細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法講義新鄉(xiāng)市食品藥品藥品檢驗(yàn)所詳解演示文稿

細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法講義新鄉(xiāng)市食品藥品藥品檢驗(yàn)所詳解演示文稿當(dāng)前1頁(yè)，總共85頁(yè)。（優(yōu)選）細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法講義新鄉(xiāng)市食品藥品藥品檢驗(yàn)所當(dāng)前2頁(yè)，總共85頁(yè)。一、簡(jiǎn)況一百多年前，在西方醫(yī)學(xué)發(fā)展史上，一個(gè)最重要的發(fā)展就是注射給藥（特別是靜脈注射）方式的創(chuàng)立。毫無(wú)疑問(wèn)它在人類與疾病作斗爭(zhēng)的過(guò)程中起了重要作用，但是無(wú)論過(guò)去還是現(xiàn)在，臨床上使用注射劑時(shí)經(jīng)常出現(xiàn)注射引起的發(fā)熱、頭痛、惡心、膚色灰白、昏迷等，甚至導(dǎo)致患者死亡，這些反應(yīng)總稱為不良反應(yīng)。不良反應(yīng)可分為熱原反應(yīng)和過(guò)敏反應(yīng)。因此，注射劑的熱原檢查是保證藥品安全的重要檢驗(yàn)項(xiàng)目之一。

當(dāng)前3頁(yè)，總共85頁(yè)。1912年第一次考慮用家兔做熱原試驗(yàn)，1942年美國(guó)首先將家兔熱原檢查方法收入藥典。中國(guó)藥典于1953年開(kāi)始收載。因此，半個(gè)世紀(jì)以來(lái)，家兔法對(duì)保證藥品臨床使用的安全發(fā)揮了重要的作用。但是，隨著科學(xué)技術(shù)和制藥工業(yè)的發(fā)展，這一檢查法的局限性越來(lái)越明顯，所以用新的檢驗(yàn)方法代替家兔法檢測(cè)熱原早已成為國(guó)內(nèi)外醫(yī)藥界科研、生產(chǎn)、臨床檢驗(yàn)等部門(mén)很緊迫的問(wèn)題，基于科學(xué)實(shí)踐發(fā)展的要求從而發(fā)現(xiàn)并建立了細(xì)菌內(nèi)毒素檢查方法。當(dāng)前4頁(yè)，總共85頁(yè)。

細(xì)菌內(nèi)毒素試驗(yàn)方法有：凝膠法（Gelationassay）屬限量；濁度法（Turbidimetrecassay）屬定量；顯色底物法（Chromogenicassay）屬定量法；免疫方法（Immumologyassay）等。當(dāng)前5頁(yè)，總共85頁(yè)。歷史回顧和發(fā)展趨勢(shì)1、歷史回顧美國(guó)是發(fā)明鱟試劑和最先建立鱟試驗(yàn)方法的國(guó)家。1956年，美國(guó)動(dòng)物學(xué)家F.Bang發(fā)表論文《鱟的一種細(xì)菌性疾病》，闡述了細(xì)菌內(nèi)毒素使鱟血凝固的現(xiàn)象。1964年，F(xiàn).Bang和J.levin提出了鱟血凝集的初步機(jī)理。1968年，F(xiàn).Bang和J.levin建立了鱟試驗(yàn)的方法。1973年，美國(guó)食品藥物管理局（FDA）承認(rèn)鱟試劑為一種生物制品。

當(dāng)前6頁(yè)，總共85頁(yè)。1980年，F(xiàn)DA制定了用鱟試劑檢查人用和獸用注射藥內(nèi)毒素的準(zhǔn)則；美國(guó)藥典20版（USPXX）收載細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法（BET），但在藥典各品種正文中未涉及。1983年，USPXX版第四增補(bǔ)本規(guī)定了注射用水等5種常用藥品和40種放射性藥品用細(xì)菌內(nèi)毒素檢查取代熱原檢查。1991年，USPXXⅡ版第五增補(bǔ)本規(guī)定185種藥品以細(xì)菌內(nèi)毒素檢查取代熱原檢查。當(dāng)前7頁(yè)，總共85頁(yè)。

1995年，USPXXⅢ版規(guī)定471種藥品用細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法檢查，保留熱原檢查的藥品不足30種。1999年，USPXXⅣ版規(guī)定670種藥品用細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法檢查，保留熱原檢查的藥品約20種。2000年，國(guó)際調(diào)和委員會(huì)使美國(guó)藥典（USP）、歐洲藥典（EP）和日本藥局方（JP）達(dá)成《BET的國(guó)際調(diào)和案》，統(tǒng)一的BET已收載于USPXXⅣ和NF19的第二增補(bǔ)本中，并于2001年1月1日生效。

當(dāng)前8頁(yè)，總共85頁(yè)。

英國(guó)、歐洲藥典以及日本藥局方都已收載細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法，但規(guī)定檢查的品種各有不同。一個(gè)共同的特點(diǎn)是注射水是最先被允許檢查的品種。中國(guó)目前是世界上鱟試劑產(chǎn)量最大的國(guó)家之一。1975～1982年是我國(guó)鱟試劑的研制階段，當(dāng)時(shí)由于缺乏標(biāo)準(zhǔn)化研究的基礎(chǔ)，上千批次的實(shí)驗(yàn)結(jié)果難于分析。當(dāng)前9頁(yè)，總共85頁(yè)。

1983年，衛(wèi)生部授權(quán)國(guó)家藥品生物制品檢定所組織全國(guó)范圍的大輸液及放射性藥品鱟試驗(yàn)的協(xié)作研究。1988年，衛(wèi)生部頒布細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法，允許4種藥品使用細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法初檢。1993年，中國(guó)藥典1990年版第二增補(bǔ)本收載細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法，但未涉及任何品種正文。

