土壤中產(chǎn)淀粉酶芽孢桿菌的篩選與鑒定及淀粉酶活的測(cè)定

土壤中產(chǎn)淀粉酶芽孢桿菌的篩選與鑒定及淀粉酶活的測(cè)定摘要：從飯?zhí)瞄T口和生化樓樓下的土壤中分離、純化、培養(yǎng)獲得七個(gè)菌株，其中五個(gè)為能分泌淀粉的芽孢桿菌，通過一系列生理生化實(shí)驗(yàn)，對(duì)其中兩個(gè)菌株的種屬進(jìn)行了初步鑒定，并對(duì)其中一株菌所產(chǎn)的淀粉酶活力進(jìn)行了測(cè)定。關(guān)鍵字：土壤芽孢桿菌淀粉酶鑒定活力土壤微生物類群在全球自然生態(tài)系統(tǒng)中具有不可替代的作用,它推動(dòng)著生態(tài)系統(tǒng)的能量流動(dòng)和物質(zhì)循環(huán),維持生態(tài)系統(tǒng)的正常運(yùn)轉(zhuǎn),是生態(tài)系統(tǒng)中的重要組成部分,在土壤中的分布既反映土壤、植物和氣候等綜合因素對(duì)微生物的影響和作用,同時(shí)其生命活動(dòng)也反映出土壤肥力、土壤改良與植物營(yíng)養(yǎng)的密切關(guān)系。芽孢桿菌是土壤細(xì)菌中最具活力的部分之一,也是土壤細(xì)菌的主要種群之一。本實(shí)驗(yàn)通過小組合作，由老師指導(dǎo)，小組自行設(shè)計(jì)、進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，對(duì)土壤微生物進(jìn)行分離、純化及鑒定，發(fā)酵及產(chǎn)物測(cè)定，對(duì)學(xué)生的實(shí)驗(yàn)?zāi)芰M(jìn)行一個(gè)比較全方面的鍛煉和培養(yǎng)。（1）了解微生物分離純化的原理及微生物分離純化常用方法和技術(shù)；（2）掌握從土壤中篩選產(chǎn)淀粉酶菌株的原理及方法；（3）掌握微生物的搖瓶培養(yǎng)方法及淀粉酶活力測(cè)定的原理及方法；（4）培養(yǎng)學(xué)生自行設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)流程、綜合分析解決問題及判斷實(shí)驗(yàn)結(jié)果的能力；（5）對(duì)所學(xué)習(xí)過的微生物實(shí)驗(yàn)方法進(jìn)行綜合技能訓(xùn)練；（6）從不同環(huán)境土壤樣品中篩選出能產(chǎn)淀粉酶的芽孢桿菌，并分析比較各產(chǎn)淀粉酶菌株的產(chǎn)淀粉酶活力及總結(jié)各芽孢桿菌在土壤中的分布情況。1.原理及方法概述1.1原理1.1.1芽孢桿菌形態(tài)學(xué)特性：芽孢桿菌細(xì)胞呈直桿狀，0.5-2.5μm×1.2-10μm，常以成對(duì)或鏈狀排列，具圓端或方端。細(xì)胞染色大多數(shù)在幼齡培養(yǎng)時(shí)呈現(xiàn)革蘭氏陽性，以周生鞭毛運(yùn)動(dòng)。芽孢橢圓、卵圓、柱狀、圓形，能抗許多不良環(huán)境。生理學(xué)特性：芽孢桿菌屬，革蘭氏陽性，嚴(yán)格需氧或兼性厭氧的有莢膜的桿菌。多數(shù)為腐生菌,主要分布于土壤、動(dòng)植物體表及水體中。該屬細(xì)菌的重要生理特性是能夠產(chǎn)生對(duì)對(duì)熱、pH和鹽各種多樣性的不利條件具有特殊抵抗力的芽孢。生孢不被氧所抑制。發(fā)現(xiàn)于不同的生境，少數(shù)種對(duì)脊椎動(dòng)物和非脊椎動(dòng)物致病。）1.1.2淀粉酶淀粉酶是催化淀粉水解的一類酶的總稱，廣泛存在于動(dòng)物、植物和微生物中。目前生產(chǎn)應(yīng)用的淀粉酶主要來源于微生物，并集中在幾種細(xì)菌和真菌中，尤其以芽孢桿菌所產(chǎn)的淀粉酶較多。其原因首先芽孢桿菌屬中能產(chǎn)生淀粉酶的菌種較多；其次，芽孢桿菌屬產(chǎn)的淀粉酶有較好的應(yīng)用價(jià)值。土壤中可利用的微生物很多，因此從土壤中篩選產(chǎn)淀粉酶的芽孢桿菌，分離純化，并進(jìn)行酶活測(cè)定，能獲得有經(jīng)濟(jì)價(jià)值比較高的菌株。1.1.4生理生化鑒定由于各種細(xì)菌具有不同的酶系統(tǒng)，所以它們能利用的底物（如糖、醇及各種含氮物質(zhì)等）不同，或雖利用相同的底物但產(chǎn)生的代謝產(chǎn)物卻不相同，因此可利用各種生理生化反應(yīng)來鑒別不同的細(xì)菌。根據(jù)《伯杰氏細(xì)菌學(xué)手冊(cè)》，在芽孢桿菌屬中，我們鑒定用的生理生化實(shí)驗(yàn)有：（1）革蘭氏染色試驗(yàn)（2）芽孢染色試驗(yàn)(3)淀粉水解試驗(yàn)（4）吲哚試驗(yàn)（5）VP試驗(yàn)（6）細(xì)菌糖發(fā)酵試驗(yàn)（葡萄糖、木糖、阿拉伯糖、甘露醇）（7）耐鹽試驗(yàn)（8）溫度實(shí)驗(yàn)（9）PH試驗(yàn)(10)檸檬酸鹽利用試驗(yàn)(11)硝酸鹽還原試驗(yàn)(12)明膠液化試驗(yàn)(13)酪氨酸水解試驗(yàn)(14)酪素水解試驗(yàn)(15)運(yùn)動(dòng)性試驗(yàn)（鞭毛穿刺試驗(yàn)）(16)接觸酶試驗(yàn)(17)溶菌酶試驗(yàn)(18)卵磷脂試驗(yàn)(19)馬尿酸鹽實(shí)驗(yàn)（不做）（20）苯丙氨酸實(shí)驗(yàn)（不做）（21）精氨酸水解實(shí)驗(yàn)（不做）1.2方法1.2.1分離純化方法從混雜微生物群體中獲得只含有某一種或某一株微生物的過程稱為微生物分離與純化。由于芽孢具有較強(qiáng)抗熱能力，分離純化時(shí)可采用熱處理的方法，高溫加熱處理，殺死樣品中所有不含芽孢的菌類，在培養(yǎng)過程中得到很好的富集。平板分離法普遍用于微生物的分離與純化。其基本原理是選擇適合與待分離微生物的生長(zhǎng)條件，如營(yíng)養(yǎng)成分、酸堿度、溫度和氧等要求，或加入某種抑制劑造成只利于該微生物生長(zhǎng)，而抑制其他微生物生長(zhǎng)的環(huán)境，從而淘汰一些不需要的微生物。