知識補充高效液相色譜法

HPLC

HighPerformanceLiquidChromatography17.1概述17.2高效液相色譜儀17.3高效液相色譜的固定相和流動相17.4高效液相色譜法的主要類型當前1頁，總共88頁。1HPLC的發(fā)展歷史1952James和Martin發(fā)展了氣相色譜；1967Kirkland等研制高效液相色譜法；吸附柱色譜1906GC1950年代GC-MS1950年代末HPLC1960年代毛細管電泳和毛細管電動色譜等一系列新的色譜法1980年代中期當前2頁，總共88頁。2HP1100型高效液相色譜儀當前3頁，總共88頁。317.1.2HPLC與GC的比較氣相色譜（GC）適合分析在操作溫度下能氣化而不分解的有機化合物，僅占15%，衍生后也只有不到20%。

GC不適合高沸點、難揮發(fā)及熱不穩(wěn)定化合物、離子性化合物、高聚物等。當前4頁，總共88頁。4補充高效液相色譜法

保留值塔板數(shù)塔板高度分離度選擇性氣相色譜﹦液相色譜塔板理論速率方程液相色譜所用基本概念：當前5頁，總共88頁。517.1.2HPLC與經典LC的比較當前6頁，總共88頁。6HPLC：高效色譜柱、高壓泵、高靈敏檢測器經典LC：粒徑150-200m，流速0.xml/min，分離時間數(shù)小時（依重力流動）tS當前7頁，總共88頁。7

用高壓輸液泵將具有不同極性的單一溶劑或不同比例的混合溶劑、緩沖液等流動相泵入裝有固定相的色譜柱，經進樣閥注入待測樣品，由流動相帶入柱內，在柱內各成分被分離后，依次進入檢測器進行檢測，從而實現(xiàn)對試樣的分析的方法稱為高效液相色譜法（highperformanceliquidchromatography,HPLC)。17.1.3HPLC定義當前8頁，總共88頁。817.1.4現(xiàn)代高效液相色譜法的特點：(1)高效：(2)高壓：HPLC工作壓力高達20MPa-30MPa。(3)高速：分離一個樣品只需幾分鐘至幾十分鐘。(4)高靈敏度：紫外檢測器的檢測限可達10－9g，熒光檢測器的檢測限可達10－12g。一般GC的填充色譜柱是數(shù)千塔板／米，高效液相色譜法的塔板數(shù)可達約8萬塔板/米，使分離效率大大提高。當前9頁，總共88頁。9高效液相色譜法的優(yōu)點是：

其缺點是：價格昂貴，要用各種填料柱，容量小，流動相消耗大且有毒性的居多。17.1.5高效液相色譜法的優(yōu)、缺點檢測的分辨率和靈敏度高，分析速度快，重復性好，定量精度高，應用范圍廣。適用于分析高沸點、大分子、強極性、具有生物活性、熱穩(wěn)定性差的化合物。當前10頁，總共88頁。10色譜分離的過程當前11頁，總共88頁。1117.1.6樣品分子在色譜柱中的分離過程當前12頁，總共88頁。1217.1.6樣品分子在色譜柱中的分離過程當前13頁，總共88頁。13

色譜分離的實質是樣品分子（即溶質）與溶劑（即流動相或洗脫液）以及固定相分子間的作用，作用力的大小，決定色譜過程的保留行為。17.1.7色譜分離的實質當前14頁，總共88頁。1417.2高效液相色譜儀當前15頁，總共88頁。1517.2高效液相色譜儀結構輸液系統(tǒng)進樣系統(tǒng)分離系統(tǒng)檢測系統(tǒng)當前16頁，總共88頁。1617.2高效液相色譜儀結構高效液相色譜儀結構示意圖輸液系統(tǒng)進樣系統(tǒng)分離系統(tǒng)檢測系統(tǒng)當前17頁，總共88頁。1717.2高效液相色譜儀結構進樣器貯液器高壓泵色譜柱餾分收集器檢測器記錄儀輸液系統(tǒng)進樣系統(tǒng)分離系統(tǒng)檢測系統(tǒng)當前18頁，總共88頁。1817.2高效液相色譜儀結構進樣器貯液器高壓泵梯度洗脫裝置色譜柱餾分收集器檢測器記錄儀高效液相色譜儀結構示意圖輸液系統(tǒng)進樣系統(tǒng)分離系統(tǒng)檢測系統(tǒng)當前19頁，總共88頁。1917.2高效液相色譜儀結構17.2.1輸液系統(tǒng)17.2.2進樣系統(tǒng)

