水稻160基因的酵母雙雜交質(zhì)粒的構(gòu)建

水稻160基因的酵母雙雜交質(zhì)粒的構(gòu)建摘要目的利用酵母雙雜交系統(tǒng)，構(gòu)建水稻160基因酵母雙雜交質(zhì)粒，并對其進行陽性克隆挑選和雙酶切凝膠電泳以及測序鑒定。為后期實驗利用酵母雙雜交技術(shù)挑選相互作用蛋白奠定了出實驗依據(jù)。方法根據(jù)GenBank中登錄的LOC_Os06g49160基因編碼區(qū)序列設(shè)計引物，以p30-GFP質(zhì)粒為模板，用聚合酶鏈式反應(yīng)擴增目的片段，純化后用XbaI、BamHI雙切水稻160基因和質(zhì)粒載體p30-GFP，回收純化后的產(chǎn)物并在特定條件下連接成重組質(zhì)粒，重組質(zhì)粒命名為p30-GFP-160，連接完成之后再使用雙酶切后通過電泳圖譜證實連接是否成功并采用基因測序的方法驗證序列變化。結(jié)果通過電泳圖譜可知擴增的目的片段大小約為750bp，與預(yù)期大小相符合，目的片段與p30-GFP載體定向重組形成的誘餌質(zhì)粒p30-GFP-160經(jīng)BamHⅠ和XabⅠ雙酶切后的瓊脂糖凝膠電泳圖譜與預(yù)期基本一致，基因測序結(jié)果也表明已成功構(gòu)建出質(zhì)粒。結(jié)論成功構(gòu)建了水稻160基因酵母雙雜交質(zhì)粒，可用于后續(xù)水稻中相關(guān)蛋白篩選實驗，并為進一步使用酵母雙雜交技術(shù)去探究蛋白質(zhì)之間相互作用確立了理論與實驗基礎(chǔ)。關(guān)鍵詞：LOC_Os06g49160；質(zhì)粒構(gòu)建；酵母雙雜交系統(tǒng)；p30-GFP載體

ABSTRACTObjective：Toconstructayeasttwo-hybridplasmidofrice160geneusingtheyeasttwo-hybridsystem,andperformpositivecloneselection,doubleenzymedigestiongelelectrophoresisandsequencingforidentification.Itlaidanexperimentalbasisforthelaterexperimentstouseyeasttwo-hybridtechnologytoselectinteractingproteins.Methods：PrimersweredesignedaccordingtothecodingregionsequenceofLOC_Os06g49160generegisteredinGenBank.Thep30-GFPplasmidwasusedasatemplatetoamplifythetargetfragmentbypolymerasechainreaction.Afterpurification,therice160geneandplasmidvectorp30weredouble-cutwithXbaIandBamHI-GFP,thepurifiedproductisrecoveredandligatedintoarecombinantplasmidunderspecificconditions.Therecombinantplasmidisnamedp30-GFP-160.Aftertheligationiscompleted,doubleenzymedigestionisusedandtheelectrophoresispatternisusedtoconfirmwhethertheligationissuccessfulandthemethodofgenesequencingisusedVerifysequencechanges.Results：Accordingtotheelectrophoresispattern,thesizeoftheamplifiedtargetfragmentwasabout750bp,whichwasconsistentwiththeexpectedsize.Thebaitplasmidp30-GFP-160formedbythetargetedrecombinationofthetargetfragmentwiththep30-GFPvectorwasdigestedbyBamHⅠandXabⅠ.Theagarosegelelectrophoresispatternisbasicallyconsistentwithexpectations,andthegenesequencingresultsalsoshowthattheplasmidhasbeensuccessfullyconstructed.Conclusion：Therice160geneyeasttwo-hybridplasmidhasbeensuccessfullyconstructed,whichcanbeusedforsubsequentscreeningexperimentsofrelatedproteinsinrice,andestablishesatheoreticalandexperimentalbasisforthefurtheruseofyeasttwo-hybridtechnologytoexploretheinteractionbetweenproteins.KEYWORDS:LOC_Os06g49160;plasmidconstruction;yeasttwo-hybridsystem;p30-GFPvector