微生物在固體培養(yǎng)基上生長(zhǎng)形成的單個(gè)菌落，通常是由一個(gè)細(xì)胞繁殖而成的集合體。因此可通過挑取單菌落而獲得一種純培養(yǎng)。獲取單個(gè)菌落的方法可通過稀釋涂布平板或平板劃線等技術(shù)完成。值得指出的是，從微生物群體中經(jīng)分離生長(zhǎng)在平板上的單個(gè)菌落并不一定保證是純培養(yǎng)。因此，純培養(yǎng)的確定除觀察其菌落特征外，還要結(jié)合顯微鏡檢測(cè)個(gè)體形態(tài)特征后才能確定，有些微生物的純培養(yǎng)要經(jīng)過一系列分離與純化過程和多種特征鑒定才能得到。1.2.2單染色用一種染色劑對(duì)涂片進(jìn)行染色，簡(jiǎn)便易行，適于進(jìn)行微生物的形態(tài)觀察。在一般情況下，細(xì)菌菌體多帶負(fù)電荷，易于和帶正電荷的堿性染料結(jié)合而被染色。因此，常用堿性染料進(jìn)行單染色，如美藍(lán)、孔雀綠、堿性復(fù)紅、結(jié)晶紫和中性紅等。若使用酸性染料，多用剛果紅、伊紅、藻紅和酸性品紅等。使用酸性染料時(shí)，必須降低染液的PH值，使其呈現(xiàn)強(qiáng)酸性（低于細(xì)菌菌體等電點(diǎn)），讓菌體帶正電荷，才易于被酸性染料染色。1.2.3芽孢染色細(xì)菌的芽孢的形狀、大小和著生位置是鑒定的重要依據(jù)。芽孢具有厚而致密的壁，透性低，不易著色，若用一般的染色法只能使菌體著色而芽孢不著色。其方法就是根據(jù)芽孢既難以染色而一旦著色后又難以脫色這一特點(diǎn)而設(shè)計(jì)的。1.2.4革蘭氏染色它可以將所有細(xì)菌分為革蘭氏陽性菌和革蘭氏陰性菌兩大類，是細(xì)菌學(xué)上最常用的鑒別性染色法，可以把它歸到生理生化鑒定上。其方法是先用結(jié)晶紫初染，再加媒染劑碘液以增加染料與細(xì)胞的親和力，使結(jié)晶紫和碘在細(xì)胞膜上形成相對(duì)分子質(zhì)量較大的復(fù)合物，然后進(jìn)行脫色（乙醇），最后用沙黃液復(fù)染。凡細(xì)菌不被脫色而保留初染劑的顏色者為陽性；如被脫色后又染上復(fù)染劑顏色（紅色）者則為陰性。1.2.5淀粉水解試驗(yàn)有些細(xì)菌具有合成淀粉酶的能力，可以分泌胞外淀粉酶。淀粉酶可以使淀粉水解為麥芽糖和葡萄糖，淀粉水解后遇碘不再變藍(lán)色。因此可用于篩選產(chǎn)淀粉酶的芽孢桿菌。1.2.6搖瓶發(fā)酵的測(cè)定原理（1）淀粉—水解（淀粉酶）—生成麥芽糖（還原糖）（2）在堿性條件下，還原糖與3,5-二硝基水楊酸共熱，3,5-二硝基水楊酸被還原為3-氨基-5-硝基水楊酸(棕紅色物質(zhì))，還原糖則被氧化成糖酸及其它產(chǎn)物。在一定范圍內(nèi)，還原糖的量與棕紅色物質(zhì)顏色深淺的程度量呈一定的比例關(guān)系，在540nm波長(zhǎng)下測(cè)定棕紅色物質(zhì)的吸光值，查對(duì)標(biāo)準(zhǔn)曲線可求出樣品中還原糖的含量。（3）40℃時(shí)在5min內(nèi)水解淀粉釋放1mg麥芽糖所需的酶量為1個(gè)酶活力單位（U）計(jì)算公式:酶活力單位（U）=C酶×V酶×n（C酶—酶液中麥芽糖的濃度V酶—提取液的總體積n—酶液的稀釋倍數(shù)）2.實(shí)驗(yàn)材料與用具2.1材料土樣2種樣品1：生化樓樓下河道邊樣品2：菊苑飯?zhí)煤箝T附近2.2培養(yǎng)基2.2.1牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基牛肉膏（3g）蛋白胨（10g）氯化鈉（5g）瓊脂（15g）蒸餾水（1000ml）pH7.2-7.42.2.2淀粉水解試驗(yàn)培養(yǎng)基可溶性淀粉（2g）牛肉膏（3g）蛋白胨（10g）氯化鈉（5g）瓊脂（15g）蒸餾水（1000ml）pH7.2-硝酸鹽培養(yǎng)基甲液（對(duì)氨基苯磺酸0.8g+5mol/L醋酸100mL乙液（α-奈胺0.5g+5mol/醋酸100mL）硝酸鉀(0.2g)蛋白胨(5g)蒸餾水(1000ml)pH7.2-7.42.2.4卵黃試驗(yàn)培養(yǎng)基營(yíng)養(yǎng)瓊脂(3.3g)葡萄糖(1g)配成100ml培養(yǎng)基卵黃鹽水(5ml)卵黃、鹽水分別滅菌，按1:1制取培養(yǎng)基與卵黃鹽水混合倒平板2.2.5吲哚實(shí)驗(yàn)培養(yǎng)基蛋白胨(10g)氯化鈉(5g)蒸餾水(1000ml)pH7.2-7.42.2.6VP實(shí)驗(yàn)培養(yǎng)基蛋白胨(10g)氯化鈉(5g)葡萄糖(5g)蒸餾水(1000ml)pH7.2-7.42.2.7糖發(fā)酵實(shí)驗(yàn)培養(yǎng)基葡萄糖/木糖/甘露醇/阿拉伯糖（10g）蛋白胨(10g)氯化鈉(5g)K2HP04(0.2g)1％溴甲酚紫(3ml)蒸餾水(1000ml)pH7.2-酪氨酸水解試驗(yàn)培養(yǎng)基酪氨酸(0.5g稀釋到10ml)營(yíng)養(yǎng)瓊脂(3.3g稀釋到100ml)（分開滅菌，酪氨酸溶液110℃，營(yíng)養(yǎng)瓊脂121℃，用時(shí)再混合，）2.2.9酪素分解試驗(yàn)培養(yǎng)基脫脂奶粉（5g，稀釋到50ml）瓊脂（1.5稀釋到50ml）（分開滅菌，酪素110℃，營(yíng)養(yǎng)瓊脂121℃，現(xiàn)用現(xiàn)倒）2.2.10運(yùn)動(dòng)性試驗(yàn)培養(yǎng)基可溶性淀粉（2g）牛肉膏(3g)蛋白胨(10g)氯化鈉(5g)瓊脂(5g)蒸餾水(1000ml)pH7.2-1檸檬酸鹽試驗(yàn)培養(yǎng)基(制斜面）氯化鈉(5g)硫酸鎂(MgSO4·7H2O)(0.2g)磷酸二氫銨(1g)磷酸氫二鉀(1g)0.2%溴麝香草酚藍(lán)溶液(40mL)檸檬酸鈉(5g)蒸餾水(1000mL)pH2牛肉湯培養(yǎng)基牛肉膏(3g)蛋白胨(10g)氯化鈉(5g)蒸餾水(1000ml)瓊脂(20g)pH7.2-7.4和pH3種子培養(yǎng)基可溶性淀粉（2.0%）酵母膏（0.5%）蛋白胨（0.5%）NaCl（0.5%）KH2PO4（0.1%）蒸餾水（100mL）pH=6.02.2.14發(fā)酵培養(yǎng)基：可溶性淀粉（2.0%）酵母膏（0.5%）蛋白胨（0.5%）NaCl（0.5%）KH2PO4（0.1%）CaCl2·2H2O（0.05%）MgSO4·7H2O(0.05%)FeSO4·H2O(0.05%)蒸餾水100mLpH=6.0（培養(yǎng)基高壓蒸汽滅菌：利用水的沸點(diǎn)隨水蒸氣壓力的增加而上升，以達(dá)到100℃以上高溫（121℃）滅菌的方法。）