檢驗(yàn)課件13.臨床微生物

臨床病原體檢驗(yàn)首都醫(yī)科大學(xué)宣武醫(yī)院檢驗(yàn)科閔嶸教學(xué)大綱目的要求1.掌握臨床細(xì)菌檢查的一般方法和標(biāo)本的正確采集和運(yùn)送方法。2.熟悉細(xì)菌學(xué)報(bào)告的臨床應(yīng)用。3.了解臨床細(xì)菌檢驗(yàn)和藥物敏感性試驗(yàn)的主要方法4.了解臨床病毒學(xué)檢驗(yàn)的基本知識(shí)

當(dāng)今感染性疾病的流行病學(xué)特點(diǎn)新傳染病陸續(xù)被發(fā)現(xiàn)（O157出血性腸炎、艾滋病、SARS、瘋牛病、艾博拉病、寨卡等三十余種）業(yè)已減少的老傳染病死灰復(fù)燃（結(jié)核、梅毒、霍亂）多重耐藥菌的出現(xiàn)，導(dǎo)致抗感染治療的困難。器官移植，抗腫瘤放、化療降低免疫力使醫(yī)院感染和條件致病菌感染增加。人們對(duì)新傳染病認(rèn)識(shí)和準(zhǔn)備不足，人群對(duì)其尚無免疫力，人類活動(dòng)范圍增大，使感染性疾病傳播快，范圍廣，危害大。臨床細(xì)菌學(xué)檢驗(yàn)細(xì)菌簡(jiǎn)介細(xì)菌學(xué)檢查的常用方法細(xì)菌學(xué)檢查的標(biāo)本采集藥敏試驗(yàn)原理及方法一、細(xì)菌簡(jiǎn)介細(xì)菌（bacterium）：是屬原核生物界的一種單細(xì)胞微生物.廣義細(xì)菌：

包括細(xì)菌、放線菌、支原體、衣原體、立克次體、螺旋體狹義細(xì)菌：

專指其中數(shù)量最大、種類最多、具有典型代表性的細(xì)菌

細(xì)菌的大小與形態(tài)一般以微米(m)為大小單位基本形態(tài)三種：球菌；桿菌；螺形菌1.球菌：球形或近似球形，直徑0.8~1.2μm單球菌雙球菌八疊球菌四聯(lián)球菌鏈球菌葡萄球菌大桿菌（炭疽桿菌）小桿菌球桿菌中等大桿菌（大腸桿菌）2.桿菌桿狀，各種桿菌大小、長(zhǎng)短與粗細(xì)差異較大3.

螺形菌菌體彎曲（分弧菌、螺菌和螺桿菌）弧菌螺菌螺桿菌社區(qū)性感染與醫(yī)院內(nèi)感染

社區(qū)性感染醫(yī)院內(nèi)感染病原菌類型多為致病菌多為條件致病菌或非致病菌致病力強(qiáng)弱耐藥株少見大多耐藥，且為多重耐藥宿主免疫情況正常/稍減低低下疾病癥狀特點(diǎn)典型不典型預(yù)后病程短，一般無遺留病程遷延，好轉(zhuǎn)緩慢或潛伏二、細(xì)菌學(xué)檢查的常用方法制作涂片和染色、觀察形態(tài)。（常用革蘭氏染色、抗酸染色）培養(yǎng)鑒定及藥物敏感試驗(yàn)。免疫學(xué)檢查分子生物學(xué)細(xì)菌感染的檢查方法染色法革蘭染色法：結(jié)晶紫碘液95%乙醇復(fù)紅抗酸染色：石炭酸復(fù)紅3%鹽酸酒精美蘭其它特殊染色革蘭陽性

革蘭陰性抗酸染色1min1min脫色5min脫色普通光學(xué)顯微鏡

普通光學(xué)顯微鏡的分辨率為0.25um。一般細(xì)菌都大于0.25um，故可用普通光學(xué)顯微鏡觀察。革蘭氏染色的應(yīng)用

1、革蘭陽性細(xì)菌：不被乙醇脫色仍保留紫色為革蘭陽性菌(G+菌)，如葡萄球菌、鏈球菌等。

2、革蘭陰性細(xì)菌：若被乙醇脫色后再被復(fù)染成紅色者，為革蘭陰性菌(G-菌)，如大腸埃希菌、傷寒沙門菌、腦膜炎奈瑟菌、淋病奈瑟菌等。病例患者劉××，男，21歲，11月15日發(fā)熱（>38oC）劇烈頭痛、16日出現(xiàn)噴射狀嘔吐，到我院急診科就診，下午出現(xiàn)語言不清。3年前有顱底骨折，腦脊液鼻漏病史。行腰椎穿刺取腦脊液送檢驗(yàn)科：常規(guī)WBC：3240×106/L、多核65%

