發(fā)酵工業(yè)菌種

發(fā)酵工業(yè)菌種第1頁，共47頁，2023年，2月20日，星期三本章內(nèi)容

一、常用的工業(yè)微生物二、發(fā)酵工業(yè)菌種篩選的原則與基本技術(shù)三、發(fā)酵工業(yè)菌種改良第2頁，共47頁，2023年，2月20日，星期三對產(chǎn)物進行菌種篩選時，有兩條經(jīng)驗：進化上向上兼容；次生代謝在進化上后移，芽孢菌以上才有篩選意義。一、常用的工業(yè)微生物第3頁，共47頁，2023年，2月20日，星期三細菌醋桿菌屬的醋化醋桿菌、弱氧化醋桿菌乳酸桿菌枯草桿菌丙酮丁醇梭菌大腸桿菌谷氨酸棒狀桿菌一、常用的工業(yè)微生物第4頁，共47頁，2023年，2月20日，星期三酵母菌釀酒酵母假絲酵母屬產(chǎn)朊假絲酵母解脂假絲酵母熱帶假絲酵母畢赤酵母屬、漢遜酵母屬第5頁，共47頁，2023年，2月20日，星期三霉菌曲霉屬米曲霉黑曲霉青霉屬青霉菌：點青霉、產(chǎn)黃青霉桔青霉根霉屬德氏根霉米根霉、小麥曲根霉紅曲霉屬紫紅曲霉第6頁，共47頁，2023年，2月20日，星期三放線菌鏈霉菌屬小單孢菌屬地中海諾卡氏菌米蘇里游動放線菌第7頁，共47頁，2023年，2月20日，星期三

未培養(yǎng)微生物定義：指迄今所采用的微生物純培養(yǎng)分離及培養(yǎng)方法還未獲得純培養(yǎng)的微生物，其在自然環(huán)境微生物群落中占有非常高的比例，約為99％。研究方法模擬自然培養(yǎng)法:

原位培養(yǎng)、培養(yǎng)條件優(yōu)化、單細胞操作宏基因組分析法第8頁，共47頁，2023年，2月20日，星期三二、發(fā)酵工業(yè)菌種分離篩選原則與基本技術(shù)（一）發(fā)酵工業(yè)菌種篩選的總趨勢與要求（二）分離篩選原理與技術(shù)（三）應(yīng)用舉例第9頁，共47頁，2023年，2月20日，星期三1.菌種選擇的總趨勢野生菌→變異菌自然選育→代謝控制育種誘發(fā)基因突變→基因重組的定向育種

（一）發(fā)酵工業(yè)菌種篩選的總趨勢與要求第10頁，共47頁，2023年，2月20日，星期三

2.菌種選擇的要求

能在廉價原料制成的培養(yǎng)基上迅速生長，且生成的目的產(chǎn)物產(chǎn)量高、易于回收；

生長速度和反應(yīng)速度較快，發(fā)酵周期較短；培養(yǎng)條件易于控制；抗噬菌體及雜菌污染的能力強；第11頁，共47頁，2023年，2月20日，星期三2.菌種選擇的要求（續(xù)）菌種不易變異退化；對放大設(shè)備的適應(yīng)性強；菌種不是病原菌，不產(chǎn)生任何有害的生物活性物質(zhì)和毒素。第12頁，共47頁，2023年，2月20日，星期三（二）分離篩選原理與技術(shù)1.篩選的指導(dǎo)思想2.分離篩選工作在實際中應(yīng)用的幾個方面3.

新種分離篩選原理與技術(shù)第13頁，共47頁，2023年，2月20日，星期三1.篩選的兩種指導(dǎo)思想

先分離純化，再結(jié)合工藝要求進行篩選。分離純化同時富于篩選條件，一步得出所需菌株。結(jié)果有兩種可能：獲得適于工業(yè)發(fā)酵菌株只獲得選育所需的出發(fā)菌株

第14頁，共47頁，2023年，2月20日，星期三2.分離篩選工作在實際中應(yīng)用的幾個方面從被污染的生產(chǎn)及科研用菌中分離目的菌；

生產(chǎn)中長期使用的菌種的定期分離篩選；從各種育種方法處理的微生物材料中分離篩選適于工業(yè)目的的優(yōu)良菌株；從已知菌種和大自然中分離新菌株尋找新的發(fā)酵產(chǎn)品的產(chǎn)生菌；尋找老產(chǎn)品的新的優(yōu)良菌株。從保藏機構(gòu)獲取菌種進行分離篩選有兩個好處：經(jīng)濟性指導(dǎo)性第15頁，共47頁，2023年，2月20日，星期三設(shè)計篩選方案時必須考慮兩個要點

