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文檔簡介

基因工程實(shí)驗(yàn)第1頁,共41頁,2023年,2月20日,星期四基因工程實(shí)驗(yàn)周景文江南大學(xué)生物系統(tǒng)與生物加工研究室05April2023第2頁,共41頁,2023年,2月20日,星期四概述PCRDNA/RNA的凝膠電泳質(zhì)粒提取基因組提取常用工具酶怎樣把一個(gè)基因連接到質(zhì)粒上?怎樣把幾個(gè)片段連接到一起?基因敲除過量表達(dá)質(zhì)粒的結(jié)構(gòu)常用軟件常用網(wǎng)址常用供應(yīng)商第3頁,共41頁,2023年,2月20日,星期四1.PCR酶的選擇:普通的DNA聚合酶:Taq

末端有A尾,可以直接用于TA克隆,連接到T載體上;高保真的DNA聚合酶:Pfu(Pyrobest)

末端無A尾,無法直接連接至T載體上。反應(yīng)條件的選擇:Mg2+:過低反應(yīng)無法進(jìn)行,過高易產(chǎn)生錯(cuò)配;Mn2+:使錯(cuò)配率增加,用于易錯(cuò)PCR,進(jìn)行定向進(jìn)化。第4頁,共41頁,2023年,2月20日,星期四特殊的PCR:融合PCR(與SOE-PCR原理一致):見文獻(xiàn):Shevchuk,N.A.,A.V.Bryksin,etal.(2004)."ConstructionoflongDNAmoleculesusinglongPCR-basedfusionofseveralfragmentssimultaneously."NucleicAcidsRes

32(2):12.Szewczyk,E.,T.Nayak,etal.(2006)."FusionPCRandgenetargetinginAspergillusnidulans."Nat.Protoc.

1(6):3111-3120.2.巢式PCR

目前已經(jīng)較少用到。3.易錯(cuò)PCR(Error-PronePCR)

