分子生物學(xué)的復(fù)制損傷與修復(fù)

分子生物學(xué)的復(fù)制損傷與修復(fù)第1頁，共101頁，2023年，2月20日，星期四第一節(jié)DNA的復(fù)制(Replication,DNAbiosynthesis)

指DNA雙鏈在細(xì)胞分裂以前進(jìn)行的復(fù)制過程。哺乳動物的細(xì)胞周期第2頁，共101頁，2023年，2月20日，星期四（一）半保留復(fù)制

DNA在復(fù)制時，以親代DNA的每一股作模板，合成完全相同的兩個雙鏈子代DNA，每個子代DNA中都含有一股親代DNA鏈，這種現(xiàn)象稱為DNA的半保留復(fù)制(semi-conservativereplication)。意義：半保留復(fù)制說明DNA在代謝上的穩(wěn)定性。經(jīng)過許多代的復(fù)制，DNA鏈仍可保持完整，這在生物的遺傳上是十分重要的。一、DNA復(fù)制特征第3頁，共101頁，2023年，2月20日，星期四DNA以半保留方式進(jìn)行復(fù)制，是在1958年由M.Meselson和

F.Stahl所完成的實驗所證明。該實驗首先將大腸桿菌在含15N的培養(yǎng)基中培養(yǎng)約十五代，使其DNA中的堿基氮均轉(zhuǎn)變?yōu)?5N。將大腸桿菌移至只含14N的培養(yǎng)基中同步培養(yǎng)一代、二代、三代。分別提取DNA，作CsCl密度梯度離心.半保留復(fù)制證據(jù)第4頁，共101頁，2023年，2月20日，星期四（以原核生物大腸桿菌為例）原料：dNTP，Mg++雙鏈DNA模板引物（primer），常是RNA，有游離的3’OH。引物酶（primase，DnaG），用于合成復(fù)制所必需的RNA引物

解螺旋酶(helicase),DnaB,由DnaA和DnaC協(xié)助在復(fù)制的起始點（OriC）上解開雙螺旋。與復(fù)制有關(guān)的酶和因子第5頁，共101頁，2023年，2月20日，星期四復(fù)制的起始點與方向

親代DNA開鏈，復(fù)制起始點呈叉型移動復(fù)制叉親代DNA分子3’5’3’5’復(fù)制起始點（ori）：DNA復(fù)制要從DNA分子的特定部位開始，此部位稱復(fù)制起始點

原核：一個起始點，約245bp,特殊的重復(fù)序列

真核：多個起始點ori第6頁，共101頁，2023年，2月20日，星期四E.coli復(fù)制起始點oriC跨度為245bp，包括兩個關(guān)鍵序列：13bp的序列和9bp序列,它是決定和控制E.coli染色體復(fù)制的唯一片段。

13bp序列區(qū)，每一個順序都由GATC開始，富含A和T，有助于螺旋解開，控制復(fù)制何時開始。第7頁，共101頁，2023年，2月20日，星期四

9bp重復(fù)序列，重復(fù)出現(xiàn)4次，能與起始蛋白dnaA特異結(jié)合，當(dāng)dnaA蛋白（約20種）結(jié)合于ori的4個部位上時復(fù)制開始。

dnaA蛋白（一種專一的蛋白）和ori結(jié)合后，雙螺旋解開形成復(fù)制叉。故dnaA蛋白與啟動解鏈有關(guān),dnaA蛋白是起始的關(guān)鍵成分。第8頁，共101頁，2023年，2月20日，星期四大腸桿菌復(fù)制起點成串排列的重復(fù)序列

GATCTNTTNTTT成串排列的三個13bp序列共有序列共有序列TTATCCACA

DnaA蛋白結(jié)合位點四個9bp序列DnaADnaB(解螺旋酶)SSB大腸桿菌DNA復(fù)制起點在起始階段的結(jié)構(gòu)模型第9頁，共101頁，2023年，2月20日，星期四復(fù)制方向DNA合成的方向單向、雙向？

1個起始點第10頁，共101頁，2023年，2月20日，星期四復(fù)制中的大腸桿菌染色體放射自顯影圖

(Caims實驗)

將3H-胸苷標(biāo)記大腸桿菌DNA，經(jīng)過近兩代的時間，3H-胸苷摻入大腸桿菌DNA。用溶菌酶把細(xì)胞壁消化掉，使完整的大腸桿菌染色體DNA釋放出來，放射自顯影，得到上圖。非復(fù)制部分（C）銀粒子密度較低，由一股放射性鏈和一股非放射性鏈構(gòu)成。已復(fù)制部分站整個染色體的三分之二，其中一條雙鏈（B