目錄摘要 0ABSTRACT 21緒論 51.1酵母雙雜交技術(shù)的概述 51.1.1酵母雙雜交技術(shù)的發(fā)現(xiàn)和原理 51.1.2酵母雙雜交技術(shù)的特點 61.1.3酵母雙雜交技術(shù)的應(yīng)用 81.3本實驗的目的和意義 102材料與方法 112.1材料 112.1.1質(zhì)粒和菌種 112.1.2主要試劑 112.1.3主要儀器 112.1.4主要試劑的配制 112.2方法 132.2.1轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細胞 132.2.2質(zhì)粒擴大培養(yǎng) 132.2.3質(zhì)粒提取 132.2.4PCR擴增 142.2.5PCR產(chǎn)物的鑒定和回收 152.2.6PCR產(chǎn)物以及載體雙酶切 162.2.7目的片段與載體的連接 162.2.8連接產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化 172.2.9陽性克隆的篩選和鑒定 172.2.10重組質(zhì)粒的雙酶切鑒定 182.2.11重組質(zhì)粒的測序鑒定 193結(jié)果與分析 203.1目的基因的PCR擴增 203.2誘餌質(zhì)粒的酶切與測序鑒定 214結(jié)論與討論 224.1結(jié)論 224.2討論 22參考文獻 24致謝 27符號說明 29附錄 30

1緒論1.1酵母雙雜交技術(shù)的概述早在上世紀末，生物學(xué)研究已經(jīng)進入邁過了分子生物學(xué)，轉(zhuǎn)而進入了更微觀的后基因組時代。正因如此，關(guān)于蛋白質(zhì)的研究也就順理成章地成為了生物學(xué)研究的重中之重[1-3]。蛋白質(zhì)無論是在動物植物還是細菌甚至是病毒的日常生長代謝過程中都扮演著重要的角色，并且每一種蛋白質(zhì)并不是單獨發(fā)揮作用，而是多種或者一類蛋白質(zhì)共同調(diào)節(jié)機體的正常生命活動，如生長發(fā)育和新陳代謝等?，F(xiàn)已有研究表明，病毒在增殖和復(fù)制的過程中不斷調(diào)節(jié)和適應(yīng)宿主的環(huán)境，DNA病毒和RNA病毒都編碼大量的多功能的病毒蛋白與宿主細胞蛋白結(jié)合并修飾。越來越多的病毒學(xué)研究使得我們對病毒蛋白的研究結(jié)果、功能以及病毒與宿主的相互認識。但是，在現(xiàn)目前的生物學(xué)研究水平中，還有很多病毒與宿主的分子作用機制還不清楚。隨著許多關(guān)于研究蛋白質(zhì)組學(xué)的理論和技術(shù)不斷成熟，研究蛋白質(zhì)間相互作用的技術(shù)除了酵母雙雜交技術(shù)之外，還有等離子共振技術(shù)和噬菌體展示技術(shù)等[4]。酵母雙雜交技術(shù)由于其具有的多功能性、時效性和適應(yīng)性等特點，該方法成為了研究蛋白質(zhì)間相互作用的主要方法之一。該技術(shù)可以用做探索未知蛋白與已知蛋白之間的相互關(guān)系和識別基因的表達，所以酵母雙雜交技術(shù)在醫(yī)學(xué)上檢驗藥物和細胞周期調(diào)控及其信號傳導(dǎo)等方面都有重要作用。1.1.1酵母雙雜交技術(shù)的發(fā)現(xiàn)和原理酵母雙雜交技術(shù)通常是用來研究兩組已知蛋白或者已知蛋白與未知蛋白之間相互作用的方法，該方法相對而言比較簡單靈敏，而且可以通過建立文庫的方法從而在整個基因組水平上驗證蛋白質(zhì)的相互作用[5,6]。該技術(shù)誕生于上世紀末，由美國紐約州里大學(xué)Fields教授和Song教授最先提出，他指出酵母雙雜交技術(shù)的主要理論依據(jù)是真核細胞生物酵母轉(zhuǎn)錄因子GAL4（galactose-regulatedupstreampromoterelement,GAL）。1989年Fields等[7]建立了酵母雙雜交體系，并根據(jù)起實驗理論原理，將改技術(shù)著手于研究真核細胞內(nèi)的DNAZ轉(zhuǎn)錄，該研究發(fā)現(xiàn)真核細胞存在著一種特殊的ATF，是由兩個相對獨立的結(jié)構(gòu)域構(gòu)成，并且其本身可與上游的轉(zhuǎn)錄起始位點結(jié)合。這兩個結(jié)構(gòu)域雖然在基因片段上所處的位置相互獨立、在轉(zhuǎn)錄過程中體現(xiàn)的功能不同、彼此之間的表達也互不干擾，但是只要兩者處于同一環(huán)境下就會激活并表達特定的基因，這種現(xiàn)象稱為DNA特異性結(jié)合，而這兩個結(jié)構(gòu)域被稱為激活結(jié)構(gòu)域（AD）和結(jié)合結(jié)構(gòu)域（BD）[8]。除了這兩個結(jié)構(gòu)域之外，還有一個被稱為reportergene（報告基因）的概念，它包含一個可以與BD特異性結(jié)合的位點。由于酵母雙雜交系統(tǒng)是研究蛋白質(zhì)間作用的技術(shù)，所以在該系統(tǒng)中會出現(xiàn)兩種蛋白質(zhì)，一種是已知蛋白X會被克隆至DNA-BD載體中，表達出DNA-BD/X融合蛋白，也常常被稱作“bait”(誘餌)；另一種蛋白質(zhì)則是未知蛋白Y克隆至AD載體中，對應(yīng)的也被稱作是“prey”（獵物）。