分離系統(tǒng)17.2.4

檢測系統(tǒng)當前20頁，總共88頁。2017.2高效液相色譜儀結構17.2.1輸液系統(tǒng)高壓輸液泵在線脫氣裝置梯度洗脫裝置當前21頁，總共88頁。2117.2.1高壓輸液泵作用：將流動相以穩(wěn)定的流速或壓力輸送到色譜系統(tǒng)。輸液泵的穩(wěn)定性直接關系到分析結果的重復性和準確性。當前22頁，總共88頁。2217.2.1高壓輸液泵性能：⑴足夠的輸出壓力⑵輸出恒定的流量⑶輸出流動相的流量范圍可調節(jié)

⑷壓力平穩(wěn),脈動小

當前23頁，總共88頁。2317.2.1高壓輸液泵注意事項：⑴防止任何固體顆粒進入泵體⑵流動相不應含有任何腐蝕性物質⑶泵工作時防止溶劑瓶流動相用完

⑷不要超過最高壓力⑸流動相應先脫氣當前24頁，總共88頁。24在線脫氣、超聲脫氣、真空脫氣等作用：脫去流動相中的溶解氣體。流動相先經過脫氣裝置再輸送到色譜柱。脫氣不好時有氣泡，導致流動相流速不穩(wěn)定，造成基線飄移，噪音增加。O2,N2,CO2…17.2.1在線脫氣裝置當前25頁，總共88頁。2517.2.1梯度洗脫裝置Isocraticelution恒定組成的單一溶劑體系Gradientelution以一定速度改變多種溶劑的配比淋洗，目的是分離多組容量因子相差較大的組分。High-PressureMixing作用:縮短分析時間,提高分離度,改善峰形,提高監(jiān)測靈敏度當前26頁，總共88頁。26補充、液相色譜中的柱外譜帶展寬色譜柱本身以外區(qū)域的譜帶展寬，稱為柱外譜帶展寬。樣品注入色譜柱后，在色譜柱以外的任何死空間（如進樣器、柱接頭、連接管和檢測器）中，樣品分子的擴散和滯留，都會引起色譜峰的擴展，而使柱效降低，所以柱外死體積影響是不能忽略的。當前27頁，總共88頁。27進樣系統(tǒng):密封性好，死體積小，重復性好1注射器進樣裝置優(yōu)點：可以任意改變進樣體積，注射快速,不易造成峰擴張。缺點：重現(xiàn)性較差，試液容易滲漏當前28頁，總共88頁。2817.2.2進樣系統(tǒng)2高壓定量進樣閥(六通閥)優(yōu)點：進樣量的可變范圍大，耐高壓，易于自動化缺點：容易造成色譜峰擴張當前29頁，總共88頁。2917.2.2進樣系統(tǒng)當前30頁，總共88頁。30色譜柱

色譜柱是實現(xiàn)分離的核心部件。要求柱效高、柱容量大和性能穩(wěn)定。柱性能與柱結構、填料特性、填充質量和使用條件有關。

17.2.3分離系統(tǒng)：色譜柱當前31頁，總共88頁。31常用內壁拋光過的不銹鋼制成顆粒直徑早期大（20~75μm），柱管徑一般為2mm，柱長為50~100cm.近年來，用高效微型填料（3~10μm）管徑為4~5mm，長為10cm~50cm的直形不銹鋼柱。每米柱效可達8萬塔板數(shù)當前32頁，總共88頁。32sphericalandirregularsilicaparticles

Macroporoussphericalsilicaparticle.[K.K.Unger,Poroussilica,Elsevier,1979]