）僅有一股鏈?zhǔn)菢?biāo)記的，另外一股雙鏈（A

）的兩股鏈都是標(biāo)記的，銀粒子密度為前二者的兩倍。染色體全長約為1100微米。環(huán)狀DNA的復(fù)制ABCABC第11頁，共101頁，2023年，2月20日，星期四雙向復(fù)制oriori復(fù)制子oriori

真核生物兩個相鄰復(fù)制起始點之間的DNA片段以起始點為中心，向兩個方向進(jìn)行復(fù)制第12頁，共101頁，2023年，2月20日，星期四多個起始點第13頁，共101頁，2023年，2月20日，星期四二、DNA復(fù)制的酶學(xué)1.模板：解開成單鏈的DNA母鏈3.DNA聚合酶，DNA-pol2.底物dNTP：dATP，dGTP，dCTP，dTTP4.引物（primer）：RNA引物5.其他酶和蛋白質(zhì)因子第14頁，共101頁，2023年，2月20日，星期四一、復(fù)制的化學(xué)反應(yīng)生成磷酸二酯鍵N1OH3`5`+dN2TPN1N2-OH3`5`+PPiDNApol3’——TAGAAGACCTATTGGCC——5’5’——ATCTTCTGGATAACCGG——3’第15頁，共101頁，2023年，2月20日，星期四二、解鏈相關(guān)酶類1.解旋酶(helicase)2.拓?fù)洚悩?gòu)酶（topoisomeraseI、II）

3.單鏈DNA結(jié)合蛋白(SSB)第16頁，共101頁，2023年，2月20日，星期四

DNA解旋酶(helicase)（解鏈酶）

功能：DNA的雙螺旋解鏈（解DNA雙鏈），解開一對堿基，需2分子ATP，

作用點：DNA上局部單鏈處，向雙鏈方向解鏈。

種類：E.coli有四種解螺旋酶，I、II、III和rep蛋白。I、II、III中任一種沿模板5'-3'方向移動，rep蛋白沿模板3'-5'方向移動。5′3′5′3′rep第17頁，共101頁，2023年，2月20日，星期四2.拓?fù)洚悩?gòu)酶（Topo）DNA正超螺旋與負(fù)超螺旋負(fù)超螺旋正超螺旋DNA雙螺旋拓?fù)洚悩?gòu)酶第18頁，共101頁，2023年，2月20日，星期四第19頁，共101頁，2023年，2月20日，星期四

首先在大腸桿菌中被發(fā)現(xiàn)，它可使DNA的一條鏈發(fā)生斷裂和再連接，反應(yīng)無需供給能量。

另外，DNA復(fù)制時負(fù)超螺旋的消除，亦由拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅰ來完成，但它對正超螺旋無作用。Ⅰ型拓?fù)洚悩?gòu)酶第20頁，共101頁，2023年，2月20日，星期四

由兩個A亞基和兩個B亞基組成，即A2B2。它能使DNA的兩條鏈同時發(fā)生斷裂和再連接，當(dāng)它引入負(fù)超螺旋以消除復(fù)制叉前進(jìn)帶來的扭曲張力時，需要由ATP提供能量。

兩種拓?fù)洚悩?gòu)酶在DNA復(fù)制、轉(zhuǎn)錄和重組中均發(fā)揮重要作用。Ⅱ型拓?fù)洚悩?gòu)酶第21頁，共101頁，2023年，2月20日，星期四拓?fù)洚悩?gòu)酶I抑制劑：喜樹堿類拓?fù)洚悩?gòu)酶II抑制劑：依托泊苷，多柔比星，阿霉素類等第22頁，共101頁，2023年，2月20日，星期四3.單鏈DNA結(jié)合蛋白（SSB）作用：防止單鏈DNA重新形成雙鏈，防止單鏈DNA被核酸酶水解SSB第23頁，共101頁，2023年，2月20日，星期四三、DNA聚合酶（DNA-pol）即依賴于DNA的DNA聚合酶（DDDP）

真核生物有多種：

DNA-pol

、、、、…

原核生物有3種：

DNA-polⅠ、Ⅱ、Ⅲ第24頁，共101頁，2023年，2月20日，星期四DNA聚合酶功能5′3′聚合作用5′3′外切酶3′5′外切酶活性第25頁，共101頁，2023年，2月20日，星期四大腸桿菌三種DNA聚合酶比較DNA聚合酶Ⅱ分子量每個細(xì)胞的分子統(tǒng)計數(shù)5′-3′聚合酶作用3′-5′核酸外切酶作用5′-3′核酸外切酶作用轉(zhuǎn)化率主要功能活性（nt/min）

