磁性納米材料的細(xì)胞氧化應(yīng)激檢測

磁性納米材料的細(xì)胞氧化應(yīng)激檢測第一頁，共十四頁，2022年，8月28日2一、制備磁性Fe3O4納米顆粒的意義：

納米材料是指具有納米量級的超微粒構(gòu)成的固體物質(zhì)。納米材料在化學(xué)、冶金、電子、航天、生物和醫(yī)學(xué)等領(lǐng)域展現(xiàn)出廣闊的應(yīng)用前景。運(yùn)用于生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的納米材料被稱之為納米生物材料。其中磁性納米生物材料具有小尺寸效應(yīng)、良好的磁導(dǎo)向性、生物相容性、生物降解性和活性功能基團(tuán)等特點(diǎn)，可結(jié)合各種功能分子，如酶、抗體、細(xì)胞、DNA或RNA等，并利用其磁性進(jìn)行定位、分離和分類，在靶向藥物、酶的固定化、免疫測定、細(xì)胞的分離與分類等方面有著廣泛的研究。第二頁，共十四頁，2022年，8月28日3小尺寸效應(yīng)：小尺寸效應(yīng)(Smallsizeeffect)，當(dāng)顆粒的尺寸與光波波長、德布羅意波長以及超導(dǎo)態(tài)的相干長度或透射深度等物理特征尺寸相當(dāng)或更小時，晶體周期性的邊界條件將被破壞，非晶態(tài)納米粒子的顆粒表面層附近的原子密度減少，導(dǎo)致聲、光、電、磁、熱、力學(xué)等特性呈現(xiàn)新的物理性質(zhì)的變化稱為小尺寸效應(yīng)。對超微顆粒而言，尺寸變小，同時其比表面積亦顯著增加，從而產(chǎn)生如下一系列新奇的性質(zhì)。小尺寸效應(yīng)特殊的光學(xué)性質(zhì)特殊的熱學(xué)性質(zhì)特殊的磁學(xué)性質(zhì)特殊的力學(xué)性質(zhì)第三頁，共十四頁，2022年，8月28日4磁導(dǎo)向性：

人們發(fā)現(xiàn)鴿子、海豚、蝴蝶、蜜蜂以及生活在水中的趨磁細(xì)菌等生物體中存在超微的磁性顆粒，使這類生物在地磁場導(dǎo)航下能辨別方向，具有回歸的本領(lǐng)。磁性超微顆粒實(shí)質(zhì)上是一個生物磁羅盤，生活在水中的趨磁細(xì)菌依靠它游向營養(yǎng)豐富的水底。通過電子顯微鏡的研究表明，在趨磁細(xì)菌體內(nèi)通常含有直徑約為2′10-2微米的磁性氧化物顆粒。小尺寸的超微顆粒磁性與大塊材料顯著的不同，大塊的純鐵矯頑力約為80安／米，而當(dāng)顆粒尺寸減小到2′10-2微米以下時，其矯頑力可增加1千倍，若進(jìn)一步減小其尺寸，大約小于6′10-3微米時，其矯頑力反而降低到零，呈現(xiàn)出超順磁性。利用磁性超微顆粒具有高矯頑力的特性，已作成高貯存密度的磁記錄磁粉，大量應(yīng)用于磁帶、磁盤、磁卡以及磁性鑰匙等。利用超順磁性，人們已將磁性超微顆粒制成用途廣泛的磁性液體。第四頁，共十四頁，2022年，8月28日5二、實(shí)驗?zāi)康模?/p>

使學(xué)生掌握用動物細(xì)胞評價生物納米材料生物相容性的方法技術(shù)。具體檢測小鼠單核巨噬細(xì)胞對磁納米材料的細(xì)胞氧化應(yīng)激。要求學(xué)生掌握MTT測定細(xì)胞生長的方法、普魯士藍(lán)染色法和超薄切片透射電鏡觀察法分析磁性納米顆粒進(jìn)入細(xì)胞的技術(shù)，以及檢測細(xì)胞氧化應(yīng)激的一些主要指標(biāo)及技術(shù)。包括（1）分光光度法測定細(xì)胞培養(yǎng)液中超氧化物歧化酶，丙二醛，黃嘌呤氧化酶的含量（2）細(xì)胞流式儀測定自由基產(chǎn)生（3）熒光酶標(biāo)儀測定線粒體損傷。第五頁，共十四頁，2022年，8月28日6三、實(shí)驗原理：