用于隨機(jī)突變。通過控制Mg2+和Mn2+的濃度實(shí)現(xiàn)。第5頁,共41頁,2023年,2月20日,星期四2.DNA/RNA凝膠電泳電泳基質(zhì)主要分為瓊脂糖和聚丙烯酰胺兩類平常我們主要用瓊脂糖凝膠電泳瓊脂糖濃度的選擇一般按下表,1%的瓊脂糖最為常用,可以分離分子生物學(xué)操作中常見的片段大小。瓊脂糖濃度/%2.0線狀DNA大小/kb60~520~110~0.87~0.56~0.44~0.23~0.1瓊脂糖濃度與DNA分離范圍Marker的大小應(yīng)根據(jù)預(yù)計(jì)片段的大小進(jìn)行選擇質(zhì)?;蚱渌h(huán)狀DNA的大小不能根據(jù)Marker進(jìn)行判斷!第6頁,共41頁,2023年,2月20日,星期四3.質(zhì)粒提取細(xì)菌:堿裂解法;試劑盒;破壁一般采用溶菌酶(Lysozyme)。酵母酶破壁+堿裂解法;試劑盒;破壁一般采用Lyticase(有的公司稱為Zymolyase)或玻璃珠法;后續(xù)步驟基本相同。第7頁,共41頁,2023年,2月20日,星期四4.基因組提取細(xì)菌:試劑盒;破壁一般采用溶菌酶(Lysozyme)。酵母試劑盒;破壁一般采用Lyticase(有的公司稱為Zymolyase)或玻璃珠法;后續(xù)步驟基本相同。第8頁,共41頁,2023年,2月20日,星期四5.常用工具酶基因工程中常用到的工具酶包括:Lysozyme/溶菌酶:用于酵母和植物破壁用的裂解酶;Lyticase:用于酵母和植物破壁用的裂解酶;RNA酶:用于降解提取DNA中的RNA;DNA酶(DNA外切酶):用于去除RNA或蛋白質(zhì)樣品中的DNA;DNA聚合酶:用于PCR,常用Taq和Pfu;反轉(zhuǎn)錄酶:用于從mRNA反轉(zhuǎn)錄得到cDNA;各種限制性內(nèi)切酶;連接酶;堿性磷酸酶:用于連接前處理,常用CIAP(小牛腸堿性磷酸酶);共性:除RNA酶和Taq/Pfu之外,基本上都對(duì)熱不穩(wěn)定,需要在-20C保存,使用時(shí)也需要盡量放置冰上!第9頁,共41頁,2023年,2月20日,星期四5.1限制性內(nèi)切酶定義:限制性核酸內(nèi)切酶(restrictionendonuclease):識(shí)別并切割特異的雙鏈DNA序列的一種內(nèi)切核酸酶。[單位定義]:在指明pH與37℃,在0.05mL反應(yīng)混合物中,1小時(shí)消化1μg的λDNA的酶量為1單位。詳見:/view/48578.htm最常用的內(nèi)切酶:BamHI、EcoRI和HindIII價(jià)格最便宜,最容易切開,最容易連上!如果有可能,盡可能優(yōu)先考慮這3種內(nèi)切酶。第10頁,共41頁,2023年,2月20日,星期四5.2連接酶定義:又稱合成酶,能催化兩個(gè)分子連接成一個(gè)分子或把一個(gè)分子的首尾相連接的酶。此反應(yīng)與ATP的分解反應(yīng)相偶聯(lián)。在把兩分子相連接的同時(shí)發(fā)生三磷酸腺苷(ATP)的高能磷酸鍵的斷裂如DNA連接酶等。在基因操作中,特指能將兩個(gè)片段通過粘性末端或平末端連接起來的一類酶。通常用于將DNA片段連接到質(zhì)粒上。目前主要用的是一種來源于T4噬菌體的連接酶,通常稱為“T4DNA連接酶”。第11頁,共41頁,2023年,2月20日,星期四6.怎樣把一個(gè)基因連接到質(zhì)粒上?Taq,ExTaq,LA-Taq的PCR產(chǎn)物,直接連接至T載體上;各家公司對(duì)T載體的命名方式不一樣,需要仔細(xì)查看相關(guān)的說明文件。設(shè)計(jì)了酶切位點(diǎn)的PCR產(chǎn)物:單酶切后插入經(jīng)過相應(yīng)酶切后的載體上;

此處需要用堿性磷酸酶處理酶切后的載體,一般用CIAP;雙酶切后插入經(jīng)過相應(yīng)酶切后的載體上;