2.3試劑1％HCl、蒸餾水、結(jié)晶紫染色液、草酸銨結(jié)晶紫染液、番紅染液、5％孔雀綠染色、碘液、95％乙醇、乙醚、40％NaOH、ɑ-酚萘、3,5-二硝基水楊酸（DNS試劑配制）、1mg/ml麥芽糖溶液2.4儀器鑰匙、錐形瓶、水浴鍋、膠頭滴管、移液槍、試管、培養(yǎng)皿、接種環(huán)、玻璃涂棒、酒精燈、高壓蒸汽滅菌鍋、恒溫培養(yǎng)箱、錐形瓶4個(gè)（2個(gè)種子培養(yǎng)、2個(gè)發(fā)酵培養(yǎng)）、試管2.5其他用品無菌防水紙袋、記號(hào)筆、標(biāo)簽、報(bào)紙、橡皮筋3實(shí)驗(yàn)方法與步驟3.1土樣采集樣品1：生化樓樓下河道邊樣品2：菊苑飯?zhí)煤箝T附近近3.1.1以1㎡為單位采用五點(diǎn)取樣法在各點(diǎn)采樣，距表層5---15㎝，用鑰匙在五點(diǎn)處各取1的土壤，裝入無菌防水紙袋，封口。稱重，編號(hào)1、記錄所取2個(gè)樣品周圍的環(huán)境狀況。3.2篩選菌株3.2.1初步篩選：稱取各土壤樣品10g于90ml無菌水的錐形瓶(錐形瓶中放有玻璃珠)1、2中(即為稀釋的土壤懸浮液)，塞好棉塞，充分振蕩20min，使土壤中菌體或芽孢子均勻分散，并置于80℃恒溫水浴中保持20min，/100℃恒溫水浴中保持10min，以殺死非芽孢的菌體。取各裝有9ml無菌水的試管5支，編號(hào)為10-2,10-3,10-4用移液槍吸取1號(hào)錐形瓶?jī)?nèi)土壤懸浮液1ml加入編號(hào)為10-2的試管中，并在試管內(nèi)輕輕反復(fù)吹洗數(shù)次，即成為10-2的土壤稀釋液；同法從編號(hào)10-2試管內(nèi)取1ml加入編號(hào)為10-3的試管中，并在試管內(nèi)輕輕反復(fù)吹洗數(shù)次，即成為10-3的土壤稀釋液；依次連續(xù)稀釋為10-4的土壤稀釋液。并同法完成另一份樣品的稀釋。3.2.2進(jìn)一步篩選純化：制備牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基，并在無菌操作下倒平板(共13個(gè)，19=2×3×2＋1其中2個(gè)土樣，3個(gè)稀釋度，每種2個(gè)平行對(duì)照，,1個(gè)為空白對(duì)照)。取各土樣稀釋度為10-2,10-3,10-4的懸浮液進(jìn)行涂布平板(每種樣品的每個(gè)稀釋度涂布3個(gè)平板)。用移液槍吸取各土樣各個(gè)稀釋度的土壤懸浮液100ul，放入平板中，用灼燒后的玻璃涂棒沿一個(gè)方向涂勻。并置于37℃溫箱中培養(yǎng)24h。（第一天）取出所有平板，觀察三個(gè)稀釋度下的平板的菌落數(shù)目，選取菌落數(shù)在30~300的平板，舍棄不符合的平板。在所選平板中選取形態(tài)大小顏色等不同的菌落6~8種，分別用接種環(huán)以無菌操作挑起，分別進(jìn)行分區(qū)劃線(3個(gè)區(qū))并做標(biāo)記。(按每種土樣選取5種菌計(jì)算，約10=2×5個(gè)平板)。將接種過的平板倒置于37℃溫箱中培養(yǎng)24h。繼續(xù)分區(qū)劃線，重復(fù)3次。（第二三四天）3.2.3鏡檢將第四次劃線得到的單個(gè)菌落進(jìn)行單染色。檢查獲得的菌種是否單一，是否為桿狀菌。若出現(xiàn)不同菌種則說明并未純化，則繼續(xù)劃線培養(yǎng)直至鏡檢菌落單一。單染色法涂片（1％HCl清潔，滴加1DH2O于載玻片，挑菌與水混勻）----干燥----固定（涂面朝上，微火，2-3次）----染色（冷卻，加結(jié)晶紫1-2d，染色1-2min）----水洗（倒去染色液沖洗至無色）----干燥----鏡檢。3.2.4篩選產(chǎn)淀粉酶菌株：將分離的單個(gè)菌落接種至淀粉水解培養(yǎng)基上，每個(gè)培養(yǎng)基接種3個(gè)菌落，每種菌接種一個(gè)平板。37℃溫箱中培養(yǎng)24h。記錄并編號(hào)。30-48h后，觀察培養(yǎng)基中是否有透明圈產(chǎn)生，挑選有透明圈的聚落則為能產(chǎn)淀粉酶的芽孢桿菌。（第五天）3.2.5再次鏡檢：挑選有透明圈的菌落，再進(jìn)行革蘭氏染色和芽孢染色，驗(yàn)證菌落為紫色，革蘭氏陽性菌且有綠色芽孢出現(xiàn)。以致確定其具有芽孢，為芽孢桿菌。革蘭氏染色涂片----干燥----固定----初染（加草酸銨結(jié)晶紫染液1-2min后，倒去沖洗至無色）----媒染（碘液沖去涂面1min，水洗）----脫色（95％酒精，25s，立即沖洗）----復(fù)染（番紅染液1min，水洗吸干）----鏡檢。芽孢染色涂片----干燥----固定----加溫染色（加5％孔雀綠染色，微火加熱至冒蒸汽維持5min）----冷卻水洗（至無色）----復(fù)染（加番紅染色2min，水洗吸干）----油鏡鏡檢。(芽孢染色要培養(yǎng)30h，我們直接從鑒定淀粉水解酶的培養(yǎng)基中挑出菌進(jìn)行了芽孢染色)。在不同培養(yǎng)基中挑選所得滿足條件的菌種并編號(hào)A、B、C......假設(shè)一共n種菌。接種至斜面培養(yǎng)基上進(jìn)行擴(kuò)增培養(yǎng)，每種菌接種兩支試管，一支保存，一支進(jìn)行各項(xiàng)生化鑒定。37℃溫箱中培養(yǎng)24h。標(biāo)明菌種產(chǎn)地。