1、普魯士藍(lán)染色：原理：鐵離子遇到亞鐵氰根會產(chǎn)生藍(lán)色的亞鐵氰化鐵沉淀。2、MTT比色法檢測細(xì)胞生長：四挫鹽比色實(shí)驗是一種檢測細(xì)胞存活和生長的方法。實(shí)驗所用的顯示劑四挫鹽是一種能接受氫原子的燃料，化學(xué)名3-（4,5-二甲基噻挫-2）-2,5-二苯基四氮挫溴鹽，商品名是噻挫藍(lán)，簡稱為MTT?；罴?xì)胞線粒體的琥珀酸脫氫酶能使外源性的MTT還原為難溶解的紫藍(lán)色結(jié)晶物并沉積在活細(xì)胞中，而死細(xì)胞沒有此功能。二甲基亞砜能溶解細(xì)胞中紫色結(jié)晶物，用酶聯(lián)免疫檢測儀在570nm波長測定其吸光值，可間接反映活細(xì)胞數(shù)量。第六頁，共十四頁，2022年，8月28日7

3、超氧化物歧化酶測定SOD對機(jī)體的氧化和抗氧化平衡起著至關(guān)重要的作用。此酶能清楚超氧陰離子自由基，保護(hù)細(xì)胞免受損傷，該試劑采用黃嘌呤氧化酶法測定SOD活力?？蓽y實(shí)驗用動物的血清（漿）、腦脊液、胸水、腹水、腎透析液、尿液、精液、紅細(xì)胞、白細(xì)胞、血小板、心肌培養(yǎng)細(xì)胞，腫瘤培養(yǎng)細(xì)胞，各種動植物細(xì)胞，及亞細(xì)胞水平中的SOD活力。通過黃嘌呤及黃嘌呤氧化酶反應(yīng)系統(tǒng)產(chǎn)生超氧陰離子自由基，后者氧化氫胺形成亞硝酸鹽，在顯色劑的作用下呈現(xiàn)紫紅色，用可見光光度計測其吸收度。當(dāng)被測樣品中含SOD時，則對超氧陰離子自由基有專一性的抑制作用，使形成的亞硝酸亞減少，比色時測定管的吸光度低于對照管的吸光度值，通過公式計算可求出被測樣品中的SOD活力。第七頁，共十四頁，2022年，8月28日8四、實(shí)驗材料：1.12nm的Fe3O4處理細(xì)胞2.小鼠單核巨噬細(xì)胞3.普魯士藍(lán)染液A4.0.1%核固紅染液配方5.普魯士藍(lán)染液B6.4%多聚甲醛配方配方8.固定液配方9.3-（4,5-二甲基噻挫-2）-2,5-二苯基四氮噻溴鹽，商品名噻挫藍(lán)，簡稱MTT10.二甲基亞砜11.超氧化物歧化酶測定試劑盒12.微量丙二醛測定試劑盒13.黃嘌呤氧化酶測定試劑盒14.細(xì)胞內(nèi)活性氧水平檢測15.線粒體膜電位檢測試劑盒第八頁，共十四頁，2022年，8月28日9五、實(shí)驗步驟：1.

普魯士藍(lán)染色（1）RAW264.7貼壁培養(yǎng)一天，處于對數(shù)生長期；（2）加入不同濃度的納米粒子，一定時間后，光鏡下觀察下觀察納米粒子的攝入情況。（3）PBS洗滌納米粒子干預(yù)后的細(xì)胞（4）4%多聚甲醛固定10min（5）棄去多聚甲醛，PBS再次洗滌（6）普魯士藍(lán)染色（A液和B液等體積混合，靜置5min后即可使用）染色20min（7）棄去普魯士藍(lán)染液，PBS再次洗滌（8）核固紅復(fù)染10min（9）棄去核固紅染液，PBS再次洗滌（10）顯微鏡下觀察，拍照。第九頁，共十四頁，2022年，8月28日102.

電鏡檢查方法：（1）胰酶收集納米粒子干預(yù)好的細(xì)胞（2）PBS清洗一遍（3）PBS和固定液等體積混合的液體清洗一遍，棄上清；（4）加入固定液，沉淀在固定液底部，過夜（5）1%鋨酸再固定1h（6）丙酮梯度脫水（7）Epon-812樹脂包埋（8）半薄切片定位（9）70nm超薄切片（10）醋酸鈾-檸檬酸鉛雙重電子染色（11）JEM-1200透射電鏡觀察第十頁，共十四頁，2022年，8月28日11六、實(shí)驗結(jié)果：0-00-500-100