基質：載體或擔體。數(shù)m~數(shù)十m，球形。硅膠或有機高分子聚合物17.2.3分離系統(tǒng)：色譜柱填料當前33頁，總共88頁。33柱性能指標:柱壓理論塔板高度H理論塔板數(shù)n對稱因子f容量因子k選擇性因子α分離度R當前34頁，總共88頁。3417.2.4檢測系統(tǒng)檢測器應具有：溶質性檢測器有：紫外、熒光、電化學檢測器等總體檢測器有：示差折光、介電常數(shù)檢測器等靈敏度高、噪音低、線性范圍寬、響應快，死體積小、定量準確、適應范圍廣等特點，同時還應該對溫度和載液流速的變化不敏感。當前35頁，總共88頁。35

紫外-可見檢測器光源檢測室光柵二極管陣列檢測UVdetectorcell內容積：1-10l光路長：2-10mm當前36頁，總共88頁。3617.2.4熒光檢測器特點：有非常高的靈敏度和良好的選擇性，靈敏度要比紫外檢測法高23個數(shù)量級，特別適合于藥物和生物化學樣品的分析。當前37頁，總共88頁。3717.2.4熒光檢測器當前38頁，總共88頁。3817.2.4質譜檢測器HPLC-ESI/MS當前39頁，總共88頁。3917.2.4數(shù)據(jù)處理

計算機進行峰面積的積分、分析結果的計算、誤差的分析或色譜圖的輸出，記錄的信號進行程序化、自動化處理。當前40頁，總共88頁。40復習:高效液相色譜儀結構進樣器貯液器高壓泵色譜柱餾分收集器檢測器記錄儀輸液系統(tǒng)進樣系統(tǒng)分離系統(tǒng)檢測系統(tǒng)當前41頁，總共88頁。4117.2MainstagesofHPLCanalysisPrepareSampleinjectintocolumnelutewithmobilephasedetectsamplecomponentsidentifyandquantify當前42頁，總共88頁。4217.2高效液相色譜儀的工作流程進樣器貯液器高壓泵梯度洗脫裝置色譜柱餾分收集器檢測器記錄儀高效液相色譜儀結構示意圖當前43頁，總共88頁。4317.2高效液相色譜儀的工作流程進樣器貯液器高壓泵梯度洗脫裝置色譜柱餾分收集器檢測器記錄儀高效液相色譜儀結構示意圖當前44頁，總共88頁。4417.2高效液相色譜儀的工作流程進樣器貯液器高壓泵梯度洗脫裝置色譜柱餾分收集器檢測器記錄儀高效液相色譜儀結構示意圖當前45頁，總共88頁。4517.2高效液相色譜儀的工作流程進樣器貯液器高壓泵梯度洗脫裝置色譜柱餾分收集器檢測器記錄儀高效液相色譜儀結構示意圖tS當前46頁，總共88頁。46當前47頁，總共88頁。47高效液相色譜的應用：

醫(yī)藥衛(wèi)生、食品、

人體化學成分、各類合成藥物成分、各種天然植物和動物藥物化學成分。17.3高效液相色譜法的應用當前48頁，總共88頁。48高效液相色譜的應用：

醫(yī)藥衛(wèi)生、食品、環(huán)保

等各個領域最為重要的分離分析技術。17.3高效液相色譜法的應用

有機酸、氨基酸、糖、維生素、脂肪酸、香料、甜味劑、防腐劑、人工色素、病原微生物、霉菌毒素等。當前49頁，總共88頁。49南京市兒童醫(yī)院，徐進，兒科藥學雜，1999年第5卷第2期色譜條件色譜條件:島津LC—10AD高效液相色譜儀；RF一l0AxL熒光檢測器，熒光激發(fā)波長360nm，發(fā)射波長430nm;LD一I0A泵，分析柱為SpherisorbODS5μm,200x4.6mm,預柱為WatersODS柱，室溫;流動相為0.05mol/L磷酸鹽緩沖液(pH=4.0):乙睛(78:22v/v)，內含0.05mol/L戊磺酸鈉，流速為1ml/min17.3HPLC法測定人血漿中氨芐青霉素濃度當前50頁，總共88頁。50樣品分離良好，保留時間為7.3分鐘