如果兩個載體之間沒有相互作用，BD和AD就不會與激活序列結(jié)合，相應(yīng)的報告基因也就不會被激活和表達；相反，一旦蛋白質(zhì)X和蛋白質(zhì)Y之間存在相互作用，那么DNA-BD和AD就會被牽引導(dǎo)致它們之間的距離變小，恢復(fù)功能，激活下游報告基因中LacZ和HIS3的基因的表達[9]。由此，可以通過檢測報告基因是否激活和表達來探究蛋白質(zhì)間的相互作用，微觀化為宏觀，降低研究難度[10]。該技術(shù)從創(chuàng)立至今經(jīng)過了數(shù)十年的不斷改進和發(fā)展，通過改造AD和BD的載體、增加報告基因的數(shù)量等方法，在實驗的準確性方面對比1989年系統(tǒng)建立之已有了很大提高，一方面提高了篩選的真陽性率、另一方面也降低了假陽性率。近年來許多實驗結(jié)果表明，酵母雙雜交技術(shù)的適用范圍已不再僅僅是真核生物，原核生物甚至是病毒也同樣適用，儼然成為了研究蛋白質(zhì)組學(xué)的重要技術(shù)手段，同時也為探究蛋白互作及功能提供了技術(shù)支持和更大的可能性。1.1.2酵母雙雜交技術(shù)的特點酵母雙雜交技術(shù)作為在分析蛋白互作時的最常用手段之一，雖然具有效率高、適用范圍大、操作簡單、受環(huán)境影響較小、精確度高等諸多優(yōu)點，但同時該技術(shù)也存在一定的局限性。由于酵母雙雜交技術(shù)分析蛋白質(zhì)間的相互作用是在細胞核內(nèi)進行，但是甲基化、磷酸化、二硫鍵的合成和等對蛋白的加工卻主要是在細胞質(zhì)中的細胞器里完成，并且這些加工修飾都是蛋白質(zhì)相互作用的關(guān)鍵所在，所以此類技術(shù)不能用于研究膜上的受體蛋白和胞外蛋白。酵母雙雜交系統(tǒng)的優(yōu)點（1）檢測融合體蛋白之間的相互作用是在真核酵母細胞內(nèi)進行，免除了分離純化蛋白質(zhì)的操作，并且蛋白質(zhì)保持天然的折疊狀態(tài)，保證了蛋白質(zhì)的活性，使得蛋白質(zhì)間的互相作用更接近體內(nèi)真實水平，所以能更加真實地反映蛋白質(zhì)互作情況。（2）可通過檢測基因表達產(chǎn)物的水平來反映蛋白質(zhì)檢測的結(jié)果，具有非常高的靈敏度，可用于檢測水平可達結(jié)合常數(shù)1mmol/L。（3）在篩選cDNA文庫時，酵母雙雜交系統(tǒng)可得到編碼互作蛋白的基因序列，相比于其他的體外檢測蛋白質(zhì)互作方法，避免了蛋白質(zhì)抽提、分離純化等步驟，極大得提高了效率簡化了實驗操作。酵母菌雙雜交系統(tǒng)的局限性與改進（1）假陽性。假陽性是酵母雙雜交過程中的最主要問題。由于某些蛋白質(zhì)在沒有bait和prey結(jié)合的情況下，本身就能激活報告基因的表達，酵母菌就會表達那些只與BD結(jié)構(gòu)域結(jié)合而缺少AD結(jié)構(gòu)域的基因，成為誘餌蛋白的自激活，從而表現(xiàn)出假陽性；另外某些蛋白質(zhì)表面含有對多種蛋白質(zhì)的低親和力區(qū)域，能與其他蛋白作用形成結(jié)構(gòu)穩(wěn)定的復(fù)合物，引起報告基因的表達也會造成假陽性。針對上述問題，研究者們提出增加報告基因數(shù)量，且每個報告基因的上游調(diào)控區(qū)各不相同[11]和作嚴格的對照實驗，對誘餌和靶蛋白分別單作單獨激活報告基因的鑒定[12]等方法，另外將報告基因整合到染色體上，可以穩(wěn)定基因表達水平，還能消除因為質(zhì)?？截悢?shù)不同造成的假陽性，這方法都能顯著降低假陽性產(chǎn)生的可能。（2）假陰性。所謂假陰性就是兩個蛋白間本該發(fā)生互作反應(yīng)，但是報告基因不表達或表達程度低于檢測水平。主要有兩個方面的原因：其一是融合蛋白的表達對細胞有毒性。這時應(yīng)該選擇敏感性低的菌株或拷貝數(shù)低的載體。二是蛋白間的相互作用較弱，應(yīng)選擇高敏感的菌株及多拷貝載體。目前假陰性現(xiàn)象雖不是實驗中的主要問題，但也應(yīng)予以重視。[13]（3）核內(nèi)反應(yīng)。由于酵母雙雜交必須在細胞核內(nèi)進行，這就限制了該方法的適用對象，無法研究核外蛋白。為此，產(chǎn)生了SOS恢復(fù)系統(tǒng)[14],將互作蛋白的研究場所轉(zhuǎn)移到胞漿中。（4）除此之外，轉(zhuǎn)化率低下也是一個缺點。在建立基因文庫和在文庫中篩選時，蛋白質(zhì)的轉(zhuǎn)化率也至關(guān)重要。為此，在進行轉(zhuǎn)化時選擇共轉(zhuǎn)化或者依次轉(zhuǎn)化等方法可在一定程度上加快蛋白質(zhì)的轉(zhuǎn)化速度。[15]1.1.3酵母雙雜交技術(shù)的應(yīng)用酵母雙雜交技術(shù)很大程度上在技術(shù)層面推動了蛋白質(zhì)互作用研究的進步，加上后續(xù)的許多的實驗結(jié)果表明該技術(shù)已經(jīng)在很多不同的領(lǐng)域取得了重大突破。基于該技術(shù)的研究已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了大量未知蛋白種類和已知蛋白質(zhì)的新功能，進而為建立健全已知的基因連鎖圖譜提供了技術(shù)支持，同時也為利用圖譜發(fā)現(xiàn)新藥物推動醫(yī)藥行業(yè)的發(fā)展保駕護航。由此可見，酵母雙雜交技術(shù)應(yīng)用于生物學(xué)研究領(lǐng)域的各個角落。