jìn)行多次重復(fù)測(cè)定時(shí)，所得測(cè)定結(jié)果之間的一致性

變異系數(shù)（CV）一般要求變異系數(shù)15%~20%2.準(zhǔn)確度（accuracy）準(zhǔn)確度=（測(cè)定值-真實(shí)值）/真實(shí)值×100%當(dāng)前50頁(yè)，總共62頁(yè)。3.靈敏度（sensitivity）方法的最小可測(cè)量，即在待測(cè)樣品中能夠檢出靶物質(zhì)的最小濃度6.穩(wěn)定性（stability）使用期內(nèi)測(cè)定結(jié)果具有連續(xù)性和可比性，性質(zhì)穩(wěn)定4.特異性（specificity）

反映分析方法中所用抗體對(duì)被測(cè)物質(zhì)的專(zhuān)一性當(dāng)前51頁(yè)，總共62頁(yè)?？偨Y(jié)

體外分析的發(fā)展方法設(shè)計(jì)的改變：競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合分析非競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合分析，代表方法是免疫放射分析標(biāo)記物的改變：放射性核素?zé)晒?、酶、化學(xué)發(fā)光、稀土元素結(jié)合體的改變當(dāng)前52頁(yè)，總共62頁(yè)。

微生物——RMA酶——REA

受體