原則上需要用堿性磷酸酶處理酶切后的載體,但雙酶切中基本上忽略,但對(duì)于一些酶切效率較低的酶,最好處理載體;通過同源重組連接入載體:在PCR引物兩端設(shè)計(jì)與酶切后載體同源的序列(15-20bp),通過同源重組酶連接至載體上(Invitrogen稱為Topo克隆,Gateway克隆)。第12頁,共41頁,2023年,2月20日,星期四7.怎樣把幾個(gè)片段連接到一起?酶切連接:設(shè)計(jì)多個(gè)不同的酶切位點(diǎn),將相應(yīng)的PCR片段用酶切的方法一段一段的連入載體中,最后再用兩端的引物進(jìn)行PCR,得到最終所需的片段融合PCR/重疊延伸PCR片段兩端與需要連接的片段有15–20bp的同源序列;用高保真酶先得到待連接的片段;以等摩爾的待連接片段為模板,用兩端的引物進(jìn)行PCR,可以得到連接后的PCR片段。第13頁,共41頁,2023年,2月20日,星期四8.基因敲除目的:將一個(gè)基因替換為了一個(gè)標(biāo)記基因,或通過其它表型進(jìn)行篩選步驟:構(gòu)建敲除框轉(zhuǎn)化篩選鑒定第14頁,共41頁,2023年,2月20日,星期四8.1構(gòu)建敲除框酶切連接:將待敲除片段及兩端序列PCR后插入T載體中,選擇合適的酶切位點(diǎn),插入標(biāo)記基因;將待敲除片段的左端和右端及抗性基因分別進(jìn)行PCR,得到三段引物,用酶連法順序連接至載體中;融合PCR;將待敲除片段的左端和右端及抗性基因分別進(jìn)行PCR,得到三段引物,用酶連法順序連接至載體中;長引物PCR;在引物末端設(shè)計(jì)長的同源片段,擴(kuò)增得到標(biāo)記基因后,直接用于轉(zhuǎn)化。第15頁,共41頁,2023年,2月20日,星期四8.2轉(zhuǎn)化化學(xué)轉(zhuǎn)化法:原核微生物:氯化鈣法、Inoue法等;酵母:鋰鹽法。電轉(zhuǎn)化法:原核微生物:甘露醇法;酵母:山梨醇法;鋰鹽+DTT預(yù)處理+山梨醇法。基因槍法:將待轉(zhuǎn)化的核酸片段包被于金屬顆粒上,直接用于轉(zhuǎn)化。脂質(zhì)體法:用于動(dòng)植物細(xì)胞的轉(zhuǎn)化,偶爾用于酵母轉(zhuǎn)化。第16頁,共41頁,2023年,2月20日,星期四8.3篩選根據(jù)抗生素抗性:原核微生物:氨芐抗性、卡那抗性等;酵母:G418、Zeocin、博萊霉素等。根據(jù)營養(yǎng)缺陷型回復(fù):酵母:尿嘧啶、亮氨酸、腺嘌呤缺陷型回復(fù)。第17頁,共41頁,2023年,2月20日,星期四8.4鑒定提取基因組,進(jìn)行PCR驗(yàn)證;基因功能缺失的表型驗(yàn)證;Southern雜交;Northern雜交;Western雜交。第18頁,共41頁,2023年,2月20日,星期四基因敲除實(shí)例-以LEU2作為篩選標(biāo)記敲除釀酒酵母ACS2基因乙酰輔酶A(acetyl-CoA)是細(xì)胞內(nèi)重要的輔因子,參與微生物細(xì)胞眾多的生化反應(yīng)。細(xì)胞內(nèi)的乙酰輔酶A合成酶有兩個(gè)同工酶,分別由ACS1和ACS2編碼,在釀酒酵母中的主要合成途徑為丙酮酸脫氫酶支路。如下圖所示。第19頁,共41頁,2023年,2月20日,星期四2.將經(jīng)過PCR反應(yīng)所得的目標(biāo)片斷連接到T載體(藍(lán)白斑篩選)使用引物設(shè)計(jì)軟件PrimerPremier5.0