1995年，“中國(guó)藥典細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法實(shí)施會(huì)議紀(jì)要”提出爭(zhēng)取在3～5內(nèi)我國(guó)上百種藥品由熱原檢查法改為細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法。當(dāng)前10頁(yè)，總共85頁(yè)。

1996年，中國(guó)藥典1995年版二部附錄收載經(jīng)修訂的細(xì)菌內(nèi)的毒素檢查法，注射用水等五種常用藥品和九種放射性藥品正文規(guī)定了細(xì)菌內(nèi)毒素檢查，取消了熱原檢查（其中5%及10%葡萄糖注射液是后來(lái)發(fā)通知補(bǔ)充）。

1998年，中國(guó)藥典1995年版1998年增補(bǔ)本收載經(jīng)重大修訂的細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法，其中對(duì)鱟試劑和細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用水的質(zhì)量以及細(xì)菌內(nèi)毒素檢查方法提出了更高要求。

當(dāng)前11頁(yè)，總共85頁(yè)。

2000年，中國(guó)藥典2000年版（二部）新增細(xì)菌內(nèi)毒素檢查品種57種，且收載了《細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法應(yīng)用指導(dǎo)原則》。

2005年，中國(guó)藥典2005年版（二部）新增細(xì)菌內(nèi)毒素檢查品種約200種。當(dāng)前12頁(yè)，總共85頁(yè)。2、發(fā)展趨勢(shì)

A.各國(guó)藥典收載細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法成為發(fā)展的趨勢(shì)細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法作為一種新技術(shù)載入藥典，成為官方承認(rèn)的一種法定的藥檢方法，反映了藥典標(biāo)準(zhǔn)水平、藥檢技術(shù)水平的提高，標(biāo)志著一個(gè)國(guó)家制藥工業(yè)水平及藥品質(zhì)量的提高。隨著時(shí)間的推移，必將有更多國(guó)家的藥典收載細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法。當(dāng)前13頁(yè)，總共85頁(yè)。

B.細(xì)菌內(nèi)毒素檢查取代熱原檢查成為必然的趨勢(shì)細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法所具有的優(yōu)點(diǎn)表明它比熱原檢查法更適應(yīng)現(xiàn)代制藥工業(yè)的發(fā)展。從USPXX版開(kāi)始收載細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法，到USPXXⅢ版已有超過(guò)90%的注射劑品種規(guī)定內(nèi)毒素檢查。其它國(guó)家的藥典規(guī)定細(xì)菌內(nèi)毒素檢查的品種同樣經(jīng)歷了從無(wú)到有，從少到多的過(guò)程?？梢灶A(yù)見(jiàn)，細(xì)菌內(nèi)毒素檢查最終必然會(huì)取代絕大多數(shù)注射劑品種的熱原檢查。

當(dāng)前14頁(yè)，總共85頁(yè)。C.走向統(tǒng)一的細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法USP、EP和JP是三個(gè)收載細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法（BET）較早的藥典，它們分別建立了各自的內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)物和BET，WHO為了保持內(nèi)毒素的國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)品（IS）的效價(jià)（IU）與各國(guó)內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)品的效價(jià)（EU）的一致性，進(jìn)行了內(nèi)毒素IS國(guó)際協(xié)作研究，自此，內(nèi)毒素的標(biāo)準(zhǔn)在IU與EU之間實(shí)現(xiàn)了統(tǒng)一，即1IU=1EU。雖然內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)初步實(shí)行了統(tǒng)一，但在不同的藥典方法下測(cè)定的內(nèi)毒素值仍有差別。當(dāng)前15頁(yè)，總共85頁(yè)。細(xì)菌內(nèi)毒素

細(xì)菌內(nèi)毒素是細(xì)菌毒素的一類，

是革蘭氏陰性菌細(xì)胞壁上的一種脂多糖（LipoplySaccharide）和微量蛋白（Protein）的復(fù)合物，它不是細(xì)菌或細(xì)菌的代謝產(chǎn)物，而是細(xì)菌死亡并解體后才釋放出來(lái)的一種具有內(nèi)毒素生物活性的物質(zhì)。其化學(xué)成分廣泛分布于革蘭氏陰性菌（如大腸桿菌、布氏桿菌、傷寒桿菌、變形桿菌、沙門(mén)氏菌等）及其它微生物（如衣原體、立克次氏體、螺旋體等）的細(xì)胞壁中，其化學(xué)成份主要是由O-特異性鏈、核心多糖、類脂A三部分組成。