生化蛋白150g/dl、糖1mg/dl細(xì)菌學(xué)檢查結(jié)果經(jīng)細(xì)胞離心機(jī)涂片，革蘭染色，可見大量革蘭氏陰性桿菌。培養(yǎng)鑒定結(jié)果：肺炎克雷伯菌藥敏結(jié)果：除氨芐西林耐藥外，其他抗生素都敏感，ESBL(-)。診斷化膿性腦膜炎判斷依據(jù)：腦脊液WBC計(jì)數(shù)及分類、生化確診依據(jù)：腦脊液中發(fā)現(xiàn)大量革蘭陰性桿菌治療：羅氏芬+依替米星電子顯微鏡電子顯微鏡的分辨率為1nm。不僅能看清細(xì)菌的外形，內(nèi)部超微結(jié)構(gòu)可一覽無余。肺炎鏈球菌莢膜莢膜分離培養(yǎng)①混濁生長(zhǎng)②沉淀生長(zhǎng)③表面生長(zhǎng)菌膜菌沉淀均勻渾濁對(duì)照1.在液體培養(yǎng)基中的生長(zhǎng)現(xiàn)象細(xì)菌在培養(yǎng)基中的生長(zhǎng)情況細(xì)菌在固體培養(yǎng)基中的生長(zhǎng)情況光滑型菌落粗糙型菌落粘液型菌落細(xì)菌的生化鑒定病例患者曾×，男，26歲，因高熱寒戰(zhàn)3日入院，后出現(xiàn)弛張熱，皮膚出血點(diǎn)，肝脾腫大，血像WBC22×109/L，核左移，有中毒顆粒，擬診敗血癥。于發(fā)冷時(shí)8次血培養(yǎng)均（-），使用萬古霉素+泰能治療一周無效。診斷會(huì)診后決定行骨髓培養(yǎng)發(fā)現(xiàn)似奴卡氏菌的硬菌落送中科院微生物所鑒定為金色莢膜鏈球菌，僅對(duì)磺胺敏感，改用磺胺治療一周出院。該菌為海產(chǎn)品感染引起，可引發(fā)瘋魚病?；颊卟∏叭茉鼋瘕堲~標(biāo)本，刺傷手指，發(fā)病時(shí)傷口已愈合。細(xì)菌鑒定的新技術(shù)質(zhì)譜技術(shù):質(zhì)譜分析是一種測(cè)量離子質(zhì)荷比（質(zhì)量-電荷比）的分析方法，其基本原理是使試樣中各組分在離子源中發(fā)生電離，生成不同荷質(zhì)比的帶電荷的離子，經(jīng)加速電場(chǎng)的作用，形成離子束，進(jìn)入質(zhì)量分析器。在質(zhì)量分析器中，再利用電場(chǎng)和磁場(chǎng)使發(fā)生相反的速度色散，將它們分別聚焦而得到質(zhì)譜圖，從而確定其質(zhì)量。16SrRNA為代表的分子生物學(xué)技術(shù)在細(xì)菌的16SrDNA中有多個(gè)區(qū)段保守性，根據(jù)這些保守區(qū)可以設(shè)計(jì)出細(xì)菌通用物，可以擴(kuò)增出所有細(xì)菌的16SrDNA片段，并且這些引物僅對(duì)細(xì)菌是特異性的，也就是說這些引物不會(huì)與非細(xì)菌的DNA互補(bǔ)，而細(xì)菌的16SrDNA可變區(qū)的差異可以用來區(qū)分不同的菌。因此，16SrDNA可以作為細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)分析最常用的系統(tǒng)進(jìn)化標(biāo)記分子。隨著核酸測(cè)序技術(shù)的發(fā)展，越來越多的微生物的16SrDNA序列被測(cè)定并收入國(guó)際基因數(shù)據(jù)庫中，這樣用16SrDNA作目的序列進(jìn)行微生物群落結(jié)構(gòu)分析更為快捷方便。病例

