DB23T 3032-2021規(guī)?；膛雠０籽艋夹g(shù)規(guī)程

ICS11.220CCSB40黑DB23龍江省地方標(biāo)準(zhǔn)DBT1規(guī)?；膛雠０籽艋夹g(shù)規(guī)程2021-12-24發(fā)布2022-01-23實(shí)施黑龍江省市場監(jiān)督管理局發(fā)布ⅠDB23/T3038—2021前言本文件按照GB/T1.1-2020《標(biāo)準(zhǔn)化工作導(dǎo)則第1部分：標(biāo)準(zhǔn)化文件的結(jié)構(gòu)和起草規(guī)則》的規(guī)定起草。本文件的某些內(nèi)容可能涉及專利。本文件的發(fā)布機(jī)構(gòu)不承擔(dān)識別專利的責(zé)任。本文件由黑龍江省農(nóng)業(yè)農(nóng)村局歸口。本文件起草單位：黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)，東北農(nóng)業(yè)大學(xué)。本文件主要起草人：王建發(fā)、劉云、武瑞、連帥、賀顯晶、王爽、宋軍、孫東波、周玉龍、王海、胡學(xué)權(quán)、謝穎穎。1DB23/T3038—2021規(guī)模化奶牛場牛白血病凈化技術(shù)規(guī)程1范圍本文件規(guī)定了開展牛白血病凈化的技術(shù)規(guī)程。本文件適用于規(guī)?；膛鰧?shí)施針對牛白血病的凈化。2規(guī)范性引用文件下列文件中的內(nèi)容通過文中的規(guī)范性引用而構(gòu)成本文件必不可少的條款。其中，標(biāo)注日期的引用文件，僅該日期對應(yīng)的版本適用于本文件；不標(biāo)注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改單)適用于本文件。GB16568奶牛場衛(wèi)生規(guī)范NY/T574-2002地方流行性牛白血病瓊脂凝膠免疫擴(kuò)散試驗(yàn)方法中國動物疫病預(yù)防控制中心規(guī)?；膛鲋饕獎游镆卟艋夹g(shù)指南3術(shù)語和定義下列術(shù)語和定義適用于本文件。3.1牛白血病牛白血病是由牛白血病病毒引起的一種以淋巴細(xì)胞惡性增生，進(jìn)行性惡病質(zhì)變化和全身淋巴結(jié)腫大為特征的一種慢性、進(jìn)行性、接觸傳染性、腫瘤性疾病。3.2動物疫病凈化在一個養(yǎng)殖場或指定區(qū)域內(nèi)，通過持續(xù)監(jiān)測和檢測發(fā)現(xiàn)患病動物或帶毒動物，并通過淘汰帶毒動物以實(shí)現(xiàn)根除某種動物疫病的過程。4檢測規(guī)程4.1瓊脂凝膠免疫擴(kuò)散試驗(yàn)使用一次性無菌采血設(shè)備采集待檢牛只血液，分離血清。按照NY/T574-2002檢測血清中牛白血病病毒gp51抗原，檢測結(jié)果陽性即判定為牛白血病病毒感染陽性。4.2酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)無菌采集待檢牛只血液，分離血清或血漿。使用符合要求的商品化試劑盒按說明檢測血清或血漿中牛白血病病毒gp51抗原或牛白血病病毒X2抗體，檢測結(jié)果陽性即判定為牛白血病病毒感染陽性。無菌采集待檢泌乳牛乳汁，使用符合要求的商品化試劑盒按說明檢測乳汁中牛白血病病毒抗體，檢測結(jié)果陽性即判定為牛白血病病毒感染陽性。4.3基因擴(kuò)增試驗(yàn)使用一次性無菌采血設(shè)備采集待檢牛只抗凝血，使用商品化全血基因組DNA提取試劑盒按說明提取全血中的DNA。核酸檢測操作參照附錄A執(zhí)行，被檢測樣品PCR擴(kuò)增產(chǎn)物基因序列與牛白血病病毒囊膜基因序列同源性在95%以上，判定為牛白血病病毒感染陽性。2DB23/T3038—20215檢測后處理經(jīng)檢測為牛白血病病毒感染陽性牛不再進(jìn)行飼養(yǎng)，淘汰陽性牛后，使用次氯酸鈉、甲醛、戊二醛等敏感消毒劑對牧場進(jìn)行消毒，清除運(yùn)動場、牛舍、奶廳、器械、空氣中潛在的病毒風(fēng)險(xiǎn)。按照GB16548嚴(yán)格執(zhí)行衛(wèi)生防疫制度，在奶牛保健、治療、護(hù)理時(shí)，避免交叉感染。6持續(xù)檢測與凈化啟動凈化程序后，采取檢測、淘汰、消毒相結(jié)合的凈化措施對奶牛場牛白血病進(jìn)行持續(xù)凈化。每年進(jìn)行兩次全群檢測，發(fā)現(xiàn)陽性牛的處置方式同5。7凈化標(biāo)準(zhǔn)與維持按照《規(guī)?；膛鲋饕獎游镆卟艋夹g(shù)指南》采樣數(shù)量要求采集奶牛血液，連續(xù)2年牛白血病檢測個體陽性率小于0.1%可列為假定陰性群。假定陰性群無需再進(jìn)行全群檢測，轉(zhuǎn)為按照不低于10%的比例進(jìn)行抽樣檢測，如抽樣檢測不符合個體陽性率小于0.1%要求，則按照4~6推薦的凈化程序重新實(shí)施凈化。3DB23/T3038—2021附錄A(規(guī)范性附錄)電泳法檢測牛白血病病毒囊膜基因核酸操作規(guī)范A.1引物序列上游引物序列為5’-CAACCGATCATCAGATGGGTAAG-3’，下游引物序列為5’-CAGGGAGCATCTCCAAGTCTG-3’。A.2核酸擴(kuò)增反應(yīng)體系25μL核酸擴(kuò)增反應(yīng)體系如下：雙蒸水18.3μL，待測DNA樣品1.0μL，上游引物0.5μL，下游引L.5μL，2.5mmol/LdNTPs2.0μL，耐熱DNA聚合酶0.2μL。A.3核酸擴(kuò)增反應(yīng)條件A.4電泳檢測制備2.5%瓊脂糖凝膠板。在電泳槽中加入電泳緩沖液，使液面剛剛沒過凝膠。取5.0μL擴(kuò)增產(chǎn)物分別和適量加樣緩沖液混合后，加到凝膠孔。110V恒壓電泳30min，使用