探討β-catenin蛋白敲除抗肺纖維化作用的細(xì)胞機(jī)制,病理學(xué)論文

探討β-catenin蛋白敲除抗肺纖維化作用的細(xì)胞機(jī)制,病理學(xué)論文肺纖維化是呼吸系統(tǒng)疾病發(fā)展至晚期的共同病理改變,造成肺功能不可逆的損傷,嚴(yán)重危害人類健康。當(dāng)前研究以為,肺纖維化的基本病理經(jīng)過(guò)包括早期彌漫性肺泡炎及后期大量間質(zhì)細(xì)胞增生,發(fā)生基質(zhì)膠原的進(jìn)行性積聚以致逐步取代正常的肺組織構(gòu)造,嚴(yán)重影響肺的通氣和換氣功能。在增生的細(xì)胞中,除肺泡上皮細(xì)胞和成肌細(xì)胞等外,成纖維細(xì)胞的增殖及活化并分泌基質(zhì)膠原是纖維化構(gòu)成的重要機(jī)制。TGF-1被以為是誘導(dǎo)肺成纖維細(xì)胞活化的最重要的細(xì)胞因子,其作用的發(fā)揮與-catenin途徑高度相關(guān)。本研究通過(guò)觀察-catenin蛋白敲除對(duì)TGF-1誘導(dǎo)的肺成纖維細(xì)胞的增殖及活性的影響,討論-catenin蛋白敲除抗肺纖維化作用的細(xì)胞機(jī)制,為肺纖維化的治療提供新的思路。1、材料與方式方法1.1主要試劑及物品大鼠肺成纖維細(xì)胞(CCC-REPF-1),pcDNA3.0載體(Invitrogen),F-TrCP-Ecad載體(鄭國(guó)平教授惠贈(zèng)),Lipofectamine2000(Invitrogen),TGF-1(PeproTech),抗E-cadherin,抗-SMA,抗Fn(SantaCruz),FITC標(biāo)志的羊抗小鼠IgG(武漢博士德生物工程有限公司),胎牛血清(中國(guó)杭州四季青),高糖DMEM培養(yǎng)基(GIBCO),TRIzol總RNA提取試劑(武漢博士德生物工程有限公司),逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(Promega),實(shí)時(shí)熒光定量試劑盒(上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司),-SMA引物、colⅠ引物、colⅢ引物、GAPDH引物(上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司)。1.2肺成纖維細(xì)胞培養(yǎng)、傳代及分組在體外培養(yǎng)的大鼠肺成纖維細(xì)胞(CCC-REPF-1),用含10%胎牛血清、100U/mL青霉素、100g/mL鏈霉素的高糖DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)于5%的CO2,37℃人工培養(yǎng)箱中,細(xì)胞呈貼壁生長(zhǎng),進(jìn)行傳代培養(yǎng)。細(xì)胞分組,分為正常細(xì)胞組、TGF-1刺激組、pcDNA3轉(zhuǎn)染組、F-TrCP-Ecad轉(zhuǎn)染組。1.3pcDNA3及F-TrCP-Ecad轉(zhuǎn)染CCC-REPF-1細(xì)胞提取及純化重組質(zhì)粒DNA,測(cè)DNA濃度備用。取對(duì)數(shù)期細(xì)胞消化,調(diào)整細(xì)胞數(shù)為2105cells/L,接種12孔板中,觀察細(xì)胞生長(zhǎng)至80%~90%時(shí),棄培液,換無(wú)血清無(wú)雙抗培養(yǎng)基800L,準(zhǔn)備轉(zhuǎn)染。100L無(wú)雙抗、胎牛血清的培養(yǎng)基中參加4ng質(zhì)粒,混合后置5min,共6個(gè)EP管,3管為質(zhì)粒pcDNA3,3管為質(zhì)粒F-TrCP-Ecad,100L無(wú)雙抗、胎牛血清的培養(yǎng)基中參加4LLipofectamine2000混合后置5min,6個(gè)EP管,將上述復(fù)合物混合后置20min,棄12孔板6孔的培養(yǎng)基,用無(wú)雙抗、胎牛血清的培養(yǎng)基清洗2次,加無(wú)雙抗、胎牛血清的培養(yǎng)基800L,將上述復(fù)合物分別參加6個(gè)孔,前后晃置4~6h換正常培養(yǎng)基。轉(zhuǎn)染6h換新鮮培養(yǎng)基,各組分別參加TGF-1(5ng/mL),作用48h。