酶的化學(xué)修飾前理論后例子課件

第六章酶蛋白的化學(xué)修飾1、概念凡通過化學(xué)基團(tuán)的引入或除去而使蛋白質(zhì)（酶）共價(jià)結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，從而改變蛋白質(zhì)（酶）的某些特性和功能的過程都可稱蛋白質(zhì)（酶）的化學(xué)修飾。一、酶的化學(xué)修飾2、酶的化學(xué)修飾的目的和意義①目的：構(gòu)象優(yōu)化、結(jié)構(gòu)穩(wěn)固1．穩(wěn)定性不夠，不能適應(yīng)大量生產(chǎn)的需要。2．作用的最適條件不符。3．酶的主要?jiǎng)恿W(xué)性質(zhì)的不適應(yīng)。4．臨床應(yīng)用的特殊要求。②意義：A.天然酶的活性維持存在缺陷；（如：異體蛋白的抗原性、易受蛋白酶水解、抑制劑抑制、活性半衰期短）（1）分子生物學(xué)水平，即用基因工程方法對(duì)DNA或RNA進(jìn)行分子改造，以獲得化學(xué)結(jié)構(gòu)更為合理的酶蛋白（蛋白質(zhì)工程）。（2）對(duì)天然酶分子進(jìn)行改造，這包括一級(jí)結(jié)構(gòu)中氨基酸置換、肽鏈切割、氨基酸側(cè)鏈修飾等（選擇性化學(xué)修飾）。

3、酶修飾途徑1．如何增強(qiáng)酶天然構(gòu)象的穩(wěn)定性與耐熱性2．如何保護(hù)酶活性部位與抗抑制劑3．如何維持酶功能結(jié)構(gòu)的完整性與抗蛋白水解酶4．如何消除酶的抗原性及穩(wěn)定酶的微環(huán)境三．酶化學(xué)修飾的基本原理（1）酶分子的表面修飾：1）化學(xué)固定：酶與惰性載體共價(jià)固定（即共價(jià)固定化酶）；四、酶蛋白修飾的方法3）大分子修飾非共價(jià)修飾:與大分子物質(zhì)非共價(jià)結(jié)合，增加酶的穩(wěn)定性;共價(jià)修飾:用可溶性大分子共價(jià)連接于酶分子表面，形成覆蓋層.4）分子內(nèi)交聯(lián)：增加酶分子表面基團(tuán)相互交聯(lián)，穩(wěn)定酶分子；5）分子間交聯(lián)：用雙功能或多功能試劑使不同的酶交聯(lián)起來產(chǎn)生雜化酶7）反相膠團(tuán)微囊化：在非極性有機(jī)溶劑中加表面活性劑與酶形成含水分子的反相膠團(tuán)，酶分配在團(tuán)內(nèi)的水性環(huán)境中，使酶與有機(jī)相分開，避免酶變性。1）非催化活性基團(tuán)的修飾：如金屬離子置換修飾，可改變酶動(dòng)力學(xué)性質(zhì)和酶親和能力；2）酶蛋白主鏈修飾：有限水解修飾；3）催化活性基團(tuán)修飾：選擇性修飾側(cè)鏈成分來實(shí)現(xiàn)氨基酸的取代，即化學(xué)突變法；4）肽鏈伸展后的修飾：為了有效處理酶分子內(nèi)部區(qū)域，先用脲、鹽酸胍處理酶，使酶鏈充分伸展，修飾后再折疊成具有某種活性的構(gòu)象；（2）酶分子內(nèi)部修飾①酶蛋白質(zhì)功能基團(tuán)的可反應(yīng)性；②修飾劑的可反應(yīng)性。

SH-CH2-CH2OH二、化學(xué)修飾的機(jī)理2、蛋白質(zhì)局部微區(qū)性質(zhì)的影響功能基的反應(yīng)性是通過它的親核性來顯示的，而親核性又常常與它的酸堿性有關(guān)，即與基團(tuán)的pK有影響。微區(qū)的極性是決定基團(tuán)解離狀態(tài)的關(guān)鍵因素之一。如：乙酸在水中的pK為4．76，在80％乙醇中增至6．87，在100％乙醇中增至10．32。乙酸羧基所處微區(qū)的極性直接與介質(zhì)的介電常數(shù)有關(guān)。隨介質(zhì)極性降低，羧基的pK升高。（1）微區(qū)的極性卵清溶菌酶中第35號(hào)谷氨酸的-C00H在25℃時(shí)的pK為5.9，而當(dāng)溶菌酶與其抑制劑三-N-乙酰氨基葡萄糖結(jié)合后，此pK則升至6.4。pK的提高可能是由于這個(gè)殘基的微區(qū)極性降低之故?！?5