DNA聚合酶ⅠDNA聚合酶Ⅲ（復(fù)合物）109，000400+++1校讀,修復(fù)1000120，00040++-0.05400，00010-20+++50復(fù)制100000特性不清填補缺口50第26頁，共101頁，2023年，2月20日，星期四四、引物酶(Primase)和引發(fā)體

5′5′催化RNA引物合成的酶叫引物酶，它是一種特殊的RNA聚合酶DNA合成需在RNA引物的基礎(chǔ)上進(jìn)行RNA引物5′3′5′3′第27頁，共101頁，2023年，2月20日，星期四DnaA引發(fā)體（primosome）：包括解螺旋酶、DnaC、引物酶及DNA復(fù)制的起始區(qū)域5′3′3′5′引物酶DnaC引發(fā)體解螺旋酶第28頁，共101頁，2023年，2月20日，星期四

小結(jié)主要成員

主要作用DnaA識別復(fù)制起始位點解螺旋酶解開DNA雙鏈SSB維持已解開單鏈DNA的穩(wěn)定引物酶合成RNA引物TOPO使打結(jié)、纏繞、正超螺旋的DNA松馳DNA-polⅢDNA復(fù)制DNA-polⅠ水解引物、填補空隙、修復(fù)作用DNA連接酶催化雙鏈DNA中單鏈缺口的連接第29頁，共101頁，2023年，2月20日，星期四第三節(jié)DNA生物合成過程1.復(fù)制的起始2.鏈的延長3.復(fù)制的終止第30頁，共101頁，2023年，2月20日，星期四一復(fù)制的起始(一)DNA解成單鏈

由特定蛋白質(zhì)識別復(fù)制起始位點（ori），在解螺旋酶、TOPO酶及單鏈DNA結(jié)合蛋白的共同作用下，DNA解鏈，解旋，形成復(fù)制叉

倒Y第31頁，共101頁，2023年，2月20日，星期四(二)引發(fā)體的生成

解旋酶解開雙鏈后引物酶進(jìn)入形成引發(fā)體5′3′3′5′引物酶DnaC引發(fā)體解旋酶第32頁，共101頁，2023年，2月20日，星期四（三）RNA引物的合成

5′5′RNA引物5′3′5′3′第33頁，共101頁，2023年，2月20日，星期四參與復(fù)制起始的蛋白因子

名稱

功能DnaA蛋白辨認(rèn)起始點

解螺旋酶（DnaB，Rep）解開DNA雙鏈DnaC協(xié)助解螺旋酶

引物酶（DnaG）催化RNA引物生成SSB穩(wěn)定解開的單鏈拓?fù)洚悩?gòu)酶理順DNA鏈OriCE.coli復(fù)制起始點第34頁，共101頁，2023年，2月20日，星期四領(lǐng)頭鏈的合成第35頁，共101頁，2023年，2月20日，星期四復(fù)制過程簡圖第36頁，共101頁，2023年，2月20日，星期四555RNA酶OHP5DNA-polⅠdNTP55PATPADP+Pi55DNA連接酶

隨從鏈上不連續(xù)性片段的連接第37頁，共101頁，2023年，2月20日，星期四二、真核生物DNA生物合成（一）DNA的復(fù)制只發(fā)生在S期（二）多復(fù)制子（三）真核細(xì)胞含有5種DNA聚合酶（四）端粒復(fù)制染色體兩端DNA子鏈上最后復(fù)制的RNA引物，去除后留下空隙。第38頁，共101頁，2023年，2月20日，星期四53355335+5333355第39頁，共101頁，2023年，2月20日，星期四1.端粒telemer：指真核生物染色體線性DNA分子末端的結(jié)構(gòu)。

2.結(jié)構(gòu)特點：（1）由末端單鏈DNA序列和蛋白質(zhì)構(gòu)成。（2）末端DNA序列是多次重復(fù)的富含G、C堿基的短序列。第40頁，共101頁，2023年，2月20日，星期四3.功能：（1）維持染色體的穩(wěn)定性（2）維持DNA復(fù)制的完整性