1.4CCK-8法檢測(cè)肺成纖維細(xì)胞增殖將各組細(xì)胞調(diào)整細(xì)胞濃度至5000個(gè)/100L,以每孔100L接種于96孔板,每組復(fù)設(shè)8孔,每板每孔參加CCK-810L,5%CO2孵育箱內(nèi)繼續(xù)孵育1h,分光光度計(jì)下測(cè)定450nm波長(zhǎng)處OD值。1.5Western印跡檢測(cè)細(xì)胞中E-cadherin、-SMA、Fn的表示出取細(xì)胞用PBS洗滌后轉(zhuǎn)移到EP管,離心后棄上清,將收集到的細(xì)胞加細(xì)胞裂解液裂解1h后,離心30min,取上清,BCA蛋白質(zhì)定量法測(cè)定蛋白濃度,取等量蛋白30L行SDS-PVDF凝膠電泳,轉(zhuǎn)膜至PVDF膜,條件4℃2~5h,5%脫脂牛奶封閉2h。在4℃下小鼠抗大鼠E鈣黏蛋白、-SMA、纖維連接蛋白單克隆抗體(稀釋為1∶200)與膜接觸孵育過(guò)夜,用洗膜緩沖液(TBST)在脫色搖床下洗膜5min5次,加羊抗小鼠IgG,室溫下孵育2h后,TBST洗膜,參加ECL在室溫下反響5min后成像,Taiphone掃描結(jié)果,采用GeneSnap/GeneTool軟件分析以GAPDH蛋白為內(nèi)參定量分析E鈣黏蛋白、-SMA、纖維連接蛋白條帶相對(duì)灰度值。1.6總RNA抽提及實(shí)時(shí)熒光定量逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反響(Real-timePCR)各組細(xì)胞每孔參加500LTRIzolReagent,按試劑盒講明提取總RNA及行RT-PCR檢測(cè)-SMA、colⅠ、colⅢ表示出,GAPDH為內(nèi)參。GAPDH引物序列:上游引物5ˊ-GGTGCT-GAGTATGTCGTGGAGT-3ˊ下游引物5ˊ-CAGTCTTCTGAGTGGCAGTGAT-3,-SMA上游引物5ˊ-AGCCAGTCGCCATCAGGAAC-3ˊ下游引物5ˊ-GGGAGCATCATCCCAGCAA-3ˊ,colⅠ:上游引物5ˊ-GACATGTTCAGCTTTGTGTACCTC-3ˊ下游引物5ˊ-GGGACCCTTAGGCCATTGTGA-3ˊcolⅢ:上游引物5ˊ-TTTGGCACAGCAGTCCAATGTA-3ˊ下游引物5ˊ-GACAGATCCCGAGTTCGCAGA-3ˊ。PCR反應(yīng)體系條件:95℃20s;95℃3s,60℃30s。40個(gè)循環(huán)。由隨機(jī)附帶軟件計(jì)算出Ct值和拷貝數(shù)。1.7統(tǒng)計(jì)學(xué)方式方法計(jì)量資料采用均數(shù)標(biāo)準(zhǔn)差表示,數(shù)據(jù)處理采用SPSS19.0軟件進(jìn)行t檢驗(yàn)或方差分析,P0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。2、結(jié)果2.1肺成纖維細(xì)胞光鏡下觀察成纖維細(xì)胞呈梭型,有較長(zhǎng)的突起,胞核呈卵圓形,位于細(xì)胞,成放射狀和柵欄狀排列。TGF-1刺激后,細(xì)胞體積明顯增大,胞突消失,細(xì)胞數(shù)量明顯增加,細(xì)胞間隙變小。F-TrCP-Ecad轉(zhuǎn)染組大部分細(xì)胞呈梭型,有較長(zhǎng)的突起,細(xì)胞間有明顯間隙。2.2CCK-8法觀察各組肺成纖維細(xì)胞增殖與正常組比擬,TGF-1刺激組、pcDNA3轉(zhuǎn)染組其OD值明顯增高,但兩組比擬,無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異;F-TrCP-Ecad轉(zhuǎn)染組OD值較TGF-1刺激組明顯減低(P0.01),與正常組比擬無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。見(jiàn)表1。2.3Western印跡法檢測(cè)各組細(xì)胞中-SMA、Fn、E-cadherin的表示出與正常組比擬,TGF-1刺激組、pcDNA3轉(zhuǎn)染組其-SMA、Fn蛋白表示出顯著升高,E-cadherin表示出顯著降低(P0.01),而兩組比擬無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異;F-TrCP-Ecad轉(zhuǎn)染組較TGF-1刺激組-SMA、Fn蛋白表示出顯著降低,E-cadherin表示出顯著升高(P0.01),與正常組比擬無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。