當(dāng)前16頁(yè)，總共85頁(yè)。類脂A可從O-特異鏈及核心多糖分離出來(lái)，游離的類脂A可自身凝聚成大分子的復(fù)合體而難溶于水，并具有生物活性。所以，類脂A（Lipida）是內(nèi)毒素多種生物活性或毒性反應(yīng)的主要基團(tuán)。該基團(tuán)沒(méi)有種屬特異性，所以各屬細(xì)菌的類脂A結(jié)構(gòu)相似，其毒性反應(yīng)相似。如發(fā)熱、血液流動(dòng)力學(xué)改變、彌漫性血管內(nèi)凝血，并導(dǎo)致休克等。由于類脂A是由4條主鏈和2條支鏈的脂肪酸與內(nèi)酰胺連接組成，所以提純的內(nèi)毒素是極為不穩(wěn)定的。這就要求內(nèi)毒素應(yīng)在低溫條件下保存，在工作中內(nèi)毒素稀釋?xiě)?yīng)盡可能地縮短時(shí)間，并要現(xiàn)配現(xiàn)用。當(dāng)前17頁(yè)，總共85頁(yè)。內(nèi)毒素具有多種生物活性：1．生物活性：它具有致熱性、致死性毒性、白細(xì)胞減少、降低血壓，休克、激活凝血系統(tǒng)、誘導(dǎo)機(jī)體對(duì)內(nèi)毒素的耐受性、鱟細(xì)胞溶解物的凝集、刺激淋巴細(xì)胞有絲分裂、誘導(dǎo)抗感染的非特異抵抗力、腫瘤細(xì)胞壞死作用等一系列生物活性。當(dāng)前18頁(yè)，總共85頁(yè)。2．耐熱性：細(xì)菌內(nèi)毒素具有很強(qiáng)的耐熱性，一般的高壓滅菌不能使其滅活，需250℃30分鐘以上的干熱滅菌才能使其滅活，目前我國(guó)藥典熱原檢查法和細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法中關(guān)于玻璃用具的滅菌處理為250℃30分鐘以上，而日本藥局方采用250℃1小時(shí)以上。其它各國(guó)藥典也大多如此，國(guó)內(nèi)細(xì)菌內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)品的耐熱情況雖然未能考察，但可以認(rèn)為對(duì)細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法中玻璃用具等的除菌最好采用250℃30分鐘以上的干烤處理。

當(dāng)前19頁(yè)，總共85頁(yè)。

3．外界因素影響：細(xì)菌內(nèi)毒素的生物活性隨外界因素的影響變化很大。目前已經(jīng)知道，一些金屬離子、超聲波以及溫度等都會(huì)對(duì)細(xì)菌內(nèi)毒素的生物活性產(chǎn)生很大影響，據(jù)國(guó)外文獻(xiàn)報(bào)導(dǎo)，鐵離子、鋁離子等會(huì)引起細(xì)菌內(nèi)毒素活性的降低。當(dāng)前20頁(yè)，總共85頁(yè)。

因此在試驗(yàn)過(guò)程中最好使用玻璃用具，以避免這些因素，另外溫度的高低對(duì)細(xì)菌內(nèi)毒素水溶液活性影響很大，根據(jù)國(guó)內(nèi)外文獻(xiàn)報(bào)道：內(nèi)毒素水溶液活性隨著環(huán)境溫度的升高而降低，因此對(duì)于內(nèi)毒素水溶液一定要在低溫處保存，而且對(duì)已經(jīng)稀釋好的內(nèi)毒素水溶液，要盡可能的在2小時(shí)內(nèi)用完，以避免活性降低。當(dāng)前21頁(yè)，總共85頁(yè)。鱟試劑檢測(cè)內(nèi)毒素的機(jī)理1956年，Bang發(fā)現(xiàn)細(xì)菌中提取的粗制品能使鱟因血細(xì)胞凝集而死亡，而肺炎球菌、葡萄球菌、鏈球菌的提取物與鱟血細(xì)胞無(wú)凝集反應(yīng)。Levin進(jìn)一步從鱟血變形細(xì)胞中提取了幾種成分并與提純的內(nèi)毒素進(jìn)行凝集實(shí)驗(yàn)的研究，并提出了內(nèi)毒素的凝膠試驗(yàn)法。當(dāng)前22頁(yè)，總共85頁(yè)。鱟的種屬及分布

鱟，又稱作王蟹，是一種棲生于海洋中的低等無(wú)脊椎動(dòng)物，大約出現(xiàn)在古生代泥盆紀(jì)，距今已明幾億年的歷史，但直到現(xiàn)在它的形態(tài)并無(wú)重大變化故有“活化石”之稱，鱟是從古生代的三葉蟲(chóng)演化而來(lái)。鱟的種屬很少，目前全世界僅存三屬4種：1.

美洲鱟

Limulus

polyphemus

LinnaEUs分布在北美西太平洋沿岸2.

東方鱟TachyplEUs

tridentatus

Leach分布在中國(guó)、日本、菲律賓等3.

巨鱟

TachyplEUs

gigas

Muller分布在泰國(guó)、印度尼西亞等

4.

園尾鱟

Car

cinoscorpius

rotundi

cauda

pocock分布馬來(lái)半島、印尼等

其中能夠用于制備鱟試劑的主要有：1.美洲鱟和

2.東方鱟。當(dāng)前23頁(yè)，總共85頁(yè)。當(dāng)前24頁(yè)，總共85頁(yè)。鱟血呈天藍(lán)色，是由于存在能攜氧的含銅血藍(lán)蛋白（hemocyanin）所致。鱟血中僅有一種白細(xì)胞，又稱變形細(xì)胞，它含有高密度的顆粒，顆粒中含有與內(nèi)毒素起凝集作用的酶系統(tǒng)，即凝固蛋白原（Coagulogen）凝固酶原（proclottingenzyme），B因子（factorB）和C因子（factorC）等。當(dāng)前25頁(yè)，總共85頁(yè)。內(nèi)毒素可使C因子激活，激活的C因子可使B因子激活，激活B因子又可使凝固酶原活化成凝固酶，后者通過(guò)酶解作用使凝固蛋白原轉(zhuǎn)變?yōu)槟痰鞍祝╟oagulin）。凝固蛋白又通過(guò)交聯(lián)（crosslinkingenzyme）作用，相互聚合而形成纖維狀的凝膠。當(dāng)前26頁(yè)，總共85頁(yè)。當(dāng)前27頁(yè)，總共85頁(yè)。2010年版藥典細(xì)菌內(nèi)毒素