3.3菌種鑒定：3.3.1形態(tài)學(xué)鑒定：群體：從各試管斜面培養(yǎng)基上取菌種重新接種到新的平板上，37℃溫箱中培養(yǎng)24h。觀察其形態(tài)特征（大小、顏色、干濕、邊緣、質(zhì)地、氣味、是否易被挑起）個(gè)體單染色（桿狀，排列方式，大?。└锾m氏染色（陽性）芽孢染色（菌體染成紫色，芽孢為綠色，產(chǎn)孢位置，大小等）3.3.2生理生化鑒定pH=5.7的耐酸性試驗(yàn)：A.將獲得的菌種分別接種到pH=5.7和pH=7.2的肉湯中(其中pH=7.2的肉湯做對(duì)照）B.置37℃溫箱中培養(yǎng)24hC.若培養(yǎng)基出現(xiàn)渾濁則用“＋”表示，代表該菌能耐酸，反之“-”。吲哚試驗(yàn)A.將獲得的菌種和空白對(duì)照分別接種到蛋白胨水培養(yǎng)液中B.置37℃溫箱中培養(yǎng)24hC.在各管內(nèi)加入乙醚1ml，充分振蕩，使吲哚萃取到乙醚中，靜置分層，然后沿管壁加入10d吲哚試劑，若有吲哚存在，則乙醚層顯玫瑰紅色，為陽性，用“＋”表示，反之用“-”。VP試驗(yàn)A.將獲得的菌種和空白對(duì)照分別接種到葡萄糖蛋白胨水培養(yǎng)液中B.置37℃溫箱中培養(yǎng)24hC.加入40％NaOH溶液10-20d，再加入等量ɑ-酚萘在37℃溫箱中保留15min，若培養(yǎng)液變紅，則為陽性，用“＋”表示，反之。糖發(fā)酵試驗(yàn)（產(chǎn)酸產(chǎn)氣）A.將獲得的菌種分別接種到葡萄糖、木糖、甘露醇、阿拉伯糖發(fā)酵水培養(yǎng)液中（杜氏小管)(各糖含量為1％）B.置37℃溫箱中培養(yǎng)24hC.若培養(yǎng)液變成黃色，則產(chǎn)酸，若杜氏小管中有氣泡，則產(chǎn)氣(整個(gè)過程中不能人為制造氣泡)酪氨酸水解試驗(yàn)A.將營(yíng)養(yǎng)瓊脂融化，冷卻至室溫，與酪氨酸混勻制成平板B.將獲得菌種接種到點(diǎn)接到培養(yǎng)基上，置37℃溫箱中培養(yǎng)24hC.記錄菌落周圍和下面的酪氨酸是否被分解而成透明酪素水解試驗(yàn)A.將獲得菌種接種到點(diǎn)接到培養(yǎng)基上B.置37℃溫箱中培養(yǎng)24hC.記錄菌落周圍和下面的酪素是否被分解而成透明運(yùn)動(dòng)性試驗(yàn)A.使用半固體營(yíng)養(yǎng)瓊脂試管，將接種針從直立柱培養(yǎng)基中央自上而下直刺到離管底1-1.5cm處，沿原穿刺線拔出接種針B.置于37℃恒溫箱培養(yǎng)24h。C.觀察是否產(chǎn)生樹根狀生長(zhǎng)，若有，則菌株有鞭毛，但是如果是需氧型的話會(huì)在培養(yǎng)基表面上形成一薄膜；若是不會(huì)運(yùn)動(dòng)的細(xì)菌，培養(yǎng)基中的穿刺線很清晰，直立生長(zhǎng)，則無鞭毛。檸檬酸鹽試驗(yàn)A.將獲得菌種接種到點(diǎn)接到培養(yǎng)基上B.置37℃溫箱中培養(yǎng)24hC.若培養(yǎng)基為藍(lán)色，則表明能利用檸檬酸鹽作為碳源生長(zhǎng)，以“+”表示。若培養(yǎng)基為綠色則為陰性，以“—”表示。（連續(xù)培養(yǎng)觀察大約一星期左右為宜）耐鹽性試驗(yàn)A.設(shè)置2％,5％,7％,10％鹽濃度梯度的培養(yǎng)基(用營(yíng)養(yǎng)瓊脂再加氯化鈉即可)B.將菌種接種在培養(yǎng)基上C.置37℃溫箱中培養(yǎng)24h，觀察并比較菌落長(zhǎng)勢(shì)0溫度試驗(yàn)A.設(shè)置5℃,25℃,45℃,37℃,60℃的溫度梯度B.將菌種接種到各個(gè)培養(yǎng)基上C.置不同溫度下培養(yǎng)24h1明膠液化試驗(yàn)A.穿刺接種，深度至明膠層2/3處，B.于37度溫箱培養(yǎng)24hC.取出靜置冰箱中待其凝固后，觀察是否被細(xì)菌液化，如被液化，則為陽性，能產(chǎn)生蛋白酶2硝酸鹽還原試驗(yàn)A.將菌種接到液體培養(yǎng)基中0123456麥芽糖標(biāo)準(zhǔn)溶液（ml）0蒸餾水（mL）2.00.60.20B.37度溫箱保持24hC.將甲、乙液等量混合后（約0.1mL）加入培養(yǎng)基內(nèi)，立即觀察結(jié)果若呈現(xiàn)紅色則為陽性“+”，若無紅色出現(xiàn)則為陰性“-”3卵黃試驗(yàn)A.點(diǎn)解卵黃試驗(yàn)培養(yǎng)基B.37度溫箱培養(yǎng)24hC.觀察分解情況，產(chǎn)生白色圓圈表示卵磷脂分解生成脂肪，說明有卵磷脂酶。用“＋”表示有透明圈，反之“-”。4溶菌酶試驗(yàn)A.先配制0.1％的無菌溶菌酶母液B.與肉湯培養(yǎng)基混合成0.01％的培養(yǎng)基C.接種并37℃溫箱24h培養(yǎng)，觀察若肉湯澄清則被溶菌酶抑制，用“-”表示，渾濁則不被溶菌酶抑制，用“+”表示5過氧化氫酶試驗(yàn)A.挑選菌種于玻片上，并固定干燥C.滴加過氧化氫觀察是否產(chǎn)生起泡，能夠產(chǎn)生起泡的菌種能夠產(chǎn)過氧化氫酶，用“+”表示，反之則用“-”。3.3.3定種根據(jù)《伯杰氏細(xì)菌學(xué)手冊(cè)》及各個(gè)鑒定項(xiàng)目的結(jié)果，給所挑選的菌株鑒定到種3.4酶活測(cè)定3.4.1標(biāo)準(zhǔn)曲線制作麥芽糖標(biāo)準(zhǔn)溶液配制0.1g麥芽糖+100mL蒸餾水按照下表配制麥芽糖梯度溶液各加3，5－二硝基水楊酸試劑2ml,沸水浴準(zhǔn)確煮沸5min，取出冷卻，用蒸餾水稀釋至20ml在分光光度計(jì)在波長(zhǎng)520nm進(jìn)行比色，記錄吸光值以吸光值為縱坐標(biāo)，麥芽糖含量為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。