（1）發(fā)現(xiàn)新蛋白質(zhì)或者探究出蛋白質(zhì)的新功能通過雙雜交技術(shù)篩選動植物的不同細胞組織或不同時期的cDNA文庫可以獲得大量的新蛋白質(zhì)。鄭海艦等[16]采用雙雜交技術(shù)，把牛肌肉細胞中產(chǎn)生的一種抑制素蛋白作為bait，成功從其cDNA文庫中篩選出組成肌肉成分的新蛋白質(zhì)，同時也為解釋肌肉形成的原理供給了理論依據(jù)。Benoit等[17]利用酵母雙雜交技術(shù)把一種名為Per-61的外周蛋白作為Bait，發(fā)現(xiàn)外周蛋白除了已知的功能之外還有一些特殊功能，比如調(diào)控細胞內(nèi)細胞器的分布、參與跨細胞膜的囊泡轉(zhuǎn)運、加工DNA和RNA、參與線粒體內(nèi)重要的能量代謝等。Tham等[18]利用該技術(shù)發(fā)現(xiàn)埃及伊蚊（Aedesaegypti）的CPB1蛋白和登革病毒（denguevirus）的DENV2E蛋白具有相互作用，并且CPB1蛋白對病毒在伊蚊腸道細胞中的釋放與積累有一定的調(diào)控作用，而另一方面埃及伊蚊作為登革病毒的主要傳播媒介，這兩種蛋白之間互作關(guān)系的發(fā)現(xiàn)很大程度上對控制登革病毒的傳播有重要意義。Cao和Yan等[19]則是將目標放在了小麥上，利用酵母雙雜交技術(shù)建立起小麥的cDNA文庫，把影響小麥春化作用的TaVRN-A1作為誘餌蛋白，篩選出互作蛋白質(zhì)TaSVP1和TaSOC1。除此之外，還有研究人員基于對蛋白質(zhì)的已知功能的了解，致力于探索其新功能，對篩選出新的domain有重要幫助。（2）建立基因組蛋白連鎖圖譜另一方面，隨著人們對生命科學(xué)研究的不斷深入，現(xiàn)在對生物學(xué)的研究已經(jīng)達到了更為精確的基因水平，另一方面基因文庫也是愈發(fā)完善，研究人員發(fā)現(xiàn)了越來越多的具有調(diào)控生命活動功能的結(jié)構(gòu)域和蛋白質(zhì)。這些蛋白質(zhì)是由DNA編碼區(qū)上的可編碼蛋白的基因轉(zhuǎn)錄而來，這些基因在功能和結(jié)構(gòu)上相互之間也存在著某些聯(lián)系，這對我們研究生物體正?；顒右约罢{(diào)節(jié)具有重要意義[20,21]。酵母雙雜交技術(shù)在建立基因組蛋白質(zhì)連鎖圖譜上也有廣泛應(yīng)用。Waaijers等[22]使用數(shù)種已知蛋白質(zhì)為bait，以人類基因組文庫為對象進行酵母雙雜交的篩選，同時人基因組蛋白質(zhì)連鎖圖譜也因此而被建立起來。還確定了圓蟲細胞中中約200個蛋白質(zhì)之間的互作結(jié)構(gòu)域，為完善蛋白質(zhì)互作網(wǎng)絡(luò)做出了突出貢獻。Yuan等[23]繪制出了乙肝病毒HBX蛋白的互作圖譜，發(fā)現(xiàn)了9個與HBX蛋白存在相互作用的新蛋白質(zhì)，同時通過Pull-down技術(shù)還發(fā)現(xiàn)了與基孔肯雅熱病毒有互作關(guān)系12個新蛋白并且通過雙雜交技術(shù)還繪制了其基因網(wǎng)狀圖，這對兩種病毒蛋白的發(fā)現(xiàn)對酵母雙雜交技術(shù)在醫(yī)療藥物方面的利用有重要意義。在沒有酵母雙雜交技術(shù)之前雖然已知弓形蟲的微線體蛋白是一種具有調(diào)控功能的粘附蛋白質(zhì)，但是具體就如何對弓形蟲內(nèi)進行調(diào)節(jié)的原理尚不清楚，但是隨著酵母雙雜交技術(shù)的發(fā)現(xiàn)，可以確定其MIC2蛋白是通過與蛋白A結(jié)構(gòu)域結(jié)合來對其進行調(diào)控，闡明了其作用機理[24].Simona等[25]也是利用Pull-down和酵母雙雜交兩種技術(shù)相結(jié)合發(fā)現(xiàn)了一類作用于RNA3’末端的甲基轉(zhuǎn)移酶在空間上具有兩個互作蛋白，進而補充了植物RNAtransmethylase的圖譜內(nèi)容。Andrieu等[26]篩選出了226個會與HeatShockProteins27之間發(fā)生互作作用的蛋白質(zhì)，并且通過繪制HSP27的蛋白網(wǎng)絡(luò)圖譜發(fā)現(xiàn)HSP27蛋白具有參與新細胞的生理過程的作用，包括但不限于修復(fù)和剪切DNA。由此可見酵母雙雜交技術(shù)在建立和完善蛋白連鎖圖譜方面有重要作用，并且為進一步了解基因提供了技術(shù)基礎(chǔ)。（3）篩選藥物作用位點及藥物對蛋白質(zhì)之間相互作用的影響分子間相互作用可能導(dǎo)致疾病的產(chǎn)生，近幾年有多項實驗結(jié)果表明，治療癌癥和病毒類疾病效果最顯著的是多肽類藥物?？梢杂秒p雜交技術(shù)的篩選功能用于確定治療所用的多肽類藥物及其和致病因子的蛋白質(zhì)間的相互關(guān)系，分析其發(fā)病機理，確定治療所用的多肽類藥物與致病蛋白間的關(guān)系，阻斷它們的相互聯(lián)系以達到治療疾病的目的，目前該技術(shù)已廣泛應(yīng)用在藥物篩選中。Waheed等[27]同樣通過對細菌進行逆向雙雜交得到了一種能影響TsG101蛋白與Gag蛋白結(jié)合的一種cyclin，阻斷HIV-1在宿主細胞體內(nèi)的出胞過程。另外經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)由登革熱病毒引起發(fā)熱、皮疹和出血等臨床癥狀的致病機理與病毒的NS3拓撲異構(gòu)酶、β-importin核內(nèi)轉(zhuǎn)運受體和NS5RNA聚合酶三者間的相互作用有關(guān)。