檢查法介紹整體結(jié)構(gòu)1.綜述部分檢查法的描述試驗(yàn)的準(zhǔn)備限值（L）的確定確定最大有效稀釋倍數(shù)（MVD）2.實(shí)驗(yàn)部分凝膠法 光度測(cè)定法a鱟試劑靈敏度復(fù)核 a標(biāo)準(zhǔn)曲線的可靠性實(shí)驗(yàn)b干擾實(shí)驗(yàn) b干擾實(shí)驗(yàn)c檢查法：限量試驗(yàn) c檢查法半定量試驗(yàn) 當(dāng)前28頁(yè)，總共85頁(yè)。綜述部分1.檢查法的描述2.試驗(yàn)的準(zhǔn)備3.限值（L）的確定4.確定最大有效稀釋倍數(shù)（MVD）當(dāng)前29頁(yè)，總共85頁(yè)。本法系利用鱟試劑來(lái)檢測(cè)或量化由革蘭陰性菌產(chǎn)生的細(xì)菌內(nèi)毒素，以判斷供試品中細(xì)菌內(nèi)毒素的限量是否符合規(guī)定的一種方法。當(dāng)前30頁(yè)，總共85頁(yè)。

檢查法的描述細(xì)菌內(nèi)毒素檢查包括兩種方法，即凝膠法和光度測(cè)定法，后者包括濁度法和顯色基質(zhì)法。供試品檢測(cè)時(shí)，可使用其中任何一種方法進(jìn)行試驗(yàn)。當(dāng)測(cè)定結(jié)果有爭(zhēng)議時(shí)，除另有規(guī)定外，以凝膠法結(jié)果為準(zhǔn)。細(xì)菌內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)

a國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)品

b工作標(biāo)準(zhǔn)品細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用水

a凝膠法細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用水系指內(nèi)毒素含量小于0.015EU/ml的滅菌注射用水

b光度測(cè)定法細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用水，其內(nèi)毒素含量應(yīng)小于0.005EU/ml

當(dāng)前31頁(yè)，總共85頁(yè)。試驗(yàn)的準(zhǔn)備

試驗(yàn)器械的要求試驗(yàn)所用的器皿需經(jīng)處理，以去除可能存在的外源性內(nèi)毒素。常用的方法是在250℃干烤至少30分鐘，也可采用其他確證不干擾細(xì)菌內(nèi)毒素檢查的適宜方法。若使用塑料器械，如微孔板和與微量加樣器配套的吸頭等，應(yīng)選用標(biāo)明無(wú)內(nèi)毒素并且對(duì)試驗(yàn)無(wú)干擾的器械。試驗(yàn)操作過(guò)程應(yīng)防止微生物的污染。當(dāng)前32頁(yè)，總共85頁(yè)。試驗(yàn)的準(zhǔn)備供試品溶液的制備某些供試品需進(jìn)行復(fù)溶、稀釋或在水性溶液中浸提制成供試品溶液。一般要求供試品溶液的pH值在6.0～8.0的范圍內(nèi)。對(duì)于過(guò)酸、過(guò)堿或本身有緩沖能力的供試品，需調(diào)節(jié)被測(cè)溶液（或其稀釋液）的pH值，可使用酸、堿溶液或鱟試劑生產(chǎn)廠家推薦的適宜的緩沖液調(diào)節(jié)pH值。緩沖液必須經(jīng)過(guò)驗(yàn)證不含內(nèi)毒素和干擾因子。當(dāng)前33頁(yè)，總共85頁(yè)。限值（L）的確定藥品、生物制品的細(xì)菌內(nèi)毒素限值（L）除藥典有規(guī)定的，一般按以下公式確定：

L＝K／ML為供試品的細(xì)菌內(nèi)毒素限值；以EU/ml、EU/mg或EU/U表示；

K為規(guī)定的給藥途徑，人用每公斤體重每小時(shí)最大可接受的內(nèi)毒素量；以EU/（kg·h）表示。注射劑，K=5EU/（kg·h），其中放射性藥品注射劑，K=2.5EU/（kg·h），鞘內(nèi)用注射劑，K=0.2EU/（kg·h）；

M為人用每公斤體重每小時(shí)最大劑量；以ml/（kg·h）、mg/（kg·h）或u/（kg·h）表示，人均體重按60kg計(jì)算，注射時(shí)間小于1小時(shí)，按1小時(shí)計(jì)算按人用劑量計(jì)算限值時(shí)，如遇特殊情況，可根據(jù)生產(chǎn)和臨床用藥實(shí)際情況做必要調(diào)整，但需說(shuō)明理由。當(dāng)前34頁(yè)，總共85頁(yè)。計(jì)算舉例：注射用阿莫西林鈉根據(jù)國(guó)家藥典委員會(huì)編纂的《臨床用藥須知》：“肌肉注射或稀釋后靜脈滴注，一次0.5～1g，一日3～4次：小兒按體重每日50～100mg/kg，分3～4次靜脈滴注。”M成人＝1000mg/h÷60kg＝16.67mg/(kg·h)

M兒童＝100mg/(kg·h)÷3＝33.3mg/(kg·h)L=K/M=5EU/(kg·h)÷33.3mg/(kg·h)=0.150EU/mg限值（L）的確定當(dāng)前35頁(yè)，總共85頁(yè)。限值計(jì)算時(shí)做必要調(diào)整的幾種情況從嚴(yán)原則聯(lián)合用藥特殊情況等限值（L）的確定當(dāng)前36頁(yè)，總共85頁(yè)。確定最大有效稀釋倍數(shù)（MVD）

最大有效稀釋倍數(shù)是指供試品溶液被允許稀釋的最大倍數(shù)，在不超過(guò)此稀釋倍數(shù)的濃度下進(jìn)行內(nèi)毒素限值的檢測(cè)。MVD＝cL／λ