天然蛋白質(zhì)通過氫鍵來維持其穩(wěn)定性，也是使pK發(fā)生改變的一個(gè)因素。例如，2-氟酚的pK比2-溴酚的pK高0.7。這是由于氟與酚基形成氫鍵的能力比溴強(qiáng)。水楊酸的羧基可與其酚基形成O--H…O氫鍵，結(jié)果使其羧基的pK比正常值小1，同時(shí)使酚基的正常pKl0改變到pKl3。（2）氫鍵效應(yīng)不同蛋白質(zhì)中的組氨酸殘基的pK是不同的。碳酸酐酶和葡萄球菌核酸酶各有4個(gè)組氨酸殘基。碳酸酐酶的pK是：5.91；6.04；7.00；7.23；葡萄球菌核酸酶的pK是：5.37；5.71；5.74；6．50。組氨酸殘基在這兩個(gè)蛋白質(zhì)中的pK范圍是5．37～7．23，pH幾乎相差2。這些變化可能是由于帶電基團(tuán)相互影響所致。（3）靜電效應(yīng)

處于蛋白質(zhì)表面的功能基比較容易與修飾劑反應(yīng)。如果烷基在空間上緊靠功能基，會(huì)使修飾劑不能與功能基接觸，這時(shí)就要出現(xiàn)位阻效應(yīng)。如：對(duì)枯草桿菌蛋白酶BKN的所有的10個(gè)酪氨酸殘基均在蛋白質(zhì)分子表面，而且其結(jié)構(gòu)上的苯酚的羥基幾乎在所有情況下都沒有形成氫鍵。但是，如果對(duì)它進(jìn)行徹底硝化和碘化后，10個(gè)酪氨酸中只有8個(gè)被修飾。（4）位阻效應(yīng)①改變蛋白質(zhì)功能基團(tuán)的pK值；②蛋白質(zhì)功能基團(tuán)具有較大的親核性；③通過靜電相互作用吸引試劑，并使其有適當(dāng)取向；④試劑與靠近修飾部位的蛋白質(zhì)區(qū)域之間的立體化學(xué)適應(yīng)性；超反應(yīng)性由一個(gè)或幾個(gè)因素的綜合作用而產(chǎn)生。影響超反應(yīng)性的因素：蛋白質(zhì)的構(gòu)象和表面特性對(duì)接近氨基酸側(cè)鏈功能基的修飾劑也產(chǎn)生有利或不利的影響。因而對(duì)修飾劑也提出了一定的要求。（三）修飾劑反應(yīng)性的決定因素3、位阻因素；蛋白質(zhì)表面的位阻因素或者底物、輔因子、抑制劑所產(chǎn)生的位阻因素都可能阻止修飾劑與功能基的正常反應(yīng)。4、催化因素；修飾部位附近的其他功能基，如果起一般的酸堿催化作用，也能影響修飾反應(yīng)。不同的修飾劑，其反應(yīng)速度和反應(yīng)部位有明顯差異。如對(duì)硝基苯乙酸鹽和苯乙酸鹽對(duì)胰凝乳蛋白酶的絲氨酸乙?；瘷C(jī)理相同，但后者反應(yīng)性差。5、局部環(huán)境的極性：許多有機(jī)反應(yīng)的速度與溶劑的極性有關(guān)，而有些反應(yīng)則與極性無關(guān)。情況比較復(fù)雜。1、了解酶的性質(zhì)

對(duì)酶的活性部位、酶的穩(wěn)定條件、酶反應(yīng)最適條件及酶的側(cè)鏈基團(tuán)等到的了解。三、設(shè)計(jì)酶化學(xué)修飾的要點(diǎn)2、選擇修飾劑的類型修飾劑的分子量、鏈的長度、對(duì)蛋白質(zhì)的吸附性；修飾劑上反應(yīng)基團(tuán)的數(shù)量和位置；修飾劑上反應(yīng)基團(tuán)的活化方法與條件。一般要求修飾劑具有較大分子量、良好的生物相容性和水溶性、修飾劑分子表面有較多的反應(yīng)活性基團(tuán)及修飾后酶活的半衰期較長。3、選擇修飾反應(yīng)的條件盡量少破壞酶活性功能的必需基團(tuán)。反應(yīng)體系中酶與修飾劑的分子比例；反應(yīng)體系的溶劑性質(zhì)、鹽濃度和pH條件；反應(yīng)溫度及時(shí)間。四、常用的化學(xué)修飾劑①糖及糖的衍生物：主要有右旋糖酐、右旋糖酐硫酸酯、糖肽、葡聚糖凝膠、聚乳糖等。②高分子多聚物：聚乙二醇(polyethyleneglycol，PEG)聚乙烯(polyvinylalcohol，PVA)聚N-乙烯吡咯烷酮(poly（N-vinylpyrrolidone，PVP)聚順丁烯二酸酐、聚丙烯酸(polyacrylicacid，PAA)。