空間羅氏菌血流感染男性，37歲，因“間斷性發(fā)熱3個(gè)月”入院。多于夜間出現(xiàn)，體溫最高達(dá)39.8℃，偶有咳嗽，不伴寒戰(zhàn)，到北京某醫(yī)院胸片檢查未見異常，診斷為“上感”，給予頭孢類抗生素輸液治療后體溫降至正常。之后多次間斷出現(xiàn)體溫升高，給予抗炎及退熱治療效果欠佳。1個(gè)月前，患者出現(xiàn)眼部腫脹、牙痛、口唇腫痛及頭疼等癥狀，來我院就診，給予拉氧頭孢鈉抗炎治療后，患者仍間斷體溫升高。查體：主動(dòng)脈瓣區(qū)可聞及收縮期雜音，可觸及水沖脈，毛細(xì)血管搏動(dòng)征陰性。血常規(guī)示白細(xì)胞計(jì)數(shù)10.71×109/L，中性粒細(xì)胞計(jì)數(shù)8.51×109/L。CRP:96.50mg/L，ESR：59mm/h。心臟彩超示先天性心臟?。恢鲃?dòng)脈瓣關(guān)閉不全，主動(dòng)脈瓣二尖瓣化畸形，主動(dòng)脈瓣脫垂，主動(dòng)脈瓣反流。心臟MRI示主動(dòng)脈瓣返流，主動(dòng)脈瓣形態(tài)欠規(guī)則。胸部CT示雙側(cè)胸腔少量積液，心包少量積液。入院后每于發(fā)熱時(shí)抽取血培養(yǎng)（5次），其中3次需氧血培養(yǎng)陽性，涂片鏡檢為革蘭陽性桿菌，放線菌屬報(bào)告臨床；厭氧血培養(yǎng)均陰性。藥敏結(jié)果示青霉素、頭孢類、喹諾酮類、碳青酶烯類、四環(huán)素類、磺胺類、萬古霉素等抗菌藥物均為敏感。既往史：對(duì)磺胺類藥物過敏。臨床根據(jù)患者癥狀、體征及血培養(yǎng)結(jié)果，診斷為“菌血癥，感染性心內(nèi)膜炎？”，給予氨芐西林舒巴坦1.5gq8h治療，患者體溫降至正常，3天后體溫再次升高達(dá)38.5℃，抽血培養(yǎng)陰性，改為氨芐西林舒巴坦1.5gq6h治療2周，復(fù)查3次血培養(yǎng)陰性，出院。病例