3.4.2樣液的測(cè)定發(fā)酵液的制備，選擇一個(gè)菌株，接三環(huán)菌種于發(fā)酵培養(yǎng)基中，搖床培養(yǎng)，160rpm/min,37℃，48h后，取1ml發(fā)酵液于離心管中，4000rpm/min離心10min，收集上清液取上清液，加1%淀粉溶液1mL、緩沖液3mL，于60℃加檸檬酸緩沖液1mL，于60℃加入1.5mLDNS，沸水浴5min，迅速冷卻，加蒸餾水定容至20mL?？瞻讓?duì)照加發(fā)酵液后加濃鹽酸至pH=3.6以下鈍化淀粉酶，使酶失活，其余步驟同上定容后，搖勻，用分光光度計(jì)在波長(zhǎng)520nm處進(jìn)行比色，記錄吸光值，從麥芽糖標(biāo)準(zhǔn)曲線中查出麥芽糖含量，然后進(jìn)行結(jié)果計(jì)算結(jié)果計(jì)算。4.實(shí)驗(yàn)結(jié)果4.1取樣結(jié)果4.1.1鏡檢從土樣1中分離出3個(gè)菌株，經(jīng)過鏡檢判斷均已純化，分別標(biāo)記為1A,1B,1C從土樣2中分離出4個(gè)菌株，經(jīng)過鏡檢判斷均已純化，分別標(biāo)記為2A,2B,2C,2D4.1.2淀粉培養(yǎng)基篩選及產(chǎn)孢情況1A1B1C2A2B2C2D淀粉酶++-+++-革蘭氏+++++芽孢+++++“+”表示產(chǎn)淀粉酶/芽孢/陽性，反之“-”，無淀粉酶的菌株不做芽孢染色觀察4.1.3形態(tài)學(xué)結(jié)果編號(hào)1A個(gè)體較小，短桿狀，排列散落，單個(gè)或短鏈狀菌落白色略透明，菌落中等，表面光滑，非常濕潤(rùn)，有光澤，邊緣整齊，易挑起產(chǎn)孢情況孢子端生，多游離，不膨大編號(hào)1B個(gè)體較小，短桿或近橢圓，多短鏈狀排列菌落淺黃色不透明，菌落較小，表面粗糙，有明顯褶皺，較干燥，邊緣整齊，易挑起產(chǎn)孢情況孢子端生，膨大明顯編號(hào)2A個(gè)體較細(xì)，長(zhǎng)桿狀，鏈狀排列菌落黃色不透明，菌落較大，表面光滑濕潤(rùn)，邊緣整齊，易挑起產(chǎn)孢情況孢子偏端，不膨大編號(hào)2B個(gè)體桿狀，中等長(zhǎng)度，長(zhǎng)鏈狀排列菌落白色不透明，菌落較大，表面粗糙，略干燥，邊緣不平整呈絨毛狀，難挑起產(chǎn)孢情況中生，不膨大，多游離編號(hào)2C個(gè)體較小，長(zhǎng)桿狀，多短鏈狀排列菌落白色不透明，菌落較大，表面濕潤(rùn)光滑有光澤，邊緣平整，易挑起產(chǎn)孢情況孢子偏端生，輕微膨大4.2生理生化鑒定結(jié)果選取1B、2C進(jìn)行生理生化鑒定項(xiàng)目1B2C1212VP+-++吲哚+-++糖發(fā)酵葡萄糖++++木糖----阿拉伯糖----甘露醇----溫度5℃----25℃++++37℃++++45℃++++++++60℃----耐鹽2％++++++++5％----7％++++++++10％++++硝酸鹽還原--++酪素分解--++酪氨酸分解----卵磷脂酶--++接觸酶++++溶菌酶--++PH5.7----運(yùn)動(dòng)性++++明膠液化----檸檬酸鹽++--根據(jù)《伯杰氏細(xì)菌學(xué)手冊(cè)》1C應(yīng)為凝結(jié)芽孢桿菌,2C為蜂房芽孢桿菌4.3酶活測(cè)定情況選擇編號(hào)2C的菌株作為酶活測(cè)定對(duì)象4.3.1標(biāo)準(zhǔn)曲線的測(cè)定第一組（我們組）麥芽糖g/L0吸光度00.0350.2780.5270.6291.0651.229第三組（其他組）麥芽糖g/L0吸光度00.0550.2860.6630.9671.1771.394由于第三組所測(cè)得的標(biāo)準(zhǔn)曲線擬合情況較好，因此將第三組的標(biāo)準(zhǔn)曲線作為標(biāo)準(zhǔn)來進(jìn)行測(cè)定和計(jì)算4.3.2所選菌株的酶活測(cè)定空白樣品1樣品2吸光度00.1800.1660.1830.179麥芽糖g/L0.340.320.350.34經(jīng)計(jì)算樣品1的酶活=（0.34+0.32）/2×1×8=2.64樣品2的酶活=（0.35+0.34）/2×1×8=2.76編號(hào)2C的菌株在該發(fā)酵配方的培養(yǎng)下酶活U=（2.64+2.76）/2=2.75.結(jié)果分析與討論5.S實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備和總體操作上這個(gè)實(shí)驗(yàn)對(duì)于我們來說是一個(gè)較為長(zhǎng)時(shí)間的實(shí)驗(yàn)，加之實(shí)驗(yàn)設(shè)備器材有限，需要排隊(duì)輪候，因此在實(shí)驗(yàn)過程中，對(duì)整個(gè)實(shí)驗(yàn)流程的整體規(guī)劃和安排，以及各個(gè)實(shí)驗(yàn)環(huán)節(jié)的嚴(yán)謹(jǐn)操作，都有利于減少實(shí)驗(yàn)時(shí)間和等待。例如①這個(gè)實(shí)驗(yàn)需要我們從土壤中提取的芽孢桿菌，因此在操作需要進(jìn)行嚴(yán)格的無菌控制防止雜菌污染，實(shí)驗(yàn)器具在操作前的滅菌，培養(yǎng)基使用前的滅菌，無菌室的消毒和無菌操作等等，這些操作都需要一個(gè)比較長(zhǎng)的時(shí)間等待，我們?cè)诘却臅r(shí)間里可以提前做好下一個(gè)步驟的準(zhǔn)備工作，例如培養(yǎng)基的配制、接種、清洗器具等，有助于我們縮短整個(gè)實(shí)驗(yàn)的用時(shí)②在由土壤制備菌懸液時(shí)，需要加入玻璃珠使細(xì)胞離散有利于形成單菌落，在實(shí)驗(yàn)前需要將玻璃珠放入錐形瓶中一同高壓蒸汽滅菌，有組別事先忘記加入玻璃珠，需要重新加入玻璃珠再次滅菌，增加了多余的環(huán)節(jié)，延長(zhǎng)了實(shí)驗(yàn)時(shí)間；③我們小組在進(jìn)行VP實(shí)驗(yàn)過程中，由于使用了錯(cuò)誤的試劑，無法得到準(zhǔn)確正常的