③生物大分子：常用的有肝素、血漿蛋白質(zhì)、聚氨基酸類等。④雙功能試劑：主要有戊二醛、二異硫氰酸、二胺類等。⑤其他：常用的修飾劑還有某些固定化酶載體、糖基化試劑、甲基化試劑、乙基化試劑及某些小分子有機(jī)物等。酶的化學(xué)修飾基本原則：充分利用修飾劑所具有的各類化學(xué)基團(tuán)的特性，直接或經(jīng)過一定的活化過程與酶分子中的某些基團(tuán)或輔因子產(chǎn)生化學(xué)反應(yīng)，對(duì)酶分子結(jié)構(gòu)進(jìn)行改造。五、化學(xué)修飾的措施酶分子中的可解離基團(tuán)如氨基、羧基、羥基、巰基、咪唑基等，都是可以被修飾的基團(tuán)。1、修飾酶蛋白側(cè)鏈基團(tuán)

（1）對(duì)巰基的修飾：烷化劑：如碘乙酸、碘乙酰胺、巰基乙醇、谷胱甘肽等。E-SH+ICH2COOH（或ICH2CONH2）→E-S-CH2COOH（或E-S-CH2CONH2）+HI（2）對(duì)氨基的修飾乙酸酐修飾：E-NH2+CH3COOCOCH3→E-NHCOCH3+CH3COOH修飾酶蛋白側(cè)鏈基團(tuán)舉例（3）羧基的化學(xué)修飾ONR羰二亞胺反應(yīng)：∥∥E-COO-+R-N=C=NHR`→E-C–O-C-NR`（4）咪唑基的修飾反應(yīng)碘代反應(yīng)：E-咪唑基+ICH2COO-→E-咪唑基-CH2COO-+HI（5）吲哚基的化學(xué)修飾4-硝基苯硫氯反應(yīng)：E-吲哚基+CIS-苯環(huán)-NO2→E-吲哚基-S-苯環(huán)-NO2+HCL（6）二硫鍵的化學(xué)修飾2-巰基乙醇修飾：

SE+SH-CH2-CH2OH→SH-E-S-S-CH2-CH2OH

S酶蛋白側(cè)鏈經(jīng)修飾后，可以穩(wěn)定酶分子的催化活性，提高抗變性的能力。如超氧化物歧化酶(SOD)，作為藥物在體內(nèi)的半衰期僅為6～10min，影響其藥用效果。用聚乙二醇、右旋糖酐、聚蔗糖分別對(duì)SOD分子上的Lys的ε-NH2進(jìn)行修飾后，所得到的修飾酶在血液中的半衰期可從原來的6-10min增加到幾小時(shí)，甚至達(dá)35h；應(yīng)用某些雙功能交聯(lián)劑如戊二醛、聚乙二醇等可將酶蛋白分子之間、亞基之間或分子內(nèi)不同肽鏈部分進(jìn)行共價(jià)交聯(lián)。如：用聚乙二醇修飾后的過氧化氫酶，抗蛋白水解酶的能力有明顯增加而且抗原性消失。2、酶分子內(nèi)或分子間進(jìn)行交聯(lián)對(duì)于依賴輔因子的酶，可將輔因子共價(jià)結(jié)合在酶上或引入新的或修飾過的具有強(qiáng)反應(yīng)性的輔因子；如：對(duì)于金屬酶中的金屬離子可以采取置換的辦法來改變酶的專一性、穩(wěn)定性及其抑制作用。如羧肽酶A的活性部位中的鋅被鈷取代后，原有的酯酶活力和肽酶活力都增加；在淀粉酶中用鈣取代其他金屬離子也能使酶的穩(wěn)定性提高。

3、修飾酶的輔因子酶與某些蛋白質(zhì)、多糖等高分子化合物結(jié)合后，可以增加其穩(wěn)定性。如α-淀粉酶在65℃時(shí)的半衰期僅為25min，用右旋糖酐修飾后，其半衰期可增加到63min。