4.端粒酶：由RNA和蛋白質(zhì)組成（1）RNA發(fā)揮模板作用（2）蛋白質(zhì)發(fā)揮逆轉(zhuǎn)錄酶活性第41頁，共101頁，2023年，2月20日，星期四端粒酶的催化延長作用爬行模型第42頁，共101頁，2023年，2月20日，星期四DNA聚合酶復(fù)制子鏈進(jìn)一步加工第43頁，共101頁，2023年，2月20日，星期四

引物合成后，由DNApolⅢ（在真核細(xì)胞為DNA聚合酶和)催化，按堿基配對原則，將dNTP逐一添加到引物3’

末端，形成磷酸二酯鍵，使新合成的鏈不斷延長

二復(fù)制的延長3’——AAGACCTATT——5’5’——TTCTGGATAA——3’DNAPolI,IIandIII5’-DNA-OH

5’-DNA-O-P-N-OHPP++

dNTPs第44頁，共101頁，2023年，2月20日，星期四前導(dǎo)鏈后隨鏈3’5’3’5’延長5’5’5’3’3’5’3’3’5’SSBDNAPolymerase岡崎片斷RNA引物引物酶5’3’5’TOPOⅡ解旋酶第45頁，共101頁，2023年，2月20日，星期四（三）終止階段

原核生物基因是環(huán)狀DNA，雙向復(fù)制的復(fù)制片段在復(fù)制的終止點(ter)處匯合。oriter

E.coli8232oriterSV40500第46頁，共101頁，2023年，2月20日，星期四半不連續(xù)復(fù)制(semi-discontinuousreplication)領(lǐng)頭鏈連續(xù)復(fù)制而隨從鏈不連續(xù)復(fù)制，就是復(fù)制的半不連續(xù)性。3535解鏈方向3′5′3′3′5′領(lǐng)頭鏈(leadingstrand)隨從鏈(laggingstrand)第47頁，共101頁，2023年，2月20日，星期四基因組能獨立進(jìn)行復(fù)制的功能單位稱為復(fù)制子(replicon)，每個復(fù)制子都含有控制復(fù)制起始的起點(origin)，可能還有終止復(fù)制的終點(terminus)。每個起始點產(chǎn)生兩個移動方向相反的復(fù)制叉，復(fù)制完成時，復(fù)制叉相遇并匯合連接。習(xí)慣上把兩個相鄰起始點之間的距離定為一個復(fù)制子。（2）復(fù)制子第48頁，共101頁，2023年，2月20日，星期四

DNA復(fù)制時，以復(fù)制起始點為中心，向兩個方向進(jìn)行復(fù)制.但在低等生物中,也可進(jìn)行單向復(fù)制（如滾環(huán)復(fù)制）①.原核細(xì)胞：染色體和質(zhì)粒固定起點雙向復(fù)制，②.

真核生物：染色體DNA，復(fù)制時多個起始點。（3）復(fù)制方向第49頁，共101頁，2023年，2月20日，星期四第50頁，共101頁，2023年，2月20日，星期四第51頁，共101頁，2023年，2月20日，星期四三、需要引物

DNA聚合酶不能直接聚合游離的dNTP，必須由一段核酸片段提供3’OH末端作為引物(primer)，才能開始聚合子代DNA鏈。

RNA引物的大小，在原核生物中通常為50～100個核苷酸，而在真核生物中約為10個核苷酸。RNA引物的堿基順序，與其模板DNA的堿基順序相配對。四、雙向復(fù)制

DNA復(fù)制時，以復(fù)制起始點為中心，向兩個方向進(jìn)行復(fù)制。但在低等生物中，也可進(jìn)行單向復(fù)制（如滾環(huán)復(fù)制）。

第52頁，共101頁，2023年，2月20日，星期四

五、半不連續(xù)復(fù)制（semidiscontinuousreplication）

由于DNA聚合酶只能以5’→3’方向聚合子代DNA鏈，即模板DNA鏈的方向必須為3’→5’。因此，分別以兩條親代DNA鏈作為模板聚合子代DNA鏈時的方式是不同的。定義：在DNA復(fù)制過程中，親代DNA分子中以3’→5’方向的母鏈作為模板指導(dǎo)新的鏈以5’→

3’方向連續(xù)合成;另一股以5’→

3’為方向的母鏈則指導(dǎo)新合成的鏈以5’→

3’方向合成1000—2000個核苷酸長度的許多不連續(xù)的片段（崗崎片段）。這種復(fù)制方式稱之為半不連續(xù)復(fù)制。第53頁，共101頁，2023年，2月20日，星期四PPPOH+OHPPPOHPPPPPPOHOH+PDNA合成方向不可能是3′→5′的解釋第54頁，共101頁，2023年，2月20日，星期四5’5’3’3’5’5’3’3’5’5’3’3’