選擇性靈敏度

第16頁，共47頁，2023年，2月20日，星期三3.新種分離與篩選的步驟

調(diào)查研究（包括資料查閱）

試驗方案設(shè)計

含微生物樣品的采集（如何使樣品中含所需微生物的可能性大？）

樣品預(yù)處理（如何在后續(xù)的操作中使這種可能性實現(xiàn)）

菌種分離

第17頁，共47頁，2023年，2月20日，星期三

根據(jù)目的菌株及其產(chǎn)物特點分

選擇性分離方法 隨機分離方法

(定向篩選←選擇壓力)

(用篩選方案-檢測系統(tǒng)進行間接分離）

富集液體培養(yǎng)固體培養(yǎng)基條件培養(yǎng)

(初篩)

菌種純化

復(fù)篩

菌種分離第18頁，共47頁，2023年，2月20日，星期三

菌種純化初步工藝條件摸索再復(fù)篩生產(chǎn)性能測試較優(yōu)菌株1-3株保藏及進一步做生產(chǎn)試驗?zāi)承┍匾囼灪突蜃鳛橛N的出發(fā)菌株毒性試驗等

第19頁，共47頁，2023年，2月20日，星期三含微生物樣品的采集采樣時應(yīng)注意的問題:土壤微生物的分布采土深度土壤植被情況采樣季節(jié)土壤的酸堿度對于分離篩選新菌種，還存在另兩個選擇標準：土壤來源廣泛在已適應(yīng)相當(dāng)苛刻環(huán)境壓力的微生物類群中尋找新菌種第20頁，共47頁，2023年，2月20日，星期三樣品的預(yù)處理目的：提高分離效率方法：物理方法：熱處理；膜過濾法；離心法化學(xué)方法誘餌法第21頁，共47頁，2023年，2月20日，星期三分離方法的選擇

根據(jù)目的菌有無選擇性特征來選擇分離方法菌種的營養(yǎng)特征獨特

生長特征獨特

無選擇性特征根據(jù)產(chǎn)物的特征進行隨機分離選擇性分離的關(guān)鍵：生長培養(yǎng)條件的選擇與控制，從而實現(xiàn)定向富集篩選。選擇性分離

第22頁，共47頁，2023年，2月20日，星期三

選擇性分離原理和技術(shù)生長條件的選擇與控制原理控制營養(yǎng)成分

控制培養(yǎng)基酸堿度

添加抑制劑

控制培養(yǎng)溫度

控制通氣條件

選擇性分離技術(shù)富集液體培養(yǎng)技術(shù)固體培養(yǎng)技術(shù)施加選擇壓力，進行定向篩選

第23頁，共47頁，2023年，2月20日，星期三A.富集液體培養(yǎng)增加混合菌群中所需菌株數(shù)量的一種技術(shù)技術(shù)特點：給混合菌群提供一些有利于目的菌株生長或不利于目的菌以外的其他菌型生長的條件培養(yǎng)方式分批培養(yǎng)方式：以最大比生長速率（μmax）篩選，存在選擇壓力的控制、移種時間和次數(shù)等問題連續(xù)培養(yǎng)方式：以比生長速率（μ）篩選第24頁，共47頁，2023年，2月20日，星期三

μ

ABS0基質(zhì)濃度對A、B兩種菌的比生長速率（μ）的影響

當(dāng)S<S0時，富集什么菌株？當(dāng)S>S0時，富集什么菌株？第25頁，共47頁，2023年，2月20日，星期三連續(xù)富集培養(yǎng)技術(shù)分離菌株的優(yōu)點

分離的菌株特別適合連續(xù)發(fā)酵生產(chǎn)過程有利于分離具有某種工業(yè)生產(chǎn)特性的菌株可以篩選出能共生的穩(wěn)定混合培養(yǎng)物