L：供試品的內(nèi)毒素限值

c：供試品溶液的濃度

λ：在凝膠法中鱟試劑的標(biāo)示靈敏度(EU/ml)，或在光度測(cè)定法中所使用的標(biāo)準(zhǔn)曲線上最低的內(nèi)毒素濃度(如標(biāo)準(zhǔn)曲線為50、5、

0.5EU/ml三個(gè)濃度組成)當(dāng)前37頁(yè)，總共85頁(yè)。計(jì)算舉例a當(dāng)L以EU/ml表示時(shí)，則濃度C的單位為1.0ml/ml

適用于供試品為溶液狀態(tài)，并且規(guī)定限值為應(yīng)小于xxEU/ml。

例：替硝唑注射液，計(jì)算限值為0.5EU/ml，使用靈敏度為0.125EU/ml的鱟試劑進(jìn)行檢驗(yàn)，則：MVD＝1.0ml/ml×0.5EU/ml÷0.125EU/ml＝4倍確定最大有效稀釋倍數(shù)（MVD）

當(dāng)前38頁(yè)，總共85頁(yè)。計(jì)算舉例b當(dāng)L以EU/mg表示時(shí)，則C的單位為mg/ml或U/ml適用于供試品為固體狀態(tài)，如粉針；或液體但是規(guī)定限值為應(yīng)小于xxEU/mg或EU/U。例：注射用阿莫西林鈉計(jì)算限值為0.15EU/mg，使用靈敏度為0.125EU/ml的鱟試劑進(jìn)行檢驗(yàn)。需先稱取一定重量的注射用阿莫西林鈉，在已除去外源性內(nèi)毒素的容器中，用細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用水配制成一定濃度的溶液。如稱取100mg注射用阿莫西林鈉，用5ml內(nèi)毒素檢查用水溶解，即成為濃度為20mg/ml的阿莫西林鈉溶液。MVD＝20mg/ml×0.15EU/mg÷0.125EU/ml＝24倍當(dāng)前39頁(yè)，總共85頁(yè)。如果供試品為注射用無(wú)菌粉末或原料藥，則MVD

取1，計(jì)算供試品的最小有效稀釋濃度c=λ/L

；適用于供試品為固體的情況。計(jì)算得到的最小有效稀釋濃度即為MVD下的該供試品的濃度。

例：注射用阿莫西林鈉計(jì)算限值為0.15EU/mg，使用靈敏度為0.125EU/ml的鱟試劑進(jìn)行檢驗(yàn)。最小有效稀釋濃度c

＝0.125EU/ml÷0.15EU/mg＝0.833mg/ml當(dāng)前40頁(yè)，總共85頁(yè)。例：注射用青霉素鈉（規(guī)格：80萬(wàn)單位）限值為0.01EU/100u，使用靈敏度為0.25EU/ml的鱟試劑進(jìn)行檢驗(yàn)。最小有效稀釋濃度c

＝0.25EU/ml÷0.01EU/100u＝2500u/ml當(dāng)前41頁(yè)，總共85頁(yè)。實(shí)驗(yàn)部分

凝膠法光度測(cè)定法a鱟試劑靈敏度復(fù)核a標(biāo)準(zhǔn)曲線的可靠性實(shí)驗(yàn)b干擾實(shí)驗(yàn)b干擾實(shí)驗(yàn)c檢查法：限量試驗(yàn)c檢查法

半定量試驗(yàn)當(dāng)前42頁(yè)，總共85頁(yè)。目的－考察鱟試劑的靈敏度是否準(zhǔn)確－考察檢驗(yàn)人員操作方法是否正確－實(shí)驗(yàn)條件是否符合規(guī)定何時(shí)進(jìn)行－使用新批號(hào)的鱟試劑－試驗(yàn)條件發(fā)生可能影響檢驗(yàn)結(jié)果的改變時(shí)

鱟試劑靈敏度復(fù)核試驗(yàn)當(dāng)前43頁(yè)，總共85頁(yè)。鱟試劑靈敏度復(fù)核試驗(yàn)

內(nèi)毒素濃度2λλ0.5λ0.25λ陰性對(duì)照鱟試劑平行管○○○○○○○○○○○○○○○○○○當(dāng)前44頁(yè)，總共85頁(yè)。鱟試劑靈敏度復(fù)核試驗(yàn)放入37℃±1℃的恒溫器中，保溫60分鐘±2分鐘將試管從恒溫器中輕輕取出，緩緩倒轉(zhuǎn)180°，若管內(nèi)形成凝膠，并且凝膠不變形、不從管壁滑脫者為陽(yáng)性；形成的凝膠不堅(jiān)實(shí)、變形或從管壁滑脫者為陰性；保溫和拿取試管過(guò)程應(yīng)避免受到振動(dòng)造成假陰性結(jié)果。當(dāng)前45頁(yè)，總共85頁(yè)。結(jié)果判斷：若最大濃度2λ管均為陽(yáng)性，最低濃度0.25λ管均為陰性，陰性對(duì)照管陰性，試驗(yàn)方有效。結(jié)果計(jì)算：反應(yīng)終點(diǎn)濃度的幾何平均值，即為鱟試劑靈敏度的測(cè)定值λc=lg-1(ΣX/4)