秦咸蘊[28]利用雙雜交技術(shù)篩選出了能抑制引發(fā)嬰幼兒手口足?。℉FMD）主要病原體腸道病毒Ev71活性的中藥，為用藥物治療治療腸道疾病方面做出了巨大貢獻。（4）建立蛋白質(zhì)互作網(wǎng)絡(luò)許多蛋白質(zhì)互相之間在功能上是有聯(lián)系的，同時在機體進行生命活動時，這些蛋白質(zhì)又彼此協(xié)調(diào)控制。隨著人類基因組計劃的不斷進程與基因文庫各方面的巨大進步，大量ORF產(chǎn)生，研究其功能成為了之后的主要任務(wù)，這些基因的功能通過其轉(zhuǎn)錄翻譯產(chǎn)生的蛋白質(zhì)表現(xiàn)出來，通過酵母雙雜交技術(shù)，逐步走向自動化、高通量。郜盡[29]等在研究能對肝臟生命活動進行調(diào)控的轉(zhuǎn)錄因子時，用32個開放閱讀框作為誘餌蛋白用于篩選其互作蛋白，繪制調(diào)節(jié)肝臟蛋白質(zhì)的互作關(guān)系圖譜。在2014年底的一期《Cell》中指出由加拿大高等研究院和美國哈佛醫(yī)學(xué)院的科學(xué)家共同組成的一個研究小組并完成了一項名為“人類互作組（Humaninteractome）”，繪制出迄今為止人類歷史上規(guī)模最大的基因組編碼蛋白互作圖譜，比以往的蛋白質(zhì)互作圖譜大4倍以上，其中描述了蛋白質(zhì)間1.4萬個直接相互作用。[30]1.3本實驗的目的和意義酵母雙雜交技術(shù)主要用于蛋白質(zhì)相互作用的研究，本研究的目的是構(gòu)建以p30-GFP為載體的雜交質(zhì)粒，為進一步利用酵母雙雜交篩選出細胞中蛋白質(zhì)相互作用的蛋白質(zhì)奠定基礎(chǔ)。構(gòu)建誘餌質(zhì)粒是進行酵母雙雜交篩選的必要條件，因此本實驗為深入闡述LOC_Os06g49160與宿主之間的相互關(guān)系奠定了實驗基礎(chǔ)。

2材料與方法2.1材料2.1.1質(zhì)粒和菌種大腸桿菌E.coliDH5α由本實驗室保存P30-GFP載體購自Clontech公司2.1.2主要試劑限制性內(nèi)切酶EcoRⅠ以及BamHⅠ內(nèi)切酶T4DNA連接酶TaqDNA聚合酶引物Oligo(dT)16瓊脂糖胰蛋白胨酵母浸粉NaClDNA純化試劑盒DNAPurificationKit試劑盒Promega公司QuickpurePlasmidMinikit試劑盒大腸桿菌DH5α感受態(tài)細胞2.1.3主要儀器儀器名稱生產(chǎn)廠家立式自動壓力蒸汽滅菌器廈門致微儀器有限公司生化培養(yǎng)箱上海博迅實業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠振蕩培養(yǎng)箱上海知楚儀器有限公司超凈工作臺常州普天儀器制造有限公司低溫高速離心機艾本德生命科學(xué)公司PCR儀北京六一生物科技有限公司電泳儀北京六一生物科技有限公司凝膠成像系統(tǒng)北京六一生物科技有限公司電子天平奧豪斯儀器（常州）有限公司2.1.4主要試劑的配制（1）LB液體培養(yǎng)基：用天平稱取5g蛋白胨，2.5g酵母提取物，5gNaCl，加入去離子水攪拌使其完全溶解，并用NaOH調(diào)節(jié)pH7.5，再次加入去離子水至總體積500mL，高壓蒸汽滅菌（2）LB固體培養(yǎng)基：于LB液體培養(yǎng)基中加入瓊脂粉（按照每升液體培養(yǎng)基12g瓊脂粉的比例），放置于電爐上加熱攪拌使瓊脂粉完全溶解，高壓蒸汽滅菌（3）50×TAE電泳緩沖液：稱取242gTris和Na2EDTA·2H2O37.2g置于1L的燒杯中，加入57.1ml的冰醋酸充分溶解后加入去離子水定容至1L后，室溫保存?zhèn)溆茫?）1×TAE緩沖液：量取20mL50×TAE緩沖液，加入去離子水定容到1L（5）1%電泳凝膠：準確稱量瓊脂糖0.15g于錐形瓶中，量取17mL1×TAE緩沖液倒入錐形瓶輕輕搖晃均勻，至微波爐中加熱，重復(fù)數(shù)次，至溶液變澄清，加熱時間不宜過久防止溶液蒸干。待稍微放置冷卻至手可以碰觸的溫度時加入1μLDNA核酸染料Gelred，搖晃混勻，倒入制膠板中，靜置冷卻25min（6）100mg/mL卡那霉素：準確量取1g卡那霉素粉末于錐形瓶中，加入少量去離子水充分溶解后，再加入去離子水定容到10mL，用高壓滅菌后的0.22μm濾膜過濾滅菌，之后分裝到2mL規(guī)格的無菌離心管中，在-20℃條件下保存?zhèn)溆?，終濃度為100mg/mL（7）PBSbuffer：稱取磷酸二氫鉀（KH2PO4）0.27g,磷酸氫二鈉（Na2HPO4·12H2O）1.42g，氯化鈉（NaCl）8g，氯化鉀（KCl）0.2g加入去離子水800ml充分攪拌溶解后，用濃鹽酸調(diào)節(jié)pH至7.4，最后定容到1L（8）10×電泳緩沖儲存液：10g十二烷基硫酸鈉（SDS），30g三羥甲基氨基甲烷（Tris），144g甘氨酸，加超純水至1L，調(diào)節(jié)pH8.3（9）50mg/ml鹽酸壯觀霉素：量取1g壯觀霉素粉末，加入2mL去離子水溶解后，再加入去離子水定容到20mL，用高壓滅菌后的0.22μm濾膜過濾滅菌，之后分裝到2mL規(guī)格的無菌離心管中，-20℃保存，終濃度為50mg/mL（10）SolutionⅠ：50Mm/LEDTA（pH8.0）,1%葡萄糖，25Mm/LTris-HClpH8.0（11）SolutionⅡ：0.2mol/LNaOH（使用前用10mol/LNaOH母液稀釋），1%SDS（12）SolutionⅢ：5mol/LKac60ml，冰醋酸11.5ml，ddH2O28.5ml，定容至100ml，高壓蒸汽滅菌，終濃度為：K+3mol/L，Ac-5mol/L,pH4.8（必須現(xiàn)配現(xiàn)用）2.2方法2.2.1轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細胞在超凈工作臺，將2μL質(zhì)粒將入到已預(yù)冷的100μL感受態(tài)細胞中，混合均勻之后在冰水浴在放置25min，再放入42℃恒溫水浴鍋中熱激90s，再次放入冰水浴中2min，保證其完全冷卻。