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，需要重新配置培養(yǎng)基和接種，造成了時(shí)間和材料的浪費(fèi)5.2菌株分離純化時(shí)，三次劃線后，只有一個(gè)平板出現(xiàn)明顯單菌落，大多數(shù)呈現(xiàn)為菌苔，鏡檢結(jié)果表明所選菌株均已純化；說明我們所選擇的時(shí)間周期（24h）對(duì)多數(shù)菌株的來說培養(yǎng)過長(zhǎng)，在后續(xù)的實(shí)驗(yàn)中，無論是接種培養(yǎng)還是留種，都應(yīng)當(dāng)適當(dāng)縮短培養(yǎng)時(shí)間，防止培養(yǎng)時(shí)間過長(zhǎng)導(dǎo)致菌種老化或者活性降低5.3在革蘭氏染色中，所有產(chǎn)淀粉酶的菌株結(jié)果都為陽性，但是在該實(shí)驗(yàn)中缺乏陰性對(duì)照，難以判斷是否因?yàn)槿旧⒚撋牟僮骰蛘邥r(shí)間問題導(dǎo)致觀測(cè)出現(xiàn)偏差或者個(gè)人對(duì)顏色深淺判斷一定的主觀影響，因此在進(jìn)行類似實(shí)驗(yàn)操作時(shí)，建議與革蘭氏陰性菌例如大腸桿菌混合，形成對(duì)照，使觀測(cè)更易判斷和描述，結(jié)果更準(zhǔn)確和有說服力5.4芽孢染色操作較為困難，操作不當(dāng)可能導(dǎo)致染色效果不明顯或者洗脫時(shí)菌體容易被沖掉，需要耐心操作；小組操作過程中發(fā)現(xiàn)，可以在滴入3-5滴孔雀綠溶液后，置于火焰上方較高處直接烘烤，冒白煙（不沸騰）至干之后直接洗脫，比較簡(jiǎn)便，且可以達(dá)到較好的觀察效果；但該操作缺乏重復(fù)和對(duì)照，不能判斷是巧合造成的僅對(duì)我們所選取的菌株有效還是有推廣的可行性5.5淀粉酶檢驗(yàn)的時(shí)候，有兩株菌落形態(tài)相似的菌株出現(xiàn)相反的情況，說明這兩株菌株很大可能是不同的，有些菌株菌落看起來相似，但實(shí)際上可能是不同的菌株，也反映了生理生化鑒定和基因檢測(cè)的必要性5.6耐鹽性試驗(yàn)中，兩種菌在2％、7％、10％鹽濃度培養(yǎng)基上培養(yǎng)24h后都能正常生長(zhǎng)，說明這兩種菌對(duì)于高濃度的鹽環(huán)境具有一定的抗逆性；但是在5％鹽濃度的兩個(gè)平行培養(yǎng)基上兩種菌株總共4個(gè)接種點(diǎn)都不生長(zhǎng)，其中編號(hào)1B的菌株在常溫下放置5天后又出現(xiàn)生長(zhǎng)的跡象，除去接種操作過程中存在的問題，推測(cè)可能為配置耐鹽過程中出現(xiàn)錯(cuò)誤，鹽的用量不準(zhǔn)確或者倒平板時(shí)對(duì)各個(gè)平板對(duì)應(yīng)的鹽濃度標(biāo)示錯(cuò)誤，因此該實(shí)驗(yàn)的結(jié)果可能存在不準(zhǔn)確和偏差；在時(shí)間條件允許的情況下，應(yīng)該對(duì)該實(shí)驗(yàn)進(jìn)行重復(fù)5.7溫度實(shí)驗(yàn)中，兩種菌在在5℃和60℃的極端環(huán)境中不生長(zhǎng)，在25℃和45℃中生長(zhǎng)，且在45℃中長(zhǎng)勢(shì)較好，說明這兩種菌的生長(zhǎng)最適溫度都偏高，其中編號(hào)1B的菌落出現(xiàn)擴(kuò)散的現(xiàn)象，可能原因是接種過程中沾到斜面上的冷凝水，使得菌體擴(kuò)散；結(jié)合純化培養(yǎng)時(shí)該菌株也出現(xiàn)類似的情況和培養(yǎng)時(shí)間應(yīng)該縮短的判斷，猜測(cè)此菌株培養(yǎng)時(shí)間過長(zhǎng)，開始出現(xiàn)老化的跡象，在45℃的條件下1B菌株的可能的最適培養(yǎng)時(shí)間應(yīng)該遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于24h.而用于條件所限制，本次實(shí)驗(yàn)只選擇了4個(gè)溫度梯度，中間間隔過大，不能很好地反應(yīng)這兩種菌對(duì)環(huán)境的抗逆性情況5.8糖發(fā)酵實(shí)驗(yàn)中，培養(yǎng)基配制后基本為紫色，但是部分培養(yǎng)基在高壓蒸汽滅菌后變?yōu)榫萍t色，查詢資料后知道該實(shí)驗(yàn)使用的酸堿指示劑溴甲酚紫是作為酸堿指示劑加入在，變色范圍pH5.2（黃）-6.8（紫），通過詢問老師得知使用高壓蒸汽滅菌在升溫和降溫的過程較長(zhǎng)，在這個(gè)過程中，可能某些物質(zhì)發(fā)生變化，使得溶液的酸堿度發(fā)生變化；思考：是否可以用pH試紙直接檢測(cè)培養(yǎng)后的培養(yǎng)基的酸堿度；或者培養(yǎng)后再加入酸堿指示劑；可能結(jié)果較不為直觀，但應(yīng)該可達(dá)到相同的目的，即產(chǎn)酸產(chǎn)氣的檢測(cè)5.9VP實(shí)驗(yàn)中，在加入ɑ-酚萘后上層溶液變?yōu)椴煌该鞯娜榘咨?，保溫后無任何明顯變化，詢問老師后得知，可能為加入藥品錯(cuò)誤，堿性不足，發(fā)生了其他的反應(yīng)；之后發(fā)現(xiàn)其他組別也出現(xiàn)類似的情況，基本確定為加入的堿性物質(zhì)濃度不足，沒有形成強(qiáng)堿環(huán)境，具體變化不明；重復(fù)試驗(yàn)，其中編號(hào)1B出現(xiàn)一個(gè)陽性一個(gè)陰性結(jié)果，由于接種時(shí)種子培養(yǎng)基內(nèi)存在較多冷凝水，可能沒取到菌種或者數(shù)量較少，不排除受污染的情況；由于時(shí)間關(guān)系未再進(jìn)行重復(fù)，該實(shí)驗(yàn)也提醒我們?cè)趯?shí)驗(yàn)過程中應(yīng)該保持小心、仔細(xì)，藥品的選用和用量都可能對(duì)結(jié)果造成干擾，并且也再次提醒我們重復(fù)實(shí)驗(yàn)和平行對(duì)照的重要性5.10在酪素