第26頁，共47頁，2023年，2月20日，星期三B.固體培養(yǎng)技術(shù)常用于分離某些酶產(chǎn)生菌

選擇壓力：在選擇培養(yǎng)基中加入所需酶的基質(zhì)

第27頁，共47頁，2023年，2月20日，星期三隨機分離原理與技術(shù)從產(chǎn)物入手，通過設(shè)計高產(chǎn)培養(yǎng)基和建立快速靈敏專一的篩選方法，從隨機分離的菌落中篩選出所需的目的菌。技術(shù)關(guān)鍵：產(chǎn)物合成條件的選擇與控制及相應(yīng)篩選方法的確定。隨機分離技術(shù)舉例

抗生素產(chǎn)生菌的篩選藥理活性化合物產(chǎn)生菌的篩選生長因子產(chǎn)生菌的篩選多糖產(chǎn)生菌的篩選

第28頁，共47頁，2023年，2月20日，星期三高產(chǎn)培養(yǎng)基設(shè)計的幾個原則

制備一系列的培養(yǎng)基，其中有各種類型的養(yǎng)分成為生長限制因素；使用一聚合或復(fù)合形式的生長限制養(yǎng)分；避免使用容易同化的碳源或氮源，防止分解代謝物阻遏；確定含有所需的輔因子（Co2+,Mg2+,Mn2+,Fe2+）；使用pH緩沖劑以減少pH變化；前體、促進劑及抑制劑的采用。第29頁，共47頁，2023年，2月20日，星期三抗生素產(chǎn)生菌的篩選篩選模型：試驗菌篩選方法：鋪菌法復(fù)印平板法液體培養(yǎng)篩選

抗藥性篩選篩選模型：氨芐青霉素和β-內(nèi)酰胺酶產(chǎn)生菌（克雷白氏菌）協(xié)同

I II無試樣時（不含棒酸時），I對II菌作用不大有試樣時（含棒酸時），I對II菌恢復(fù)藥效，棒酸抑制水解酶活性

固體培養(yǎng)篩選第30頁，共47頁，2023年，2月20日，星期三試驗菌代表微生物類型金黃色葡萄球菌209p革蘭氏陽性球菌枯草桿菌6633 革蘭氏陽性桿菌 大腸桿菌革蘭氏陰性腸道細菌恥垢分枝桿菌607

結(jié)核桿菌 白色念珠菌 酵母狀真菌 青霉菌

絲狀真菌

第31頁，共47頁，2023年，2月20日，星期三藥理活性化合物產(chǎn)生菌的篩選

藥理活性化合物是指能抑制人類代謝中某一個關(guān)鍵酶的微生物產(chǎn)物即酶抑制劑，從而達到治療的目的。篩選模型：目標酶第32頁，共47頁，2023年，2月20日，星期三生長因子產(chǎn)生菌的篩選

篩選模型：營養(yǎng)缺陷型試驗菌

篩選方法：利用被分離的微生物產(chǎn)物能否促進營養(yǎng)缺陷型試驗菌生長第33頁，共47頁，2023年，2月20日，星期三氨基酸產(chǎn)生菌的篩選

樣品

預(yù)處理

初篩（除真菌）

在分離平板上生長獲得多個單菌落復(fù)印平板（copy法）

平板培養(yǎng)，其中有產(chǎn)生氨基酸的菌落分泌氨基酸對應(yīng)到copy前相應(yīng)

u.v線殺死長好的菌落位置，找到目的菌落

再鋪上一層含營養(yǎng)缺陷型試驗菌的瓊脂

培養(yǎng)后

產(chǎn)氨基酸菌落周圍有生長圈

目的菌落進行液體培養(yǎng)，對產(chǎn)物進行定量測定篩選產(chǎn)物含量高的菌株第34頁，共47頁，2023年，2月20日，星期三多糖產(chǎn)生菌的篩選取樣特點：碳水化合物工業(yè)的廢棄物篩選方案：從菌落外觀判斷，選擇外觀呈粘液狀的菌落，然后根據(jù)液體培養(yǎng)測定多糖含量來篩選高產(chǎn)菌。第35頁，共47頁，2023年，2月20日，星期三細菌分離：以乳酸菌為例