式中X為反應(yīng)終點(diǎn)濃度的對(duì)數(shù)值（lg）。（反應(yīng)終點(diǎn)濃度是指系列遞減的內(nèi)毒素濃度中最后一個(gè)呈陽(yáng)性結(jié)果的濃度。）鱟試劑靈敏度復(fù)核試驗(yàn)當(dāng)前46頁(yè)，總共85頁(yè)。鱟試劑靈敏度復(fù)核試驗(yàn)內(nèi)毒素濃度2λλ0.5λ0.25λ陰性對(duì)照終點(diǎn)鱟試劑平行管●●○○○λ●●○○○λ●●●○0.5λ●●●○0.5λλc=lg-1[(lgλ+lgλ+lg0.5λ+lg0.5λ)/4]=0.707λ當(dāng)前47頁(yè)，總共85頁(yè)。當(dāng)λc在0.5λ～2λ（包括0.5λ和2λ）時(shí)，方可用于細(xì)菌內(nèi)毒素檢查。實(shí)驗(yàn)時(shí)，以標(biāo)示靈敏度λ為該批鱟試劑的靈敏度。鱟試劑靈敏度復(fù)核試驗(yàn)當(dāng)前48頁(yè)，總共85頁(yè)。凝膠法干擾試驗(yàn)

目的：是確定供試品在多大的稀釋倍數(shù)或濃度下對(duì)內(nèi)毒素和鱟試劑的反應(yīng)不存在干擾作用，為能否使用細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法提供依據(jù)。

導(dǎo)致干擾的因素：排除干擾的方法：¨

pH值¨

稀釋¨

抗凝因子¨

中和¨

螯合劑¨

過(guò)濾¨

葡聚糖¨

加熱¨

……¨

……當(dāng)前49頁(yè)，總共85頁(yè)。試驗(yàn)操作：在干擾試驗(yàn)中，使用的供試品溶液應(yīng)為未檢驗(yàn)出內(nèi)毒素且不超過(guò)最大有效稀釋倍數(shù)（MVD）的溶液，即與所使用的鱟試劑反應(yīng)，不出現(xiàn)陽(yáng)性的供試品溶液。凝膠法干擾試驗(yàn)

當(dāng)前50頁(yè)，總共85頁(yè)。凝膠法干擾試驗(yàn)當(dāng)進(jìn)行新藥的內(nèi)毒素檢查試驗(yàn)前，或無(wú)內(nèi)毒素檢查項(xiàng)的品種建立內(nèi)毒素檢查法時(shí)，須進(jìn)行干擾試驗(yàn)。（注：須三個(gè)批號(hào)以上的供試品，兩個(gè)以上鱟試劑廠家的試劑）當(dāng)鱟試劑、供試品的配方、生產(chǎn)工藝改變或試驗(yàn)環(huán)境中發(fā)生了任何有可能影響試驗(yàn)結(jié)果的變化時(shí)，須重新進(jìn)行干擾試驗(yàn)。如：內(nèi)毒素檢查時(shí)，供試品陽(yáng)性對(duì)照為陰性時(shí)。當(dāng)前51頁(yè)，總共85頁(yè)。目的：初步確定供試品的最大不干擾濃度（當(dāng)限值以EU/mg或EU/U活性單位表示）或最小不干擾稀釋倍數(shù)（當(dāng)限值以EU/ml表示），為正式干擾實(shí)驗(yàn)提供依據(jù)；優(yōu)點(diǎn)：減少摸索過(guò)程、節(jié)省成本。預(yù)試驗(yàn)當(dāng)前52頁(yè)，總共85頁(yè)。操作步驟：將供試品溶液進(jìn)行一系列倍數(shù)的稀釋；使用鱟試劑對(duì)每一稀釋倍數(shù)進(jìn)行檢驗(yàn)，每一稀釋倍數(shù)下做2支供試品管和2支供試品陽(yáng)性對(duì)照（即含2.0λ濃度標(biāo)準(zhǔn)內(nèi)毒素的該濃度的供試品稀釋液）；另做2支陰性對(duì)照和2支陽(yáng)性對(duì)照。預(yù)試驗(yàn)當(dāng)前53頁(yè)，總共85頁(yè)。預(yù)試驗(yàn)結(jié)果判斷：當(dāng)陰性對(duì)照為陰性，陽(yáng)性對(duì)照為陽(yáng)性時(shí)，實(shí)驗(yàn)為有效；當(dāng)系列濃度中出現(xiàn)供試品溶液2管為陰性，供試品陽(yáng)性對(duì)照2管為陽(yáng)性時(shí)，認(rèn)為供試品在該濃度下不干擾實(shí)驗(yàn)，此稀釋倍數(shù)即為最小不干擾稀釋倍數(shù)，即可選擇該稀釋倍數(shù)進(jìn)行正式干擾實(shí)驗(yàn)。預(yù)試驗(yàn)當(dāng)前54頁(yè)，總共85頁(yè)。預(yù)試驗(yàn)○陰性●陽(yáng)性稀釋倍數(shù)原液5倍10倍20倍40倍供試品溶液○○○○○○○○○○PPC○○○○○●●●●●NC○○PC●●

如上結(jié)果可初步確定該樣品的最小干擾稀釋倍數(shù)為20倍，可在此濃度下進(jìn)行正式干擾實(shí)驗(yàn)。一般建議：40倍當(dāng)前55頁(yè)，總共85頁(yè)。正式干擾試驗(yàn)

目的：檢驗(yàn)在某一濃度下的供試品對(duì)于鱟試劑與內(nèi)毒素的反應(yīng)有無(wú)干擾作用。操作：用內(nèi)毒素檢查用水和供試品將同一支內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)品分別制備一系列濃度的內(nèi)毒素溶液。同時(shí)制備2支供試品陰性對(duì)照和2支陰性對(duì)照。當(dāng)前56頁(yè)，總共85頁(yè)。編號(hào)內(nèi)毒素濃度/配制內(nèi)毒素的溶劑稀釋用液稀釋倍數(shù)所含內(nèi)毒素的濃度平行管數(shù)A無(wú)/供試品溶液－－－2B2λ/供試品溶液供試品溶液12λ421λ440.5λ480.25λ4C2λ/檢查用水檢查用水12λ421λ440.5λ480.25λ4D無(wú)/檢查用水－－－2A：供試品溶液B：供試品陽(yáng)性對(duì)照C：陽(yáng)性對(duì)照D：陰性對(duì)照當(dāng)前57頁(yè)，總共85頁(yè)。結(jié)果判斷當(dāng)供試品陰性對(duì)照A和陰性對(duì)照D都為陰性，并且系列溶液C的結(jié)果在鱟試劑靈敏度范圍內(nèi)時(shí)，試驗(yàn)方為有效。分別計(jì)算用檢查用水制成的內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)溶液的反應(yīng)終點(diǎn)濃度的幾何平均值（ES）和用供試品溶液和稀釋液制成的內(nèi)毒素溶液的反應(yīng)終點(diǎn)濃度的幾何平均值（Et）；