水解、酪氨酸水解和卵磷脂酶實(shí)驗(yàn)中，由于酪素、酪氨酸和卵黃中含有蛋白質(zhì)等物質(zhì)在高溫條件下變性，因此不能直接高溫（121℃）蒸汽滅菌，應(yīng)當(dāng)根據(jù)材料的不用采取不同的方法，例如酪素和酪氨酸在110℃滅菌，蛋黃在無菌條件下取用即可5.11pH5.7的耐酸性實(shí)驗(yàn)表明，兩種菌對(duì)偏酸性的抗逆性較低；溶菌酶試驗(yàn)表明編號(hào)2C的菌株對(duì)溶菌酶具有一定的抗逆性；這兩個(gè)實(shí)驗(yàn)應(yīng)該使用肉湯培養(yǎng)基同pH7.0的肉湯作對(duì)比，通過渾濁度可以直觀地對(duì)比出菌株生長(zhǎng)或者不生長(zhǎng)，但是對(duì)于菌株的生長(zhǎng)情況比較難以把握，在溶菌酶試驗(yàn)中可以使用固體培養(yǎng)基，用小濾紙片浸沒在溶菌酶中，通過透明圈的大小來判斷抑制情況5.12檸檬酸鹽實(shí)驗(yàn)中，編號(hào)1B的菌種能對(duì)檸檬酸鹽進(jìn)行利用，但該實(shí)驗(yàn)一直到第五天才出現(xiàn)輕微現(xiàn)象，第六天才出現(xiàn)明顯現(xiàn)象，說明芽孢桿菌對(duì)檸檬酸鹽的利用能力較低，需要長(zhǎng)時(shí)間培養(yǎng)觀察才能做出判定5.13我們通過生理生化實(shí)驗(yàn)鑒定得出來的結(jié)果并非十分準(zhǔn)確，僅是初步鑒定，缺乏比較嚴(yán)格的重復(fù)和對(duì)照，部分項(xiàng)目可能存在誤差，部分項(xiàng)目由于條件限制沒有實(shí)施，實(shí)際操作中對(duì)微生物的種的鑒定還應(yīng)該進(jìn)行基因檢測(cè)和鑒定才能最終判斷5.14我們選取淀粉檢驗(yàn)時(shí)透明圈較大的2C作為酶活檢測(cè)對(duì)象，實(shí)際結(jié)果酶活力較并不高；通過課堂知識(shí)和老師講解，我們知道種子培養(yǎng)基和發(fā)酵培養(yǎng)基的配方不同是由于微生物的最適生長(zhǎng)條件和最適產(chǎn)物條件的不同，對(duì)于我們選用的菌株，要得出最適的發(fā)酵配方是需要建立大量的實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上的，我們通過查詢資料得帶的配方只能作為參考使用，實(shí)際上可能并非該菌株的最優(yōu)配方；因此測(cè)得的酶活力相應(yīng)的只能作為一個(gè)參考量，并非該菌株的酶活的最優(yōu)結(jié)果6．綜合討論通過本次實(shí)驗(yàn)，我們對(duì)于一個(gè)實(shí)驗(yàn)，從開始查閱資料、設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)到實(shí)驗(yàn)操作、記錄和總結(jié)有一個(gè)比較清晰的了解，同時(shí)也確實(shí)體會(huì)到了做實(shí)驗(yàn)的辛苦。對(duì)于實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)上，我們還存在一些不足，例如對(duì)于查閱資料的整理和使用，以及項(xiàng)目的選擇，都存在一些不清晰和不合理，有的時(shí)候知其然而不知其所以然，所以導(dǎo)致我們小組在實(shí)驗(yàn)過程中會(huì)出現(xiàn)分歧和爭(zhēng)端，例如對(duì)于pH5.7培養(yǎng)基的對(duì)照培養(yǎng)基應(yīng)為Ph7.0培養(yǎng)基而非不接種的pH5.7的培養(yǎng)基，出現(xiàn)這樣的分歧說明我們對(duì)實(shí)驗(yàn)的認(rèn)識(shí)和了解還不足夠深入和透徹；對(duì)于實(shí)驗(yàn)的步驟安排不太恰當(dāng)和操作失誤導(dǎo)致重新進(jìn)行某個(gè)項(xiàng)目的實(shí)驗(yàn)都無形中增加了時(shí)間和負(fù)擔(dān)，對(duì)于實(shí)驗(yàn)的統(tǒng)籌安排應(yīng)該在實(shí)驗(yàn)開始前就做好的工作，而操作的不熟練和小心嚴(yán)謹(jǐn)、實(shí)驗(yàn)記錄的準(zhǔn)確和嚴(yán)密則有賴于我們自身素質(zhì)提升。這個(gè)實(shí)驗(yàn)是小組通力合作，小組成員的分工配合、團(tuán)結(jié)協(xié)作是我們完成這個(gè)實(shí)驗(yàn)的關(guān)鍵之一；良好的配合使得我們?cè)谂渲婆囵B(yǎng)基和實(shí)驗(yàn)操作上快人一步，而對(duì)于某個(gè)項(xiàng)目的不清楚的地方的討論也有助于加深小組成員對(duì)實(shí)驗(yàn)的理解，小組有分歧，有爭(zhēng)論，最終通過討論或者查閱資料詢問老師而得出結(jié)果，既有利于實(shí)驗(yàn)的進(jìn)行，也加強(qiáng)了成員間的溝通和交流。同其他組進(jìn)行交流和結(jié)果參照也是學(xué)習(xí)的方式之一。對(duì)芽孢桿菌的形態(tài)學(xué)和生理生化鑒定基本情況良好。形態(tài)學(xué)由于此前有做過類似的操作，因此本次實(shí)驗(yàn)進(jìn)行的情況比較有效率，較大的問題主要存在于小組成員對(duì)觀察現(xiàn)象的描述和芽孢染色的操作和觀察問題上；在形態(tài)學(xué)鑒定的時(shí)候，出現(xiàn)兩株菌株的菌落看起來一樣但是產(chǎn)淀粉酶情況相反的情況，菌株的個(gè)體形態(tài)和群體形態(tài)只是鑒定的一個(gè)方面，要對(duì)菌株進(jìn)行準(zhǔn)確的鑒定應(yīng)該進(jìn)行更詳細(xì)的生理生化鑒定和基因檢測(cè)。