向離心管中加入800μL的LB液體培養(yǎng)基，在220rpm37℃振蕩培養(yǎng)1h，使其恢復(fù)表達抗生素的抗性標記基因。培養(yǎng)之后，在超凈工作臺上將菌液均勻涂布在含有卡那抗生素的LB平板上，37℃恒溫箱倒置過夜培養(yǎng)12-16h。2.2.2質(zhì)粒擴大培養(yǎng)經(jīng)過37℃恒溫過夜培養(yǎng)的陽性轉(zhuǎn)化子的菌落顏色為白色，用牙簽挑取8個生長良好的白色單菌落同時加入到5mLLB（含有Kan+）液體培養(yǎng)基中，放置于37℃恒溫振蕩培養(yǎng)箱中，220rpm振蕩培養(yǎng)10h后，菌液呈肉眼可見的渾濁狀態(tài)。2.2.3質(zhì)粒提取經(jīng)過過夜培養(yǎng)菌液質(zhì)粒提取使用質(zhì)粒抽提試劑盒，本實驗使用的質(zhì)粒提取試劑盒為QuickpurePlasmidMinikit試劑盒。在超凈工作臺中將每個樣品都分批吸取到離心管中，共5mL菌液，在8000rpm的速度下離心2min，最后將菌體沉淀收集到同一個無菌離心管中，最后一次離心收集盡可能用移液槍將培養(yǎng)基吸干并丟棄。在（1）中含有菌體沉淀的離心管中加入250μLbufferPB，用槍頭反復(fù)吹吸直至充分混勻。使用bufferPS和bufferPW之前要先檢查是否存在沉淀，若有沉淀，需在37℃下恒溫溶解后恢復(fù)室溫再使用。柱平衡：向已裝有收集管的吸附柱中加入200μLbufferPS。在13000rpm下離心1min，倒掉收集管中的廢液，將吸附柱重新放回收集管中。將（1）中已經(jīng)混有bufferPB的液體加入到放有收集管的吸附柱中，然后立即溫和顛倒離心管10次以混勻溶液，室溫靜置2min，若同時提取多個樣品，則選擇每加入一管即可混勻，不可全部加入再混勻，13000rpm下離心1min，倒掉收集管中的廢液，將吸附柱放回收集管中。加入500μLbufferPW（使用前請先檢查是否加入無水乙醇）到吸附柱中，依舊是每加入一管混勻一管的方法，加入之后立即溫和顛倒離心管10次使其充混合均勻。在13000rpm下離心1min，倒掉收集管中的廢液，將吸附柱放回收集管中。重復(fù)步驟（5）一遍。將空吸附柱和收集管再次放置在13000rpm轉(zhuǎn)速下離心1min，此步目的是除去吸附柱和收集管中殘留的乙醇，因為乙醇會對后續(xù)的實驗造成影響，為確保下游實驗?zāi)苷＿M行，可以將吸附柱開蓋，置于室溫放置數(shù)分鐘，以徹底晾干吸附材料中殘留的乙醇。將吸附柱放到一個新的離心管中，向吸附膜中間位置懸空滴加40μLbufferEB，室溫放置1min，在13000rpm下離心1min，收集DNA溶液，-20℃下保存?zhèn)溆谩?.2.4PCR擴增以上步驟提取的質(zhì)粒為模板進行PCR擴增反應(yīng)，通過GenBank中搜索到水稻LOC_Os06g491601580bp，采用Primer5軟件設(shè)計了一對可以特異擴增其實位點的引物，在LOC_Os06g49160上下游引物的5’分別加上XbaⅠ和BamHⅠ酶切位點序列。LOC_Os06g49160引物序列上游引物F1:5’-ATGGTGGTGGCCATCGCT-3’下游引物F2:5’-GAATCCTTTGAGCTGACCACTCA-3’p30-GFP

質(zhì)粒載體引物序列上流引物F3：5’-CGGAATTCCGATGGTGGTGGCCATCGCT-3’下流引物F4:5’-CGGGATCCCGGAATCCTTTGAGCTGACCACTCA-3’向無菌PCR管中加入下列試劑進行PCR擴增實驗TemplateDNA2μL10×Taq酶擴增緩沖液5μLdNTP混合溶液（2.5mmol/L）2μLPrimerF2μLPrimerR2μLTaqDNA聚合酶1μLddH2O36μL總體積50μL將PCR管置于PCR儀上，蓋好熱蓋，設(shè)定反應(yīng)參數(shù)：95℃預(yù)變形5min，（95℃變性30s，62℃退火30s，70℃延伸1min）共35個循環(huán)，72℃保溫10分鐘，冷卻至4℃。離心10s，將擴增產(chǎn)物置于-20℃冰箱保存?zhèn)溆谩?.2.5PCR產(chǎn)物的鑒定和回收將PCR的擴增產(chǎn)物進行1%瓊脂糖凝膠電泳分析其擴增情況。預(yù)計擴增產(chǎn)物大小為750bp左右，并從TAE瓊脂糖膠上切下目的片段的電泳條帶，按照DNA純化試劑盒上的說明書方法對PCR產(chǎn)物和p30-GFP空載體進行分離回收?