ES=lg-1(ΣXS/4)Et=lg-1(ΣXt/4)當(dāng)ES在0.5λ～2λ(包括0.5λ和2λ)及Et在0.5ES～

2ES（包括0.5ES和2ES）時(shí)，認(rèn)為供試品在該濃度下無(wú)干擾作用。當(dāng)前58頁(yè)，總共85頁(yè)。內(nèi)毒素濃度2.0λλ0.5λ0.25λ終點(diǎn)內(nèi)毒素/檢查用水（系列溶液C）●●○○λ●●○○λ●●○○λ●●○○λ陰性對(duì)照（溶液D）○○內(nèi)毒素/供試品溶液（系列溶液B）●●○○λ●●○○λ●○○○2.0λ●○○○2.0λ供試品陰性對(duì)照（溶液A）○○

ES=lg-1(ΣXS/4)＝λEt=lg-1(ΣXt/4)＝1.41λ當(dāng)前59頁(yè)，總共85頁(yè)。當(dāng)存在干擾時(shí)，可通過(guò)對(duì)供試品進(jìn)行更大倍數(shù)的稀釋或有關(guān)其他適宜的方法（如過(guò)濾、中和、透析或加熱處理等）排除干擾。導(dǎo)致干擾的因素：排除干擾的方法：pH值稀釋抗凝因子中和螯合劑過(guò)濾葡聚糖加熱當(dāng)前60頁(yè)，總共85頁(yè)。檢查法－凝膠法凝膠限量試驗(yàn)?zāi)z半定量試驗(yàn)當(dāng)前61頁(yè)，總共85頁(yè)。凝膠限量試驗(yàn)檢驗(yàn)供試品中的內(nèi)毒素含量是否小于限度的定性方法。編號(hào)內(nèi)毒素濃度/配制內(nèi)毒素的溶液平行管數(shù)A供試品溶液無(wú)/供試品溶液2B供試品陽(yáng)性對(duì)照2λ/供試品溶液2C陽(yáng)性對(duì)照2λ/檢查用水2D陰性對(duì)照無(wú)/檢查用水2當(dāng)陰性對(duì)照溶液D的平行管均為陰性，供試品陽(yáng)性對(duì)照溶液B的平行管均為陽(yáng)性，陽(yáng)性對(duì)照溶液C的平行管均為陽(yáng)性，試驗(yàn)有效當(dāng)前62頁(yè)，總共85頁(yè)。例：替硝唑注射液，計(jì)算限值為0.5EU/ml，使用靈敏度為0.125EU/ml的鱟試劑進(jìn)行檢驗(yàn)，計(jì)算：