而生理生化鑒定由于條件限制我們只能進(jìn)行部分項(xiàng)目，總體情況良好，對(duì)于某些項(xiàng)目，例如卵黃實(shí)驗(yàn)、溶菌酶試驗(yàn)、酪素、酪氨酸、pH5.7等的操作上，還存在一些不同，在老師講解過來，還需要經(jīng)過討論、理解后才開始實(shí)施，實(shí)驗(yàn)操作也存在一些差錯(cuò)導(dǎo)致項(xiàng)目重來的情況，造成時(shí)間和材料的浪費(fèi)，說明實(shí)驗(yàn)預(yù)習(xí)和設(shè)計(jì)的時(shí)候在這方面做還存在不足，對(duì)項(xiàng)目的了解和認(rèn)識(shí)還不夠深入。因此，對(duì)于實(shí)驗(yàn)的學(xué)習(xí)和熟悉仍然是我們的一個(gè)需要重點(diǎn)把握的方面，而是作為一個(gè)學(xué)習(xí)生物學(xué)的學(xué)生應(yīng)當(dāng)掌握的技能。通過鑒定可以得知，兩種菌株的耐鹽情況較好，但是對(duì)極度溫度的抗逆性不是很明顯，而由于試驗(yàn)條件、沒有選擇合適的溫度梯度也是一個(gè)重要因素；而由于芽孢桿菌在不良環(huán)境下具有一定的抗逆性的這種良好的性狀使得其在生產(chǎn)應(yīng)用中有廣泛的應(yīng)用。而我們本次實(shí)驗(yàn)中著重檢測(cè)其產(chǎn)淀粉酶的情況，檢測(cè)結(jié)果酶活偏低，但不能因此說明此菌的淀粉酶缺乏應(yīng)用價(jià)值，對(duì)于某種菌的最適生長(zhǎng)培養(yǎng)條件和最適培養(yǎng)條件都是需要我們通過大量的實(shí)驗(yàn)來得到，我們?cè)谶@個(gè)實(shí)驗(yàn)中采用的發(fā)酵培養(yǎng)基配方只是作為一個(gè)參考，而需要判斷該菌所產(chǎn)淀粉酶是否可以具有生產(chǎn)應(yīng)用價(jià)值，還需要進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)來說明。7.參考文獻(xiàn)[1]周德慶，徐德強(qiáng)．微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)教程（第3版）．高等教育出版社．2021[2]孫建義，許梓榮．芽孢桿菌的分離鑒定及應(yīng)用研究．浙江農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)11（1）47~50，2021[3]R.E.布坎南，N.E吉本斯，等．伯杰式細(xì)菌學(xué)鑒定手冊(cè)（第八版）．科學(xué)出版社．1984：729~759．[4]鄒偉，趙玉軍等．土壤中芽孢桿菌的分離及初步鑒定．[J]四川畜牧獸醫(yī).2021，02期[5]傅冰，王東明．土壤中產(chǎn)淀粉酶菌株的分離、鑒定及提高產(chǎn)酶能力的研究．[J]綠色科技，2021，03．3[6]楊慧，王振華等.芽孢桿菌產(chǎn)淀粉酶活性的研究.現(xiàn)代農(nóng)業(yè)科技2021,28.附錄

論大學(xué)生寫作能力寫作能力是對(duì)自己所積累的信息進(jìn)行選擇、提取、加工、改造并將之形成為書面文字的能力。積累是寫作的基礎(chǔ)，積累越厚實(shí)，寫作就越有基礎(chǔ)，文章就能根深葉茂開奇葩。沒有積累，胸?zé)o點(diǎn)墨，怎么也不會(huì)寫出作文來的。寫作能力是每個(gè)大學(xué)生必須具備的能力。從目前高校整體情況上看，大學(xué)生的寫作能力較為欠缺。一、大學(xué)生應(yīng)用文寫作能力的定義那么，大學(xué)生的寫作能力究竟是指什么呢？葉圣陶先生曾經(jīng)說過，“大學(xué)畢業(yè)生不一定能寫小說詩(shī)歌，但是一定要寫工作和生活中實(shí)用的文章，而且非寫得既通順又扎實(shí)不可?！睂?duì)于大學(xué)生的寫作能力應(yīng)包含什么，可能有多種理解，但從葉圣陶先生的談話中，我認(rèn)為：大學(xué)生寫作能力應(yīng)包括應(yīng)用寫作能力和文學(xué)寫作能力，而前者是必須的，后者是“不一定”要具備，能具備則更好。眾所周知，對(duì)于大學(xué)生來說，是要寫畢業(yè)論文的，我認(rèn)為寫作論文的能力可以包含在應(yīng)用寫作能力之中。大學(xué)生寫作能力的體現(xiàn)，也往往是在撰寫畢業(yè)論文中集中體現(xiàn)出來的。本科畢業(yè)論文無論是對(duì)于學(xué)生個(gè)人還是對(duì)于院系和學(xué)校來說，都是十分重要的。如何提高本科畢業(yè)論文的質(zhì)量和水平，就成為教育行政部門和高校都很重視的一個(gè)重要課題。如何提高大學(xué)生的寫作能力的問題必須得到社會(huì)的廣泛關(guān)注，并且提出對(duì)策去實(shí)施解決。二、造成大學(xué)生應(yīng)用文寫作困境的原因：（一）大學(xué)寫作課開設(shè)結(jié)構(gòu)不合理。就目前中國(guó)多數(shù)高校的學(xué)科設(shè)置來看，除了中文專業(yè)會(huì)系統(tǒng)開設(shè)寫作的系列課程外，其他專業(yè)的學(xué)生都只開設(shè)了普及性的《大學(xué)語文》課。學(xué)生寫作能力的提高是一項(xiàng)艱巨復(fù)雜的任務(wù)，而我們的課程設(shè)置僅把這一任務(wù)交給了大學(xué)語文教師，可大學(xué)語文教師既要在有限課時(shí)時(shí)間內(nèi)普及相關(guān)經(jīng)典名著知識(shí)，又要適度提高學(xué)生的鑒賞能力，且要教會(huì)學(xué)生寫作規(guī)律并提高寫作能力，任務(wù)之重實(shí)難完成。（二）對(duì)實(shí)用寫作的普遍性不重視?！按髮W(xué)語文”教育已經(jīng)被嚴(yán)重地“邊緣化”。目前對(duì)中國(guó)語文的態(tài)度淡漠，而是呈現(xiàn)出全民學(xué)英語的大好勢(shì)頭。中小學(xué)如此，大學(xué)更是如此。對(duì)我們的母語中國(guó)語文，在大學(xué)反而被漠視，沒