當前51頁，總共88頁。51取含有氨芐青霉素的血漿0.2m1.加人10%三氯醋酸0.2m1，渦旋振蕩混勻，12000r/min離心10min，取上清液0.2m1于安瓿中，再加人0.5mol/L鹽酸0.2m1，密封安瓿后置100℃水浴90min，冷卻后再加人蒸餾水0.2m1,渦旋振蕩混勻后，進樣20微升測定。以外標法峰面積定量。

血樣處理方法當前52頁，總共88頁。52HP1100型高效液相色譜儀色譜柱：Hypersil-ODS2-C18，4.6mmX250mm柱檢測波長215nm，進樣量20μL，流動相為甲醇+0.02mol/L乙酸銨(35+65)，流量0.50mL/min17.3HPLC法快速測定食品中糖精鈉、苯甲酸、山梨酸

當前53頁，總共88頁。53當前54頁，總共88頁。54色譜圖2:高良姜色譜圖1diarylheptanoidA

2高良姜素3diarylheptanoidB當前55頁，總共88頁。55一、液相色譜的速率理論二、影響分離的因素補充高效液相色譜法當前56頁，總共88頁。56n為色譜柱的理論塔板數(shù)。因為tR是熱力學常數(shù)，當色譜柱的長度一定，理論板數(shù)目n越大，色譜峰越窄。一、液相色譜的速率理論當前57頁，總共88頁。57液相色譜的速率方程為：D為擴散系數(shù)，Cd、

C’為有關項的板高系數(shù)，dp和df

為填充粒子直徑和固定液膜的厚度一、液相色譜的速率理論當前58頁，總共88頁。58一、液相色譜的速率理論H∝d2p當粒度從45μm降至6μm時,板高要降低10倍。當前59頁，總共88頁。59二、影響分離的因素

速率方程：H=A+Cu故液相色譜H-u曲線與氣相色譜的形狀不同，如圖

影響分離的主要因素有流動相的流量、性質和極性。當前60頁，總共88頁。601.影響分離的因素——流速流速大于0.5cm/s時,H～u曲線是一段斜率不大的直線。降低流速，柱效提高不是很大。但在實際操作中，流量仍是一個調整分離度和出峰時間的重要可選擇參數(shù)。當前61頁，總共88頁。612.固定相及分離柱選擇短柱、細內徑提高分析速度；研制高效柱填料是一活躍領域。當前62頁，總共88頁。623.流動相組成流動相按組成不同可分為單組分和多組分；按極性可分為極性、弱極性、非極性；按使用方式有等度洗脫和梯度洗脫。當前63頁，總共88頁。633.流動相組成常用溶劑:己烷、四氯化碳、甲苯、乙酸乙酯、乙醇、乙腈、水。采用二元或多元組合溶劑作為流動相可以靈活調節(jié)流動相的極性或增加選擇性，以改進分離或調整出峰時間。當前64頁，總共88頁。644.選擇流動相時應注意的幾個問題：（1）盡量使用高純度試劑作流動相。（2）避免流動相與固定相發(fā)生作用而使柱效下降或損壞柱子。（3）試樣在流動相中應有適宜的溶解度。（4）流動相同時還應滿足檢測器的要求。當前65頁，總共88頁。65提高柱效的方法(降低板高)：①固定相填料要均一，顆粒細，裝填均勻。②流動相粘度低。③低流速。④適當升高柱溫。一、液相色譜的速率理論當前66頁，總共88頁。6617.4高效液相色譜法的主要類型17.4.1分配色譜17.4.2液固（吸附）色譜17.4.3離子交換色譜17.4.4尺寸排阻色譜當前67頁，總共88頁。6717.4高效液相色譜法的分離機理及分類

液相色譜的固定相可以是吸附劑、化學鍵合固定相（或在惰性載體表面涂上一層液膜）、離子交換樹脂或多孔性凝膠；流動相是各種溶劑。被分離混合物由流動相液體推動進入色譜柱。根據(jù)各組分在固定相及流動相中的吸附能力、分配系數(shù)、離子交換作用或分子尺寸大小的差異進行分離。