前導(dǎo)鏈隨從鏈崗崎片段半不連續(xù)復(fù)制

以3'→5'方向的親代DNA鏈作模板的子代鏈在復(fù)制時基本上是連續(xù)進(jìn)行的，其子代鏈的聚合方向為5'→3'，這一條鏈被稱為領(lǐng)頭鏈(leadingstrand)。而以5'→3'方向的親代DNA鏈為模板的子代鏈在復(fù)制時則是不連續(xù)的，其鏈的聚合方向也是5'→3'，這條鏈被稱為隨從鏈(laggingstrand)。

第55頁，共101頁，2023年，2月20日，星期四前導(dǎo)鏈：在引物的3’端按5’→3’方向連續(xù)不斷地合成的DNA鏈。隨從鏈：在引物的3’端按5’→3’方向不連續(xù)合成的DNA鏈。岡崎片段：隨從鏈上不連續(xù)合成的DNA短片段（不包括引物）

由于親代DNA雙鏈在復(fù)制時是逐步解開的，因此，隨從鏈的合成是一段一段的。DNA在復(fù)制時，由隨從鏈所形成的一些子代DNA短鏈稱為岡崎片段(Okazakifragment)。

岡崎片段的大小，在原核生物中約為1000～2000個核苷酸，而在真核生物中約為100個核苷酸。

第56頁，共101頁，2023年，2月20日，星期四五、DNA聚合酶（DNApolymerase）聚合酶III——主要的復(fù)制酶，兼有校讀、糾錯的功能有從5’——3’延伸多核苷酸鏈的聚合酶活性，有模板依賴性，其延伸的方式是依據(jù)堿基互補配對的原則，將原料dNTP與末端核苷酸游離的3’OH以3’,5’磷酸二酯鍵連接，同時釋出一個PPi

。DNA聚合酶延伸多核苷酸鏈的方向總是5’3’

有從3’——5’外切酶的活性，以切除可能錯配的核苷酸第57頁，共101頁，2023年，2月20日，星期四聚合酶I用于切除引物RNA,并填補留下的空隙

有從5’——3’延伸多核苷酸鏈的聚合酶的活性；有從3’——5’外切酶的活性，以切除可能錯配的核苷酸；有從5’——3’外切酶的活性，其作用是切除引物聚合酶II活性弱,作用與聚合酶III相似有從5’——3’延伸多核苷酸鏈的聚合酶活性；有從3’——5’外切酶的活性第58頁，共101頁，2023年，2月20日，星期四323個氨基酸小片段5核酸外切酶活性大片段/Klenow片段

604個氨基酸DNA聚合酶活性

5核酸外切酶活性N端C端木瓜蛋白酶DNA-polⅠKlenow片段是實驗室合成DNA，進(jìn)行分子生物學(xué)研究中常用的工具酶。

第59頁，共101頁，2023年，2月20日，星期四六、DNA連接酶（ligase）

將不連續(xù)的DNA片段以3’，5’磷酸二酯鍵連接起來，原核生物通過分解NAD為NMN和Pi提供能量，真核生物則消耗ATP第60頁，共101頁，2023年，2月20日，星期四復(fù)制的終止由DNA聚合酶I完成切除引物，并且填補空隙，由DNA連接酶將DNA片段連接起來。第61頁，共101頁，2023年，2月20日，星期四

一個復(fù)制子只含有一個專一的復(fù)制起點和復(fù)制結(jié)束的終點。一個完整的復(fù)制子在一個細(xì)胞周期只復(fù)制一次(真核)。

原核生物染色體和質(zhì)粒都是獨立（只有單一個）復(fù)制子；真核細(xì)胞染色體中有多個復(fù)制子組成。第62頁，共101頁，2023年，2月20日，星期四（七）真核生物端粒的形成端粒(telomere)是指真核生物染色體線性DNA分子末端的結(jié)構(gòu)部分，通常膨大成粒狀。其共同的結(jié)構(gòu)特征是由一些富含G、C的短重復(fù)序列構(gòu)成可重復(fù)數(shù)十次至數(shù)百次。線性DNA在復(fù)制完成后，其末端由于引物RNA的水解而可能出現(xiàn)縮短。故需要在端粒酶（telomerase）的催化下，進(jìn)行延長反應(yīng)。