；厥詹襟E：直接向1.5ml離心管中加入90μlbuffer和PCR反應(yīng)產(chǎn)物，振蕩使其混合均勻；向離心管中加入1mL樹脂，每隔1分鐘振蕩離心管，共三次；將沒有拉桿的注射器筒（3mL）放置在純化柱上，加入上述混合液，然后用拉桿慢慢將混合液推進純化柱內(nèi)；卸下注射器筒，拔出拉桿，再將注射器筒裝上純化柱，加入2mL的異丙醇，然后裝上拉桿，慢慢推出液體以清洗柱子；再次卸下注射器筒，將純化柱裝在1.5mL離心管上，10000rpm離心2min，以干燥樹脂；再將純化柱裝在一個新的1.5mL離心管上，加入30μL的ddH2O沖液，1min后再10000rpm離心20s，溶出DNA片段；移去純化柱，將純化出的DNA溶液取出部分用于酶切，其余在-20℃下保存?zhèn)溆?.2.6PCR產(chǎn)物以及載體雙酶切（1）反應(yīng)體系1和2：1.回收的PCR產(chǎn)物：7μL10×限制酶buffer：2.5μL0.1%B5A：5μL無菌水：32.5μLXbaI（10000U/ml）：1.5μLBamHI（10000U/ml）：1.5μL總體積：50μL2.p30-GFP空載體：20μL10×限制酶buffer：2.5μL0.1%B5A：5μL無菌水：19.5μLXbaI（10000U/ml）：1.5μLBamHI（10000U/ml）：1.5μL總體積：50μL（2）將以上體系液體加入離心管中混勻后，在5000rpm轉(zhuǎn)速下離心3s，使液體都聚集在管底，置于37℃水浴鍋中酶切4h，再轉(zhuǎn)移到65℃條件下保存15min使內(nèi)切酶失活，終止酶切反應(yīng)；（3）將上述酶切產(chǎn)物與6×緩沖液混合，進行1%瓊脂糖凝膠電泳，切下目的條帶，用DNA純化試劑盒分別純化回收，并用于下一步的連接反應(yīng)。2.2.7目的片段與載體的連接PCR產(chǎn)物與載體p30-GFP均進行雙酶切后，可將PCR產(chǎn)物連接到p30-GFP的XbaI/BamHI位點之間cDNA片段與p30-GFP載體連接體系：T4DNA連接酶（2U/ml）0.4μLT4DNA連接酶緩沖液（10×Buffer）1μLddH2O4.2μL載體DNA（150ng/ml）4μL目的片段（60ng/ml）0.4μL總體積10μL混勻后，在16℃條件下反應(yīng)過夜。其中目的片段的摩爾濃度應(yīng)該為p30-GFP摩爾濃度的3倍以上，連接產(chǎn)物用于下一步感受態(tài)細胞的轉(zhuǎn)化。2.2.8連接產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化將5μL連接產(chǎn)物加入到200μL感受態(tài)大腸桿菌DH5α懸液中（始終在冰浴中），溫和地混合均勻，先置于冰水浴保存30min，共計2根試管。再取另一支只加入2μl載體p30-GFP，為陰性對照管，分別編號為1、2、3號，同樣加入200μl菌懸液混合后冰水浴保存30min；將3支試管都放入事先預(yù)熱到42℃恒溫水浴鍋中熱激90秒，然后迅速放置冰浴中冷卻5分鐘；向3支試管中都加入700μLLB培養(yǎng)基并混勻，放置于37℃的恒溫搖床中（200rpm）培養(yǎng)30分鐘；將1號和2號試管中的混合物經(jīng)離心后去除上層培養(yǎng)基，將底層沉淀涂布用已滅菌的玻璃涂布器均勻涂布，轉(zhuǎn)移到含鹽酸壯觀霉素的LB瓊脂培養(yǎng)基平板上，3號管直接移取30μl同樣進行涂布，待到菌液已被培養(yǎng)基完全吸收，將平板倒置于37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過夜。2.2.9陽性克隆的篩選和鑒定從上一步培養(yǎng)的平板上挑取5個陽性克隆，按照堿裂解法得到少量的質(zhì)粒，通過電泳初步鑒定出陽性克隆載體。其中序列正確的重組質(zhì)粒保存?zhèn)溆脧呐囵B(yǎng)基平板上挑取一個白色單菌落的轉(zhuǎn)化子，接種在含有鹽酸壯觀霉素濃度為50mg/ml的LB培養(yǎng)基中，選擇其中能正常生長具有壯觀霉素抗性的菌種，置于37℃的搖床150rpm振蕩過夜培養(yǎng)；移取1.5ml菌液于EP管中，在6000rpm轉(zhuǎn)速下高速離心2分鐘，棄上清液，將管倒置于衛(wèi)生紙上數(shù)分鐘，使液體流盡，使細胞盡可能干燥；向EP管中加入200μLsolutionⅠ溶液，在漩渦振蕩器上振蕩20秒使其充分混勻；再向其中加入新配置的400μLsolutionⅡ溶液，蓋緊管口，輕輕顛倒數(shù)次使其混勻并使細胞裂解，在冰浴中放置3分鐘；加入300μL預(yù)冷的solutionⅢ溶液，再次振蕩顛倒混勻，使沉淀混勻，冰浴5分鐘；于12000rpm離心10分鐘，轉(zhuǎn)移上清液700μL于另一干凈的EP管中，棄沉淀；加入700μL的酚：氯仿：異丙醇（25:24:1），振蕩30秒混勻，于室溫下放置10分鐘；再次放置在離心機中，于12000rpm離心5分鐘，提取上清液（約500μl）于另一干凈EP管中；加入2倍體積無水乙醇振蕩混勻后，在-20℃下放置15min；于12000rpm離心10分鐘，將管口倒置于衛(wèi)生紙上使液體流盡，用70%的乙醇洗滌兩遍沉淀；將離心管放置室溫下使其自然干燥，待乙醇揮發(fā)后，將沉淀溶于20μlTE緩沖液中，提取出來的質(zhì)粒置于-20℃保存?zhèn)溆谩?.2.10重組質(zhì)粒的雙酶切鑒定將已提取的重組質(zhì)粒按照下列體系加樣，并放置于37℃恒溫水浴鍋中酶切一個小時。待反應(yīng)結(jié)束后，取出酶切后的重組質(zhì)粒、p30-GFP、目的片段各10μL在1%瓊脂糖凝膠用110V電泳25min，在凝膠成像系統(tǒng)下觀察結(jié)果，并保存電泳圖。重組質(zhì)粒p30-GFP-1605μLXbaⅠ0.5μLBamHⅠ0.5μL10×buffer緩沖液2.0μL滅菌ddH2O12μL總體積20μL2.2.11重組質(zhì)粒的測序鑒定構(gòu)建的重組質(zhì)粒經(jīng)過雙酶切鑒定后和預(yù)期結(jié)果相符合的質(zhì)粒送與基因科技有限公司進行測序。