取未成熟的醬醪樣品1g至無菌磨口瓶中

加麥芽汁至瓶口處，封塞，25℃培養(yǎng)24-48h培養(yǎng)基中長出絹絲狀波動物，鏡檢桿狀，陽性染色初步斷定乳酸菌

用選擇性培養(yǎng)基分批富集培養(yǎng)2-3代稀釋分離法分離單菌落，培養(yǎng)基為含麥芽汁、CaCO3的瓊脂培養(yǎng)基

根據(jù)透明圈挑選菌落

性能測定（鏡檢桿狀，染色陽性；乳酸紙層析鑒定）

Rf值定性（有機酸呈黃斑點）

乳酸生成量測定（滴定法）第36頁，共47頁，2023年，2月20日，星期三放線菌的分離：

以產(chǎn)鏈霉素菌種的分離為例

（從退化菌種中篩選）

取工業(yè)發(fā)酵液（含孢子）樣品1環(huán)放入帶玻璃珠的裝有10ml無菌水的小三角瓶中，搖勻

采用稀釋法制平板，獲取單菌落

斜面保藏高產(chǎn)菌恢復(fù)根據(jù)高產(chǎn)菌的特點，選擇目的菌落放大培養(yǎng)，發(fā)酵液性能測試篩選模型：形態(tài)依據(jù)第37頁，共47頁，2023年，2月20日，星期三真菌的分離篩選：以啤酒酵母為例

取發(fā)酵液少許以10倍稀釋成10-1-10-7

稀釋分離法取0.1ml加入固體培養(yǎng)基鋪平皿（×2）

在麥芽汁固體培養(yǎng)基上，25℃培養(yǎng)48-72h

形態(tài)篩選根據(jù)正常株特點進行挑選，接種斜面?zhèn)溆?/p>

純化，采用平板分離法進一步純化，至少反復(fù)三次

①生成子囊孢子速度測定 ②發(fā)酵力測定性能測定③熱死溫度測定 ④凝集力測定 ⑤雙乙酰含量測定第38頁，共47頁，2023年，2月20日，星期三菌種選育改良的具體目標提高目標產(chǎn)物的產(chǎn)量提高目標產(chǎn)物的純度，減少副產(chǎn)物改良菌種性狀，改善發(fā)酵過程改變生物合成途徑，以獲得高產(chǎn)的新產(chǎn)品第39頁，共47頁，2023年，2月20日，星期三

發(fā)酵工業(yè)菌種改良方法常規(guī)育種(誘變育種)細胞工程育種基于代謝調(diào)節(jié)的育種技術(shù)基因工程育種蛋白質(zhì)工程育種代謝工程育種

第40頁，共47頁，2023年，2月20日，星期三賴氨酸生產(chǎn)菌種的選育改良思路出發(fā)菌株：黃色短桿菌、谷氨酸棒桿菌、乳糖發(fā)酵短桿菌育種思路

1.優(yōu)先合成的轉(zhuǎn)換——滲漏缺陷型的選育

2.切斷支路代謝——營養(yǎng)缺陷型的選育：高絲氨酸缺陷型

3.抗結(jié)構(gòu)類似物突變株的選育

4.解除代謝互鎖：Leu-、

抗Leu結(jié)構(gòu)類似物、喹啉s

、苯醌s5.增加前體物的合成和阻塞副產(chǎn)物的生成

6.改善細胞膜的透過機能

7.選育溫度敏感突變株

8.應(yīng)用細胞工程和基因工程育種第41頁，共47頁，2023年，2月20日，星期三第42頁，共47頁，2023年，2月20日，星期三選育適宜的CO2固定酶/TCA循環(huán)酶活性比突變株賴氨酸合成中間代謝有以下兩條途徑：①通過TCA循環(huán)葡萄糖丙酮酸草酰乙酸天冬氨酸

賴氨酸②通過磷酸烯醇丙酮酸羧化反應(yīng)葡萄糖磷酸烯醇草酰乙酸天冬氨酸式丙酮酸丙酮酸賴氨酸第43頁，共47頁，2023年，2月20日，星期三

代謝工程的定義利用多基因重組技術(shù)有目的地對細胞代謝途徑進行修飾、改造，改變細胞特性，并與細胞基因調(diào)控、代謝調(diào)控及生化工程相結(jié)合，為實現(xiàn)構(gòu)建新的代謝途徑，生產(chǎn)特定目的產(chǎn)物而發(fā)展起來的一個新的學(xué)科領(lǐng)域。又稱作途徑工