見(jiàn)表2。2.4熒光實(shí)時(shí)定量RT-PCR檢測(cè)-SMA、colⅠ、colⅢ表示出與正常組比擬,TGF-1刺激組、pcDNA3轉(zhuǎn)染組-catenin途徑-SMA,colⅠ,colⅢmRNA表示出增高(P0.01),而兩組比擬無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異,F-TrCP-Ecad轉(zhuǎn)染組較TGF-1刺激組-SMA、colⅠ、colⅢ表示出降低(P0.01),與正常組比擬無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。見(jiàn)表3。3、討論肺成纖維細(xì)胞增殖與活性加強(qiáng)是肺纖維化發(fā)生的重要的致病經(jīng)過(guò),對(duì)其機(jī)制的研究并尋找新的治療靶點(diǎn)是當(dāng)前研究的焦點(diǎn)。肺纖維化經(jīng)過(guò)中在TGF-1刺激下使肺成纖維細(xì)胞不斷地增殖和轉(zhuǎn)型為肌成纖維細(xì)胞(myofibroblast,MB)。MB是一種特殊階段的FB,能夠大量分泌ECM,分泌能力是FB的4~5倍,大量表示出-SMA、Fn、I、III型膠原,加速纖維化進(jìn)程。TGF-1是誘導(dǎo)肺成纖維細(xì)胞活化發(fā)生的最重要的生長(zhǎng)因子,TGF-1發(fā)揮作用的途徑包括Smad、-catenin和非Smad通路,其-catenin途徑與疾病及纖維化構(gòu)成的病理經(jīng)過(guò)高度相關(guān)。Vuga,etal發(fā)現(xiàn)WNT5A基因途徑在IPF的肺成纖維細(xì)胞較正常肺成纖維細(xì)胞有顯著地調(diào)節(jié)意義,通過(guò)非經(jīng)典的WNT/-catenin途徑WNT5A激活顯著地誘導(dǎo)肺成纖維細(xì)胞增殖同時(shí)抑制細(xì)胞凋亡。Chilosi等報(bào)道了在特發(fā)性肺纖維化(IPF)患者受損支氣管基底細(xì)胞和損傷部位肺成纖維細(xì)胞中可見(jiàn)-catenin向細(xì)胞核內(nèi)轉(zhuǎn)移、積聚,提示-catenin與肺纖維化及肺成纖維細(xì)胞活性的相關(guān)性,因而我們?cè)O(shè)想通過(guò)抑制-catenin功能可能對(duì)肺纖維化發(fā)揮治療作用。F-TrCP-Ecad質(zhì)粒是Cong等設(shè)計(jì)的-catenin靶向降解質(zhì)粒,只降解細(xì)胞質(zhì)中的-catenin蛋白,而不毀壞細(xì)胞膜上的-catenin蛋白,進(jìn)而減少其向細(xì)胞核內(nèi)的轉(zhuǎn)移,降低其轉(zhuǎn)錄活性。本研究采用該載體轉(zhuǎn)染大鼠成纖維細(xì)胞,觀察阻斷-catenin途徑對(duì)肺成纖維細(xì)胞增殖及活性的影響。結(jié)果顯示:TGF-1刺激48h后,成纖維細(xì)胞體積明顯增大,胞突消失,細(xì)胞數(shù)量明顯增加,細(xì)胞間隙變小,F-TrCP-Ecad轉(zhuǎn)染組大部分細(xì)胞呈梭型,有較長(zhǎng)的突起,細(xì)胞間有明顯間隙。CCK-8法檢測(cè)F-TrCP-Ecad轉(zhuǎn)染組肺成纖維細(xì)胞增殖較TGF-1刺激組明顯降低。F-TrCP-Ecad轉(zhuǎn)染組肺成纖維細(xì)胞間質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物-SMA、Fn蛋白表示出量明顯低于TGF-1刺激組,E-cadherin表示出量較TGF-1刺激組增高。F-TrCP-Ecad轉(zhuǎn)染組大鼠肺成纖維細(xì)胞-catenin途徑轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物-SMA、colⅠ、colⅢ表示出明顯降低,證實(shí)-catenin蛋白敲除通過(guò)降解細(xì)胞質(zhì)中的-catenin蛋白,減少