3結(jié)果與分析3.1目的基因的PCR擴增以經(jīng)過QuickpurePlasmidMinikit質(zhì)粒提取盒提取出來的質(zhì)粒為模板進行PCR擴增，用2kbDNAladder為maker進行1%瓊脂糖凝膠電泳分析，結(jié)果如圖3-1所示，顯示PCR產(chǎn)物大小在500-1000bp之間出現(xiàn)清晰條帶，與與其片段大?。?50bp）一致。1000bp→500bp→1000bp→500bp→圖3-1目的基因的PCR擴增電泳圖Fig3-1TargetgenebyPCRM：DL2000DNA相對分子質(zhì)量；1,2,3,4,5,6：目的基因；7：陰性對照M:DL2000DNAMaker；1,2,3,4,5,6：Targetgene；7：Negativecontrol3.2誘餌質(zhì)粒的雙酶切與測序鑒定將純化回收后的連接產(chǎn)物重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入大腸桿菌DH5α感受態(tài)細胞中，篩選得到陽性轉(zhuǎn)化子，用堿裂解法操作提取擴增的誘餌質(zhì)粒，對其使用XbaⅠ和BamHⅠ雙酶切鑒定，并進行瓊脂糖電泳分析從電泳圖譜3-2可以看到在750bp左右有一條亮帶，與預(yù)期大小一致。對誘餌質(zhì)粒進行基因測序，結(jié)果顯示與GenBank公布的蛋白基因序列（）同源性為100%。

4結(jié)論與討論4.1結(jié)論本實驗成功構(gòu)建了誘餌質(zhì)粒p30-GFP-160，將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入到大腸桿菌DH5α感受態(tài)細胞中，成功篩選出具有壯觀霉素抗性的陽性克隆菌，進一步通過雙酶切電泳和基因測序驗證了質(zhì)粒的正確性，并且符合酵母雙雜交質(zhì)粒的構(gòu)建要求。4.2討論目前酵母雙雜交系統(tǒng)是使用較為廣泛的用于研究兩種或多種蛋白質(zhì)之間功能與結(jié)構(gòu)關(guān)系的一種實驗方法，原理是在酵母菌的細胞內(nèi)模擬出在細胞環(huán)境內(nèi)兩種蛋白質(zhì)間的相互作用，通常情況下的作用是研究或者驗證已知蛋白質(zhì)間的關(guān)系、尋找與已知蛋白有聯(lián)系并且具有相互作用的未知蛋白、獲取新基因等，同時在進一步弄清細胞的信號傳導(dǎo)機制、細胞生長衰老與凋亡和癌基因等相關(guān)細胞生物學(xué)的研究也具有重要作用。雙雜交系統(tǒng)是以酵母菌轉(zhuǎn)錄激活因子GAL4的特性理論為支撐建立的，GAL4包含兩個結(jié)構(gòu)域，分別是結(jié)合結(jié)構(gòu)域（N末端結(jié)構(gòu)域或者DBD）和激活結(jié)構(gòu)域（C末端結(jié)構(gòu)域或者AD），它們在功能和結(jié)構(gòu)上都相互獨立，只有當兩者處于同一細胞內(nèi)時，相互之間才可以通過建立空間聯(lián)系來激活轉(zhuǎn)錄因子GAL4，單獨的任意一種結(jié)構(gòu)域都無法激活GAL4，GAL4能識別基因啟動子上游激活序列（UASg）的一段17bp的序列：5'-CGGRNNRCYNYNYNCNCCG-3'（R表示嘌呤，Y表示嘧啶，N表示任意脫氧核苷酸），同時激活下游半乳糖苷酶相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄。本實驗構(gòu)建水稻160基因雙雜交質(zhì)粒載體，為找到與水稻160基因相互作用的蛋白質(zhì)奠定了基礎(chǔ)。首先需要將目的片段導(dǎo)入p30-GFP的多克隆位點從而得到誘餌重組質(zhì)粒p30-GFP-160。利用分子克隆技術(shù)，目的片段事先設(shè)計的特異性引物中含有與質(zhì)粒p30-GFP相對性的限制性內(nèi)切酶BamHⅠ和XbaⅠ的酶切位點，通過聚合酶鏈式反應(yīng)擴增含有酶切位點的目的片段的cDNA產(chǎn)物，回收產(chǎn)物，再用BamHⅠ和XabⅠ限制性內(nèi)切酶對目的片段和載體p30-GFP進行雙酶切，回收片段并連接，連接產(chǎn)物導(dǎo)入大腸桿菌DH5α感受態(tài)細胞中，利用p30-GFP質(zhì)粒所帶的壯觀霉素抗性接種在含有該抗生素的培養(yǎng)基中進行培養(yǎng)，從而篩選出具有抗性的陽性克隆菌，用堿提取法提取出克隆菌中的重組質(zhì)粒，進行雙酶切后用1%瓊脂糖凝膠電泳驗證目的片段的大小是否與預(yù)期值相符合，并送往基因技術(shù)公司測序進一步驗證重組質(zhì)粒的序列是否正確。至此，誘餌質(zhì)粒p30-GFP-160構(gòu)建成功，篩選出其互作蛋白創(chuàng)造了實驗條件。

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