端粒酶是一種RNA-蛋白質(zhì)復(fù)合體，它可以其RNA為模板，通過逆轉(zhuǎn)錄過程對末端DNA鏈進(jìn)行延長。第63頁，共101頁，2023年，2月20日，星期四端粒（telomere）

染色體線性DNA分子末端通常膨大成粒狀共同的結(jié)構(gòu)特征:

富含TG

短重復(fù)序列維持染色體穩(wěn)定端粒酶（telomerase）

RNA-蛋白質(zhì)復(fù)合體逆轉(zhuǎn)錄酶延長末端DNA鏈進(jìn)行第64頁，共101頁，2023年，2月20日，星期四在真核生物，由端粒酶（telomerase）催化,在真核線性DNA的末端形成一種特殊的結(jié)構(gòu)并與蛋白質(zhì)結(jié)合成端粒（telomere）。

端粒由成百個6個核苷酸的重復(fù)序列所組成（人為TTAGGG，四膜蟲為TTGGGG）。端粒的功能為穩(wěn)定染色體的末端結(jié)構(gòu)，防止染色體間末端連接，并可補償滯后鏈5′-末端在消除RNA引物后造成的空缺。復(fù)制可使端粒5′末端縮短，而端粒酶（telomerase）可外加重復(fù)單位到5′-末端上，結(jié)果使端粒維持一定的長度。第65頁，共101頁，2023年，2月20日，星期四4、

DNA的幾種復(fù)制方式（1）、

直線雙向復(fù)制單點雙向，T7多點雙向，真核染色體DNA（2）、θ型復(fù)制：環(huán)狀雙鏈DNA，對稱復(fù)制，單向或雙向（E.coli.）（3）、

滾環(huán)復(fù)制：環(huán)狀單鏈DNA，Φx174（4）、

D環(huán)復(fù)制（取代環(huán)復(fù)制）：不對稱復(fù)制，線粒體、葉綠體DNA。兩條鏈的復(fù)制起點不在同一點上，一條鏈先復(fù)制，另一條鏈保持單鏈而被取代：當(dāng)一條鏈復(fù)制到一定程度時才暴露出另一條鏈的復(fù)制起點，另一條鏈才開始復(fù)制。第66頁，共101頁，2023年，2月20日，星期四第67頁，共101頁，2023年，2月20日，星期四第68頁，共101頁，2023年，2月20日，星期四三、滾環(huán)復(fù)制和D環(huán)復(fù)制滾環(huán)復(fù)制(rollingcirclereplication)：是某些低等生物的復(fù)制形式，如X174和M13噬菌體等。第69頁，共101頁，2023年，2月20日，星期四35553335'滾環(huán)復(fù)制的過程3-OH5-P5'5335第70頁，共101頁，2023年，2月20日，星期四D環(huán)復(fù)制(D-loopreplication)：是線粒體DNA(mitochondrialDNA，mtDNA)的復(fù)制形式。dNTPDNA-polγ

第71頁，共101頁，2023年，2月20日，星期四線粒體(mitochodriaDNA,mtDNA)哺乳動物線粒體mtDNA是一個長度為16.5kb的緊密雙鏈閉合環(huán)狀分子，外環(huán)為重鏈（H鏈），內(nèi)環(huán)為輕鏈（L鏈），以D環(huán)復(fù)制方式進(jìn)行。第72頁，共101頁，2023年，2月20日，星期四第二節(jié)DNA的損傷一、DNA的損傷（突變）由自發(fā)的或環(huán)境的因素引起DNA一級結(jié)構(gòu)的任何異常的改變稱為DNA的損傷，也稱為突變（mutation）。常見的DNA的損傷包括堿基脫落、堿基修飾、交聯(lián)，鏈的斷裂，重組等。（一）引起突變的因素1．自發(fā)因素(1)自發(fā)脫堿基：由于N-糖苷鍵的自發(fā)斷裂，引起嘌呤或嘧啶堿基的脫落。每日可達(dá)近萬個核苷酸殘基。(2)自發(fā)脫氨基：胞嘧啶自發(fā)脫氨基可生成尿嘧啶，腺嘌呤自發(fā)脫氨基可生成次黃嘌呤。每日可達(dá)幾十到幾百個核苷酸殘基。(3)復(fù)制錯配：由于復(fù)制時堿基配對錯誤引起的損傷，發(fā)生頻率較低。第73頁，共101頁，2023年，2月20日，星期四2．物理因素