空間羅氏菌血流感染病例1病原菌的鑒定1VITEKCOMPACT鑒定率低為麥?zhǔn)戏啪€菌、丙酸丙酸桿菌和小棒狀桿菌；2質(zhì)譜儀鑒定為空間羅氏菌（rothiaaeria）；316SrRNA鑒定為空間羅氏菌（aeriarothia）。病例16SrRNA鑒定細(xì)菌通用引物（1500bp）正向（27F）:5‘-AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3’,反向(1492R):5’-GGTTACCTTGTTACGACTT-3’BLAST程序比對(duì)，Rothiaaeria鑒定率為99%MEGA5.0軟件中NeighborJoining方法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，如下：RothiaaeriaGenbank：KF691779病例討論VITEK2Compact自動(dòng)化鑒定系統(tǒng)數(shù)據(jù)庫中只包含黏滑羅氏菌，已有的API試劑中的APICoryne試劑條僅能鑒定羅氏菌屬中的齲齒羅氏菌，因此造成了未能給出空間羅氏菌的鑒定結(jié)果。質(zhì)譜儀(MODI-TOF-MS)和16SrRNA可鑒定空間羅氏菌。16SrRNA序列測(cè)定體現(xiàn)不同菌屬之間的差異成為了理想的基因鑒定靶序列，為鑒定該菌較好的方法，是目前細(xì)菌分類和鑒定的重要手段。三、細(xì)菌學(xué)檢查的標(biāo)本采集基本原則（一）采集標(biāo)本前局部應(yīng)做好準(zhǔn)備工作，標(biāo)本必須直接采自病變部位。盡可能在合適的時(shí)間采集。例如：清晨的痰和尿液含菌量較多，故是采集的最佳時(shí)間。了解感染性疾病的自然過程有助于決定采集何種標(biāo)本及采集時(shí)間。必要的免疫學(xué)知識(shí)對(duì)解釋血清學(xué)結(jié)果十分有用。應(yīng)盡量采集足量的標(biāo)本送實(shí)驗(yàn)室。例如：成人的血培養(yǎng)標(biāo)本每次宜采集10ml以上?；驹瓌t（二）使用合適器械及運(yùn)送容器很重要，所有標(biāo)本都應(yīng)使用無菌容器；棉拭子常與運(yùn)送培養(yǎng)基配合使用，但棉拭子不宜用作厭氧菌培養(yǎng)。任何送厭氧培養(yǎng)的標(biāo)本應(yīng)做到在厭氧環(huán)境下運(yùn)送。培養(yǎng)標(biāo)本盡可能在應(yīng)用抗菌藥物前采集，解釋培養(yǎng)結(jié)果時(shí)也應(yīng)考慮抗菌藥物使用史。有些細(xì)菌如淋病奈瑟球菌、化膿性鏈球菌、流感嗜血桿菌、腦膜炎奈瑟球菌等對(duì)抗菌藥物非常敏感。對(duì)送檢標(biāo)本有特殊要求時(shí)，應(yīng)在化驗(yàn)單上清楚標(biāo)明，或直接與實(shí)驗(yàn)室聯(lián)系。常見標(biāo)本的采集和運(yùn)送要求：1.血液及骨髓 發(fā)熱初期或發(fā)熱高峰在抗菌藥物治療之前 5-10ml 1-4次/24h2.膿汁及病灶分泌物 及時(shí)送檢 3.痰 晨痰為好 漱口可減少口腔菌的污染4.咽拭子、鼻拭 晨起為好用藥之前 病變處5.尿 中段尿 ≤1h接種6.糞便 自然排便 可使用直腸拭子（肛拭）7.C.S.F 立即送檢（腦膜炎雙球菌離體后迅速自溶）不可低溫保存8.膽汁 無菌操作 立即送檢9.穿刺液、胸腹水、心包液、關(guān)節(jié)液等，及時(shí)送檢需氧和厭氧血培養(yǎng)瓶血培養(yǎng)標(biāo)本采集流程四、藥敏試驗(yàn)原理及方法1、藥敏試驗(yàn)概念：

藥敏試驗(yàn)：測(cè)定抗菌藥物在體外對(duì)病原微生物有無抑制作用的方法稱為藥物敏感性試驗(yàn)，簡(jiǎn)稱藥敏試驗(yàn)。

藥敏試驗(yàn)有的以最低抑菌濃度(MIC)、有的以最低殺菌濃度(MBC)作為判定結(jié)果的標(biāo)準(zhǔn)。

MIC：在與微生物生長(zhǎng)速率有關(guān)的特定時(shí)間間隔內(nèi)，通常是18－24小時(shí)，能夠抑制被測(cè)菌生長(zhǎng)的最低藥物濃度。2、藥敏試驗(yàn)的指征：⑴已查明的病原菌⑵為進(jìn)行細(xì)菌耐藥性檢測(cè)和了解本地區(qū)細(xì)菌耐藥性變遷⑶新抗菌藥物的藥效學(xué)評(píng)價(jià)，必須進(jìn)行藥敏測(cè)定，以獲得該藥的MIC50和MIC90，MBC50和MBC90等評(píng)價(jià)指標(biāo)。3、常用藥敏試驗(yàn)方法：⑴紙片擴(kuò)散法：將浸有抗菌藥物的紙片貼在涂有細(xì)菌的瓊脂平板上，抗菌藥物在瓊脂內(nèi)由紙片中心向四周擴(kuò)散，其濃度呈梯度遞減，因此在紙片周圍一定距離內(nèi)的細(xì)菌生長(zhǎng)受抑，經(jīng)過18~24小時(shí)的培養(yǎng)后形成抑菌圈，其直徑大小與藥物濃度的對(duì)數(shù)呈線形關(guān)系。判斷標(biāo)準(zhǔn)遵循CLSI折點(diǎn)標(biāo)準(zhǔn)。M-H平皿 直徑90mm瓊脂厚度4mmKB紙片法的操作步驟：⑵稀釋法：（MIC/MBC測(cè)定）以一定濃度的抗菌藥物與含有被試菌株的培養(yǎng)基進(jìn)行一系列不同倍數(shù)稀釋(通常為雙倍稀釋)，經(jīng)培養(yǎng)后觀察最低抑菌濃度。包括肉湯稀釋法和瓊脂稀釋法。⑶E-test法：將抗菌藥物按雙稀釋倍放置于5mm×50mm塑料載體上，操作步驟同瓊脂擴(kuò)散法（4）自動(dòng)化藥敏測(cè)定儀：基本原理-----利用光學(xué)測(cè)量法測(cè)定抗菌藥物對(duì)細(xì)菌的作用。幾種重要耐藥菌株檢測(cè)的臨床意義1.MRSA/MRSE/MRSCN（耐甲氧西林的…）2.VRE（耐萬古霉素的腸球菌）3.PRSP（耐青霉素的肺炎鏈球菌）4.鮑曼不動(dòng)桿菌（多重耐藥）5.銅綠假單胞菌（多重耐藥）6.嗜麥芽窄食單胞菌（多重耐藥）7.產(chǎn)ESBLs的E.coli和K.pneumonia8.VRSA？（對(duì)萬古霉素低度耐藥的金葡菌？）9.產(chǎn)NDM1的腸桿菌科細(xì)菌。（泛耐藥）臨床病毒學(xué)檢驗(yàn)病毒的基本特性標(biāo)本的采集與送檢病毒的分離培養(yǎng)與鑒定病毒的形態(tài)學(xué)檢查病毒感染的血清學(xué)診斷檢測(cè)病毒核酸巴西衛(wèi)生部2016年1月12日通報(bào)，