當前68頁，總共88頁。6817.4高效液相色譜法的分離機理及分類吸附色譜分配色譜尺寸排斥色譜離子交換色譜吸附能，氫鍵疏水分配作用溶質分子大小庫侖力

類型

主要分離機理當前69頁，總共88頁。691.吸附色譜（液-固吸附色譜）以固體吸附劑為固定相，如硅膠、氧化鋁等，較常使用的是5～10μm的硅膠吸附劑。流動相可以是各種不同極性的一元或多元溶劑。2.分配色譜（液-液分配色譜）早期通過在擔體上涂漬一薄層固定液制備固定相,現(xiàn)多為化學鍵合固定相，即用化學反應的方法通過化學鍵將固定液結合在擔體表面。當前70頁，總共88頁。703.離子交換色譜固定相為離子交換樹脂，流動相為無機酸或無機堿的水溶液。各種離子根據(jù)它們與樹脂上的交換基團的交換能力的不同而得到分離。4.凝膠色譜（空間排阻色譜）

以凝膠為固定相。凝膠是一種經過交聯(lián)的、具有立體網(wǎng)狀結構和不同孔徑的多聚體的通稱。如葡聚糖凝膠、瓊脂糖等軟質凝膠；多孔硅膠、聚苯乙烯凝膠等硬質凝膠；當前71頁，總共88頁。7117.4.1

分配色譜partitionchromatography

樣品分子在流動相和固定相間的溶解度不同（分配作用）而實現(xiàn)分離的液相色譜分離模式優(yōu)點：1.均一性和穩(wěn)定性好2.不易流失3.柱效高4.重現(xiàn)性好5.流動相和固定相選擇范圍廣6.分離性能好當前72頁，總共88頁。7217.4.1

分配色譜partitionchromatography液-液分配色譜：固定液易流失（物理吸附）liquid-liquid鍵合相色譜：化學鍵bondedphase當前73頁，總共88頁。7317.4.1

分配色譜partitionchromatography當前74頁，總共88頁。74OHOHOHOOO+C18H37SiCl3SiC18H37

分配色譜一、化學鍵合固定相當前75頁，總共88頁。75非極性鍵合固定相：鍵合在載體表面的功能分子是烷基（C8和C18）

、苯基等非極性有機分子。（極性很?。O性鍵合固定相：鍵合在載體表面的功能分子是具有丙氨基、二醇基、氰乙基、氨基等極性基團的有機分子。

分配色譜一、化學鍵合固定相如最常用的ODS（Octa-decyltrichloroSilane）柱或C18柱就是最典型的代表，其極性很小。當前76頁，總共88頁。76

分配色譜1.反相HPLC（reversedphaseHPLC）：非極性固定相：如ODS柱或C18柱等極性流動相：如水、甲醇、乙腈等2.正相HPLC（normalphaseHPLC）：極性固定相：

如氰乙基、氨基等非極性（或弱極性）流動相：如正己烷等當前77頁，總共88頁。77一般地，正相色譜是固定液的極性大于流動相的極性，而反相色譜是固定相的極性小于流動相的極性。正相色譜適宜于分離極性化合物，反相色譜則適宜于分離非極性或弱極性化合物。

分配色譜當前78頁，總共88頁。78二、固定相和流動相的選擇各種分析物質功能基的極性按下列順序增加：烷烴＜醚＜酯＜酮＜醛＜酰胺＜胺＜醇，水的極性最大。液相色譜中常用流動相的性質（表17-2）

分配色譜當前79頁，總共88頁。79舉例：反相液相色譜法流動相的選擇水甲醇或乙腈弱酸、弱堿或緩沖鹽（PH:2~8）當前80頁，總共88頁。802.選擇色譜柱類型的方式：第一，固定相的極性與分析物質的極性粗略匹配，用極性明顯不同的流動相洗脫；第二，流動相的極性與分析物質的極性相匹配，用極性明顯不同的固定相；第三，固定相與分析物質的極性極為相似，僅由流動相極性差異使分析物質沿柱移動。

分配色譜二