設(shè)計(jì)ACS2基因合成所需的PCR反應(yīng)的引物。ACS2-F:5’-GCgaattcATGACAATCAAGGAACATA-3’ACS2-R:5’-GCaagcttTTATTTCTTTTTTTGAGAGA-3’從NCBI上得到的ACS1/2基因序列第20頁,共41頁,2023年,2月20日,星期四3.使用引物設(shè)計(jì)軟件PrimerPremier5.0設(shè)計(jì)KlLEU2引物,并以pUG73作為模板進(jìn)行PCR反應(yīng)。(該引物兩端均帶有NcoI的酶切位點(diǎn)和若干保護(hù)堿基)4.使用NcoI限制性內(nèi)切酶分別處理步驟2,3所得的目標(biāo)產(chǎn)物,并進(jìn)行連接反應(yīng)。將KlLEU2片斷連接到T載體上。第21頁,共41頁,2023年,2月20日,星期四5.以連接后所得的T載體作為模板,ACS2-F,ACS2-R為引物進(jìn)行PCR反應(yīng),得到如下圖所示長片斷。6.將該長片斷電轉(zhuǎn)化至釀酒酵母中,用亮氨酸缺陷型回復(fù)作為標(biāo)記篩選陽性克隆子。7.將不含有亮氨酸的培養(yǎng)基上長出的單菌落提基因組進(jìn)行PCR(以ACS2-F,ACS2-R為引物)。進(jìn)一步驗(yàn)證排除假陽性。第22頁,共41頁,2023年,2月20日,星期四9.過量表達(dá)整合表達(dá)常見于畢赤酵母(Pichiapastoris)中,利用pPIC系列整合載體,將要表達(dá)的片段整合到染色體上;在釀酒酵母中,也可以利用YIP系列整合載體(載體名稱可能有所不同),將要表達(dá)的片段整合到染色體上特點(diǎn):整合的轉(zhuǎn)化子同源重組效率較低不易篩選,可能對(duì)基因組產(chǎn)生潛在的破壞作用,單拷貝,穩(wěn)定。質(zhì)粒載體表達(dá):用于各種真核和原核表達(dá)體系中,將待表達(dá)的片段置于合適的啟動(dòng)子和終止子之間,如果有必要的話,還需要加上適當(dāng)?shù)男盘?hào)肽序列(如分泌表達(dá),或定位于亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)內(nèi)時(shí)),連接到合適的表達(dá)載體中。再將整個(gè)載體轉(zhuǎn)入宿主細(xì)胞中。特點(diǎn):容易操作,高拷貝,無選擇壓力時(shí)不穩(wěn)定。第23頁,共41頁,2023年,2月20日,星期四基因過量表達(dá)實(shí)例-釀酒酵母ACS1/2基因的過量表達(dá)利用PrimerPremier5.0設(shè)計(jì)ACS1/2基因的引物,并添加圖上所示的酶切為點(diǎn),經(jīng)過PCR,酶切,連接,轉(zhuǎn)化后得到表達(dá)載體第24頁,共41頁,2023年,2月20日,星期四表達(dá)載體導(dǎo)入受體細(xì)胞進(jìn)行目標(biāo)基因的過量表達(dá)3D(ura)pY263D(ura)pY26-ACS13D(ura)pY26-ACS2經(jīng)過電擊或者化學(xué)轉(zhuǎn)化后,釀酒酵母在不含有URA3的平板上長出單菌落。第25頁,共41頁,2023年,2月20日,星期四隨著發(fā)酵的進(jìn)行細(xì)胞內(nèi)乙酰輔酶A含量的變化情況第26頁,共41頁,2023年,2月20日,星期四10.質(zhì)粒的結(jié)構(gòu)質(zhì)粒載體,通常分為兩類:克隆載體表達(dá)載體按在目標(biāo)菌株中的拷貝數(shù)分類:高拷貝質(zhì)粒載體——幾乎所有的克隆載體都是高拷貝的,易于提取和進(jìn)行后續(xù)基因操作,如:

pUC系列載體,pBlueScript系列載體,pY系列載體;低拷貝質(zhì)粒載體——為了防止拷貝數(shù)過高對(duì)宿主細(xì)菌產(chǎn)生不利影響,一般是表達(dá)載體,如:

pET系列載體,pRS系列載體。第27頁,共41頁,2023年,2月20日,星期四用于基因工程操作的質(zhì)粒一般具有以下特性:復(fù)制起點(diǎn)