由紫外線、電離輻射、X射線等引起的DNA損傷。其中，X射線和電離輻射常常引起DNA鏈的斷裂，而紫外線常常引起嘧啶二聚體的形成，如TT，TC，CC等二聚體。這些嘧啶二聚體由于形成了共價鍵連接的環(huán)丁烷結(jié)構(gòu)，因而會引起復(fù)制障礙。

第74頁，共101頁，2023年，2月20日，星期四3．化學(xué)因素(1)脫氨劑：如亞硝酸與亞硝酸鹽，可加速C脫氨基生成U，A脫氨基生成I。(2)烷基化劑：這是一類帶有活性烷基的化合物，可提供甲基或其他烷基，引起堿基或磷酸基的烷基化，甚至可引起鄰近堿基的交聯(lián)。(3)DNA加合劑：如苯并芘，在體內(nèi)代謝后生成四羥苯并芘，與嘌呤共價結(jié)合引起損傷。(4)堿基類似物：如5-FU等，可摻入到DNA分子中引起損傷或突變。(5)斷鏈劑：如過氧化物，含巰基化合物等，可引起DNA鏈的斷裂。

第75頁，共101頁，2023年，2月20日，星期四（二）DNA突變的類型堿基的轉(zhuǎn)換

第76頁，共101頁，2023年，2月20日，星期四第三節(jié)DNA損傷的修復(fù)

DNA損傷的修復(fù)方式可分為直接修復(fù)和取代修復(fù)兩大類。

第77頁，共101頁，2023年，2月20日，星期四

⌒

hv

UV→TT→

光復(fù)活酶→

修復(fù)TT（一）直接修復(fù)1．光復(fù)活（lightrepairing）

這是一種廣泛存在的修復(fù)作用。光復(fù)活能夠修復(fù)任何嘧啶二聚體的損傷。其修復(fù)過程為：

光復(fù)活酶（photo-lyase)識別嘧啶二聚體并與之結(jié)合形成復(fù)合物→在300～600nm可見光照射下，酶獲得能量，將嘧啶二聚體的丁酰環(huán)打開，使之完全修復(fù)→光復(fù)活酶從DNA上解離。

第78頁，共101頁，2023年，2月20日，星期四2．轉(zhuǎn)甲基作用

在轉(zhuǎn)甲基酶的催化下，將DNA上的被修飾的甲基去除。此時，轉(zhuǎn)甲基酶自身被甲基化而失活。3．直接連接

DNA斷裂形成的缺口，可以在DNA連接酶的催化下，直接進(jìn)行連接而封閉缺口。

第79頁，共101頁，2023年，2月20日，星期四（二）取代修復(fù)1．切除修復(fù)(excisionrepairing)

這也是一種廣泛存在的修復(fù)機(jī)制，可適用于多種DNA損傷的修復(fù)。該修復(fù)機(jī)制可以分別由兩種不同的酶來發(fā)動，一種是核酸內(nèi)切酶，另一種是DNA糖苷酶?！锌尚迯?fù)TT，電離輻射，某些化學(xué)誘變劑造成的DNA結(jié)構(gòu)的破壞

參加的酶有：特異的核酸內(nèi)切酶；外切酶；聚合酶；連接酶。第80頁，共101頁，2023年，2月20日，星期四第81頁，共101頁，2023年，2月20日，星期四第82頁，共101頁，2023年，2月20日，星期四第83頁，共101頁，2023年，2月20日，星期四2．重組修復(fù)(recombinationrepairing)

這是DNA的復(fù)制過程中所采用的一種有差錯的修復(fù)方式。(重組修復(fù)，復(fù)制后修復(fù)

)

第84頁，共101頁，2023年，2月20日，星期四3．SOS修復(fù)

由DNA損傷或抑制復(fù)制的處理所引起的一系列復(fù)雜的誘導(dǎo)效應(yīng)，稱為應(yīng)急反應(yīng)（SOS）。這是一種在DNA分子受到較大范圍損傷并且使復(fù)制受到抑制時出現(xiàn)的修復(fù)機(jī)制，以SOS借喻細(xì)胞處于危急狀態(tài)。

DNA分子受到長片段高密度損傷，使DNA復(fù)制過程在損傷部位受到抑制。損傷誘導(dǎo)一種特異性較低的新的DNA聚合酶，以及重組酶等的產(chǎn)生。由這些特異性較低的酶繼續(xù)催化損傷部位DNA的復(fù)制，復(fù)制完成后，保留許多錯誤的堿基，從而造成突變。