4、酶與大分子化合物相結(jié)合肽鏈的一部分水解后有利于活性中心與底物結(jié)合并形成準(zhǔn)確的催化部位。如用胰蛋白酶對(duì)天冬氨酸酶進(jìn)行有限水解切去10個(gè)氨基酸后，酶的活力提高了5.5倍。說明天然酶并不總是處于最佳構(gòu)象狀態(tài)。5、肽鏈的有限水解酶分子經(jīng)過化學(xué)修飾后，其特性在一定程度上發(fā)生改變，天然酶的一些不足之處可以得到改善。

六、修飾酶的特性1、熱穩(wěn)定性提高原因1

:修飾劑共價(jià)連接于酶分子后，使酶的天然構(gòu)象產(chǎn)生一定的“剛性”，不易伸展失活，并減少了酶分子內(nèi)部基團(tuán)的熱振動(dòng)，從而增加了熱穩(wěn)定性。這種熱穩(wěn)定性效果和修飾劑與酶之間的交聯(lián)點(diǎn)的數(shù)目有關(guān)。（PEG和酶以單點(diǎn)交聯(lián)時(shí)熱穩(wěn)定性提高并不明顯，通常交聯(lián)點(diǎn)增多，酶的熱穩(wěn)定性就可提高）原因2:修飾劑本身增加了酶分子的表面親水性，使酶分子在水溶液中形成新的氫鍵和鹽橋。如α-胰凝乳蛋白酶的表面氨基經(jīng)乙醛酸修飾，再還原成親水性更強(qiáng)的-NHCH2COOH后，在60℃時(shí)熱穩(wěn)定性提高了1000倍，這種穩(wěn)定的酶可用于醫(yī)藥和洗滌工業(yè)。2、抗各類失活因子能力提高

某些酶修飾后抗蛋白水解酶水解、抗抑制劑、抗酸、堿、有機(jī)溶劑等變性失活能力明顯提高。原因1：修飾劑所產(chǎn)生的空間屏蔽有效地阻擋了水解酶、抑制劑等失活因子的進(jìn)攻；原因2:酶分子中對(duì)蛋白水解酶等失活因子敏感的基團(tuán)被修飾，因此使得某些修飾酶的抗失活因子能力提高。如:過氧化氫酶經(jīng)PEG修飾后，抗胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶水解能力明顯提高；尿激酶經(jīng)白蛋白修飾后，抗胃蛋白酶水解和抗胎盤抑制劑能力也分別增加。原因：酶分子結(jié)構(gòu)上有一些氨基酸殘基組成了抗原決定簇，當(dāng)酶作為異源蛋白進(jìn)入機(jī)體后，就會(huì)誘發(fā)產(chǎn)生抗體，使酶失活；而化學(xué)修飾后，有些組成抗原決定簇的基團(tuán)與修飾劑形成了共價(jià)鍵，可能破壞了酶分子上抗原決定簇的結(jié)構(gòu)，降低抗原性。同時(shí)大分子修飾劑也同樣能“遮蓋”抗原決定簇和阻礙抗原、抗體產(chǎn)生結(jié)合反應(yīng)。如：β-葡萄糖苷酶用白蛋白修飾后抗原性消除；

L-天門冬酰胺酶用PEG修飾后也消除了抗原性。

而糖類物質(zhì)包括右旋糖酐也不容易消除酶的抗原性。

PEG、人血清白蛋白、聚丙氨酸在消除或降低酶抗原性上效果明顯。3、抗原性消除4、體內(nèi)半衰期延長許多酶經(jīng)過化學(xué)修飾后，由于增強(qiáng)了抗蛋白水解酶、抗抑制劑等失活因子的能力和熱穩(wěn)定性的提高，體內(nèi)半衰期比天然酶延長，這對(duì)提高藥用酶的療效很有意義。L-天門冬酰胺酶經(jīng)PEG修飾后，體內(nèi)半衰期延長13倍；白蛋白修飾的β-葡萄糖苷酶在體內(nèi)的半衰期延長18倍以上。

5、最適pH改變有些酶經(jīng)過化學(xué)修飾后，最適pH發(fā)生變化，這在生理和臨床應(yīng)用上以及工業(yè)生產(chǎn)中更好地發(fā)揮酶的催化作用具有重要意義。6、酶學(xué)性質(zhì)變化絕大多數(shù)酶經(jīng)過化學(xué)修飾后，最大反應(yīng)速度Vm沒有變化。但有些酶在修飾后，米氏常數(shù)Km值會(huì)增大?；瘜W(xué)修飾還可改變某些酶的底物專一性。如:脂肪酶經(jīng)過PEG修飾后，就可溶于有機(jī)溶劑,并能催化酯合成和酯交換等有機(jī)相反應(yīng)，這將擴(kuò)大酶在