如果是穿梭載體(Shuttlevector),還需要具有不同菌株的復(fù)制起點(diǎn),如酵母穿梭載體中的2m片段和相應(yīng)菌株的CEN-ARS片段??剐詷?biāo)記多克隆位點(diǎn)(MCS,Multi-CloningSite)為了表達(dá)位于其上的基因,一般還需要具有:合適的啟動(dòng)子合適的信號(hào)肽序列(可選)相應(yīng)的終止子為了便于對(duì)連接上的基因進(jìn)行鑒定,通常還有測序引物結(jié)合位點(diǎn):T7,M3……第28頁,共41頁,2023年,2月20日,星期四抗性基因抗性基因復(fù)制起點(diǎn)早期的pBR322載體,整個(gè)載體用酶連形成的第29頁,共41頁,2023年,2月20日,星期四多克隆位點(diǎn)(用于連接外源基因)復(fù)制起點(diǎn)基于pBR322的pUC19載體,可以用藍(lán)白斑篩選抗性基因用于藍(lán)白斑篩選的lacZ基因測序引物結(jié)合位點(diǎn)第30頁,共41頁,2023年,2月20日,星期四關(guān)于藍(lán)白斑篩選pUC19和其它pUC系列載體(包括Takara的T載體)上的lacZ基因經(jīng)過改造,引入了一系列酶切位點(diǎn)。當(dāng)酶切位點(diǎn)中未插入其它基因時(shí),加入半乳糖類似物IPTG后,lacZ基因開始表達(dá),并可以催化X-Gal,使菌落呈藍(lán)色;當(dāng)酶切位點(diǎn)插入其它基因時(shí),lacZ基因被破壞,菌落為白色。第31頁,共41頁,2023年,2月20日,星期四多克隆位點(diǎn)(用于連接外源基因)復(fù)制起點(diǎn)大腸桿菌中的表達(dá)載體pET-28a(+)抗性基因HisTag第32頁,共41頁,2023年,2月20日,星期四關(guān)于HisTagHisTag是一串編碼組氨酸的序列,使得表達(dá)的產(chǎn)物的末端帶有6個(gè)組氨酸,這6個(gè)組氨酸可以形成特定的構(gòu)向,可以用于:目標(biāo)蛋白的快速純化:可以用鎳柱進(jìn)行快速分離;簡單的Western雜交:可以與HisTag抗體進(jìn)行雜交,進(jìn)行快速的鑒定或定量。類似的還有Thrombin,HemagglutininTag等,常見于各種表達(dá)載體中,方便表達(dá)產(chǎn)物蛋白的純化。第33頁,共41頁,2023年,2月20日,星期四啟動(dòng)子氨芐抗性多克隆位點(diǎn)酵母中的篩選標(biāo)記2mum片段酵母中的復(fù)制起點(diǎn)終止子釀酒酵母中的表達(dá)載體pYX212第34頁,共41頁,2023年,2月20日,星期四大腸桿菌中常用的啟動(dòng)子組成型啟動(dòng)子:T7……一般是來源于噬菌體的強(qiáng)啟動(dòng)子,不需要誘導(dǎo)即可實(shí)現(xiàn)高效表達(dá)缺點(diǎn):無法實(shí)現(xiàn)可控表達(dá)誘導(dǎo)型啟動(dòng)子:lacZ……半乳糖或IPTG誘導(dǎo)缺點(diǎn):葡萄糖抑制,半乳糖和IPTG價(jià)格昂貴,無法用于實(shí)際生產(chǎn)和大規(guī)模的實(shí)驗(yàn)熱誘導(dǎo)啟動(dòng)子冷誘導(dǎo)啟動(dòng)子……第35頁,共41頁,2023年,2月20日,星期四酵母中常用的啟動(dòng)子組成型啟動(dòng)子:TPI,GPD,TEF,ACT……一般是各種中心代謝途徑中的酶或細(xì)胞骨架的啟動(dòng)子,不需要誘導(dǎo)即可實(shí)現(xiàn)高效表達(dá)缺點(diǎn):無法實(shí)現(xiàn)可控表達(dá)誘導(dǎo)型啟動(dòng)子:GAL1,GAL4,GAL10……半乳糖誘導(dǎo)缺點(diǎn):葡萄糖抑制,半乳糖價(jià)格昂貴,無法用于實(shí)際生產(chǎn)和大規(guī)模的實(shí)驗(yàn)METn系列啟動(dòng)子半胱氨酸抑制CUPn啟動(dòng)子銅誘導(dǎo)第36頁,共41頁,2023年,2月20日,星期四11.常用軟件VectorNTIAdvance11序列管理與質(zhì)粒作圖PrimerPremier5.0+Oligo6.71引物設(shè)計(jì)與質(zhì)量評(píng)估QuantityOne凝膠電泳圖像處理AdobeIllustratorCS4+AdobePhotoshopCS4電泳圖像后處理與示意圖以上軟件均須熟練掌握!第37頁,共41頁,2023年,2月20日,星期四12.常用網(wǎng)址NCBI

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