第85頁，共101頁，2023年，2月20日，星期四DNA損傷與藥物評價1.遺傳毒性試驗遺傳毒性研究在藥物研發(fā)中處于比較的重要位置。遺傳毒性試驗?zāi)軝z出DNA損傷及其損傷的固定。以基因突變、較大范圍染色體損傷、重組和染色體數(shù)目改變形式出現(xiàn)的DNA損傷的固定，一般被認(rèn)為是可遺傳效應(yīng)的基礎(chǔ)，并且是惡性腫瘤發(fā)展過程的環(huán)節(jié)之一。在檢測這些類別損傷的試驗中呈陽性的化合物為潛在人類致癌劑和/或致突變劑。由于在人體中已建立了某些化合物的暴露和致癌性之間的關(guān)系，而對于遺傳性疾病尚難以證明有類似的關(guān)系，故遺傳毒性試驗主要用于致癌性預(yù)測。第86頁，共101頁，2023年，2月20日，星期四實驗方法

Ames試驗（污染物致突變性檢測）是檢測化學(xué)物質(zhì)基因突變的常用方法。沙門氏菌回復(fù)突變試驗鼠傷寒沙門氏菌（Salmonellatyphimurium）的組氨酸營養(yǎng)缺陷型（his－）菌株，在含微量組氨酸的培養(yǎng)基中，除極少數(shù)自發(fā)回復(fù)突變的細(xì)胞外，一般只能分裂幾次，形成在顯微鏡下才能見到的微菌落。受誘變劑作用后，大量細(xì)胞發(fā)生回復(fù)突變，自行合成組氨酸，發(fā)育成肉眼可見的菌落。第87頁，共101頁，2023年，2月20日，星期四在評價突變危害中常用的有特殊重要意義的試驗第88頁，共101頁，2023年，2月20日，星期四第89頁，共101頁，2023年，2月20日，星期四TK基因突變試驗

TK基因突變試驗是一種哺乳動物體細(xì)胞基因正向突變試驗,近年來其應(yīng)用價值有明顯的提高。TK基因突變試驗的檢測終點是胸苷激酶（thymidinekinase，TK）基因的突變。在人類，TK基因定位于17號染色體長臂遠(yuǎn)端；在小鼠則定位于11號染色體。故TK基因的突變屬于常染色體基因突變。第90頁，共101頁，2023年，2月20日，星期四TK基因的產(chǎn)物胸苷激酶在體內(nèi)催化從脫氧胸苷（TdR）生成胸苷酸（TMP）的反應(yīng)。在正常情況下，此反應(yīng)并非生命所必需，原因是體內(nèi)的TMP主要來自于脫氧尿嘧啶核苷酸（dUMP），即由胸苷酸合成酶催化的dUMP甲基化反應(yīng)生成TMP。但如在細(xì)胞培養(yǎng)物中加入胸苷類似物（如三氟胸苷，即TFT——trifluorothymidine），則TFT在胸苷激酶的催化下可生成三氟胸苷酸，進(jìn)而摻入DNA，造成致死性突變，故細(xì)胞不能存活。若TK基因發(fā)生突變，導(dǎo)致胸苷激酶缺陷，則TFT不能磷酸化，亦不能摻入DNA，故細(xì)胞在含有TFT的培養(yǎng)基中能夠生長，即表現(xiàn)出對TFT的抗性。根據(jù)突變集落形成數(shù)，計算突變頻率，以判定受試物的致突變性。第91頁，共101頁，2023年，2月20日，星期四試驗采用的靶細(xì)胞系主要有小鼠淋巴瘤細(xì)胞L5178Y以及人類淋巴母細(xì)胞TK6和WTK1等。其基因型均為tk+/-。TK基因突變試驗可檢出包括點突變、大的缺失、重組、染色體異倍性和其他較大范圍基因組改變在內(nèi)的多種遺傳改變。第92頁，共101頁，2023年，2月20日，星期四轉(zhuǎn)基因小鼠基因突變試驗轉(zhuǎn)基因小鼠基因突變試驗可在整體狀態(tài)下檢測基因突變,比較不同組織(包括生殖腺)的突變率,確定靶器官,對誘發(fā)的遺傳改變作精確分析等。國外已陸續(xù)發(fā)展了多種用于突變檢測的轉(zhuǎn)基因動物,其中3種已投入商品化生產(chǎn),MutaTM小鼠、Big-BlueTM小鼠和Xenomouse小鼠,它們分別采用大腸桿菌乳糖操縱子的LacZ和/或Lacl作為誘變的靶基因。第93頁，共101頁，2023年，2