MVD＝1.0ml/ml×0.5EU/ml÷0.125EU/ml＝4倍供試品溶液：4倍替硝唑稀釋液供試品陽(yáng)性對(duì)照為：含0.25EU/ml標(biāo)準(zhǔn)內(nèi)毒素的4倍替硝唑稀釋液陽(yáng)性對(duì)照為：濃度為0.25EU/ml的標(biāo)準(zhǔn)內(nèi)毒素溶液當(dāng)前63頁(yè)，總共85頁(yè)。凝膠限量試驗(yàn)結(jié)果判斷供試品溶液供試品陽(yáng)性對(duì)照陰性對(duì)照陽(yáng)性對(duì)照○○●●○○●●試驗(yàn)有效當(dāng)前64頁(yè)，總共85頁(yè)。凝膠限量試驗(yàn)結(jié)果判斷供試品溶液供試品陽(yáng)性對(duì)照陰性對(duì)照陽(yáng)性對(duì)照○○●●○○●●此批替硝唑注射液的內(nèi)毒素含量小于0.5EU/ml，符合規(guī)定供試品溶液供試品陽(yáng)性對(duì)照陰性對(duì)照陽(yáng)性對(duì)照●●●●○○●●此批替硝唑注射液的內(nèi)毒素含量不小于0.5EU/ml，不符合規(guī)定當(dāng)前65頁(yè)，總共85頁(yè)。凝膠限量試驗(yàn)結(jié)果判斷供試品溶液供試品陽(yáng)性對(duì)照陰性對(duì)照陽(yáng)性對(duì)照○●●●○○●●須復(fù)試復(fù)試時(shí)，供試品溶液需做4支平行管，若所有平行管均為陰性，判供試品符合規(guī)定；四管中如有一管為陽(yáng)性，即可判供試品不符合規(guī)定。供試品溶液供試品陽(yáng)性對(duì)照陰性對(duì)照陽(yáng)性對(duì)照○○○○●●○○●●當(dāng)前66頁(yè)，總共85頁(yè)。凝膠半定量試驗(yàn)半定量試驗(yàn)是使用凝膠法估測(cè)供試品中內(nèi)毒素含量的方法，系通過(guò)反應(yīng)終點(diǎn)濃度來(lái)量化供試品中內(nèi)毒素的含量。原理：通過(guò)供試品系列稀釋液與鱟試劑反應(yīng)，其反應(yīng)終點(diǎn)濃度的稀釋倍數(shù)與鱟試劑靈敏度的乘積即為供試品的內(nèi)毒素含量。當(dāng)前67頁(yè)，總共85頁(yè)。凝膠半定量試驗(yàn)操作：用檢查用水將供試品溶液從已確定的不干擾濃度和稀釋倍數(shù)下開(kāi)始進(jìn)行對(duì)倍稀釋，制備成2、4、8倍的稀釋液，但最大稀釋倍數(shù)不得超過(guò)所使用鱟試劑的MVD。當(dāng)前68頁(yè)，總共85頁(yè)。凝膠半定量試驗(yàn)溶液的制備編號(hào)內(nèi)毒素濃度/配制內(nèi)毒素的溶劑稀釋用液稀釋倍數(shù)所含內(nèi)毒素的濃度平行管數(shù)A無(wú)/供試品溶液檢查用水1－22－24－28－2B2λ/供試品溶液2λ2C2λ/檢查用水檢查用水12λ221λ240.5λ280.25λ2D無(wú)/檢查用水－－－2A：沒(méi)有超過(guò)MVD并且通過(guò)干擾試驗(yàn)的供試品系列稀釋液；B：供試品陽(yáng)性對(duì)照（為確證不存在干擾作用）；C：標(biāo)準(zhǔn)內(nèi)毒素系列（為確證本試驗(yàn)的操作和環(huán)境都符合規(guī)定）；D：陰性對(duì)照。當(dāng)前69頁(yè)，總共85頁(yè)。凝膠半定量試驗(yàn)－結(jié)果判斷當(dāng)陰性對(duì)照溶液D的平行管均為陰性；供試品陽(yáng)性對(duì)照溶液B的平行管均為陽(yáng)性；系列溶液C的反應(yīng)終點(diǎn)濃度的幾何平均值在0.5λ～2λ之間，則試驗(yàn)有效。若內(nèi)毒素濃度小于規(guī)定的限度，判供試品符合規(guī)定。若內(nèi)毒素濃度大于或等于規(guī)定的限度，判供試品不符合規(guī)定。當(dāng)前70頁(yè)，總共85頁(yè)。凝膠半定量試驗(yàn)－結(jié)果計(jì)算內(nèi)毒素濃度2.0λλ0.5λ0.25λ終點(diǎn)標(biāo)準(zhǔn)內(nèi)毒素系列溶液C●●●○0.5λ●●○○λ稀釋倍數(shù)1248供試品系列溶液A●●●○4×λ●●○○2×λ供試品陽(yáng)性對(duì)照溶液B●●陰性對(duì)照溶液D○○CE＝lg-1(ΣX/2)=lg-1[(lg4λ+lg2λ)/2]=2.83λ當(dāng)前71頁(yè)，總共85頁(yè)。例：右旋糖酐20葡萄糖注射液，限值為0.5EU/ml；通過(guò)使用3個(gè)鱟試劑廠家的鱟試劑對(duì)3個(gè)不同廠家的7個(gè)樣品進(jìn)行干擾試驗(yàn)證實(shí)：右旋糖酐20葡萄糖注射液稀釋2倍后即不干擾內(nèi)毒素檢查；使用靈敏度為0.03EU/ml的鱟試劑對(duì)一批右旋糖酐20葡萄糖注射液進(jìn)行凝膠半定量試驗(yàn)。MVD＝0.5EU/ml÷0.03EU/ml＝16.67倍從已確定不干擾的稀釋倍數(shù)2倍起，再進(jìn)行1、2、4、8倍稀釋(相當(dāng)于將供試品原液進(jìn)行了2、4、8、16倍稀釋，最終的稀釋倍數(shù)沒(méi)有超MVD)。當(dāng)前72頁(yè)，總共85頁(yè)。內(nèi)毒素濃度0.060.030.0150.0075終點(diǎn)標(biāo)準(zhǔn)內(nèi)毒素系列溶液C●●●○0.015●●○○0.03稀釋倍數(shù)1248供試品系列溶液A●●●○4×0.03●●○○2×0.03供試品陽(yáng)性對(duì)照溶液B●●陰性對(duì)照溶液D○○CE＝lg-1(ΣX/2)=lg-1[(lg4λ+lg2λ)/2]=2.83λ＝0.0849EU/ml當(dāng)前73頁(yè)，總共85頁(yè)。如果檢驗(yàn)時(shí)采用的是供試品的稀釋液，則計(jì)算原始溶液內(nèi)毒素濃度時(shí)要將結(jié)果乘上稀釋倍數(shù)。由于檢驗(yàn)時(shí)采用的是右旋糖酐20葡萄糖注射液的最小不干擾稀釋倍數(shù)－2倍稀釋液，因此計(jì)算原始溶液內(nèi)毒素濃度時(shí)要將結(jié)果乘上稀釋倍數(shù)2；原右旋糖酐20葡萄糖注射液中內(nèi)毒素含量為：2×0.0849EU/ml＝0.170EU/ml當(dāng)前74頁(yè)，總共85頁(yè)。如試驗(yàn)中供試品溶液的結(jié)果均為陰性，應(yīng)記為內(nèi)毒素濃度小于λ（如果檢驗(yàn)的是稀釋過(guò)的供試品，則記錄為小于λ乘以該供試品的最低稀釋倍數(shù)）。內(nèi)毒素濃度0.060.030.0150.0075終點(diǎn)標(biāo)準(zhǔn)內(nèi)毒素系列溶液C●●●○0.015●●○○0.03稀釋倍數(shù)1248供試品系列溶液A○○○○＜1×0.03○○○○＜1×0.03供試品陽(yáng)性對(duì)照溶液B●●陰性對(duì)照溶液