可能與寨卡病毒感染有關(guān)的小頭畸形病例356例3000BC，埃及孟非思壁畫中長(zhǎng)老患小兒麻痹癥。病毒的危害1、微生物引起的疾病中，病毒占75%2、有些病毒傳染性強(qiáng)，如乙肝V、流感V、HIV等3、可累及多系統(tǒng)：呼吸道、消化道、心血管、神經(jīng)系統(tǒng)等4、很多病毒缺乏有效的治療藥物。一、病毒的基本特性病毒（virus）：最微小的、結(jié)構(gòu)最簡(jiǎn)單的非細(xì)胞型微生物。特征1.體積微?。?/p>

2.非細(xì)胞結(jié)構(gòu)，結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單“一包基因”而且僅一種核酸；

3.嚴(yán)格的胞內(nèi)寄生；

4.以復(fù)制方式繁殖；

5.抵抗力特殊；

6.在醫(yī)學(xué)微生物中占重要地位。葡萄球菌(1000nm）牛痘病毒300×250nmABCDEFG立克次體450nm衣原體390nmA、大腸桿菌噬菌體

(65×95nm)B、腺病毒

(70nm)C、脊髓灰質(zhì)炎病毒

(30nm)D、乙腦病毒

(40nm)E、蛋白分子

(10nm)F、流感病毒

(100nm)G、煙草花葉病毒病毒形態(tài)二、標(biāo)本的采集與送檢

（principleofcollectionspecimen）

1、采集急性期標(biāo)本2、污染標(biāo)本應(yīng)用抗生素抑制標(biāo)本中細(xì)菌或真菌的生長(zhǎng)3、低溫保存，快速送檢4、血清學(xué)實(shí)驗(yàn)檢查抗體（雙分血清）三、病毒的分離培養(yǎng)與鑒定

（virusisolationanddetermination）動(dòng)物接種選擇易感動(dòng)物及接種部位，觀察發(fā)病情況雞胚培養(yǎng)不同病毒選擇不同接種部位（絨毛尿囊膜，尿囊腔，羊膜腔，卵黃囊），分離流感病毒最常用。細(xì)胞培養(yǎng)：分離病毒最常用的方法（1）原代細(xì)胞—來源于動(dòng)物、雞胚、人胚組織細(xì)胞，對(duì)多種病毒敏感，但只能傳2-3代。（2）二倍體細(xì)胞—在體外分裂50-100代后仍保持2倍體染色體數(shù)目的單層細(xì)胞。（3）傳代細(xì)胞—能在體外無限傳代的細(xì)胞多由癌細(xì)胞或二倍體細(xì)胞突變而來。四、病毒的形態(tài)學(xué)檢查

電鏡和免疫電鏡——直接觀察病毒光鏡——大病毒和包涵體流感病毒的熒光電鏡照片乙腦病毒的電鏡