引物設(shè)計(jì)的幾點(diǎn)重要原則

引物設(shè)計(jì)的幾點(diǎn)重要原則(總5頁(yè))--本頁(yè)僅作為文檔封面，使用時(shí)請(qǐng)直接刪除即可----2PCR11引物最好在模板cDNA的保守區(qū)內(nèi)設(shè)計(jì)。NCBI種的同一基因，通過(guò)序列分析軟件〔DNAman〕比對(duì)〔Alignment〕，各基因一樣的序列就是該基因的保守區(qū)。引物長(zhǎng)度一般在15~30堿基之間。18-27bp，38，由于過(guò)長(zhǎng)會(huì)導(dǎo)74℃，TaqDNAGC40%~60%之間，Tm72℃。GC〔composition〕GCTm〔meltingtemperature〕是寡核苷酸，50%寡核苷酸雙鏈解鏈的溫度。有效啟動(dòng)Tm5~10℃Tm=4〔G+C〕+2〔A+T〕估量引物的TmTm55~80℃，Tm72℃以使復(fù)性條件最正確。引物3′端要避開(kāi)密碼子的第3位。33易發(fā)生簡(jiǎn)并，會(huì)影響擴(kuò)增的特異性與效率。引物3′端不能選擇A，最好選擇T。3′端錯(cuò)配時(shí)，不同堿基引發(fā)效率存在著很大的差異，當(dāng)末位的堿基為A時(shí)，即使在錯(cuò)配的狀況下，也能有引發(fā)鏈的合成，而當(dāng)末位鏈為T(mén)時(shí)，錯(cuò)配的A、T3′端最好選擇T。堿基要隨機(jī)分布。引物序列在模板內(nèi)應(yīng)當(dāng)沒(méi)有相像性較高，尤其是3’端相像性較高的序列，否則簡(jiǎn)潔導(dǎo)致錯(cuò)誤引發(fā)〔Falsepriming〕。降低引物與模板相像性的一種方法GC發(fā)。引物自身及引物之間不應(yīng)存在互補(bǔ)序列。〔Hairpin〕使引物本身復(fù)性。這種二級(jí)構(gòu)造會(huì)因空間位阻而影響引物與模板的復(fù)性結(jié)合。引物43′端的互補(bǔ)重疊以防止引物二聚體〔DimerCrossdimer〕4△G〔應(yīng)小PCR不能正常進(jìn)展。引物5′端和中間△G值應(yīng)當(dāng)相對(duì)較高，而3′端△G值較低?！鱃DNA5′端和中間△G而3′端△G值較低〔確定值不超過(guò)9〕的引物。引物3′端的△G值過(guò)高，簡(jiǎn)潔DNA〔不同位置的△GOligo6〕引物的5′端可以修飾，而3′端不行修飾。引物的5′端打算著PCR產(chǎn)物的長(zhǎng)度，它對(duì)擴(kuò)增特異性影響不大。因此，可以5′端修飾包括：加酶切位點(diǎn)；標(biāo)記生物DNA變、缺失突變序列；引入啟動(dòng)子序列等。3′端也不能有形成任何二級(jí)構(gòu)造可能。擴(kuò)增產(chǎn)物的單鏈不能形成二級(jí)構(gòu)造。某些引物無(wú)效的主要緣由是擴(kuò)增產(chǎn)物單鏈二級(jí)構(gòu)造的影響，選擇擴(kuò)增片段時(shí)最好避開(kāi)二級(jí)構(gòu)造區(qū)域。用有關(guān)軟件〔RNAstructure〕可以推測(cè)估量mRNA〔△G°〕小于mol7-deaza-2′-脫氧GTPdGTP引物應(yīng)具有特異性。就可以進(jìn)展下一步的試驗(yàn)了。附：值得一提的是，各種模板的引物設(shè)計(jì)難度不一。有的模板本身?xiàng)l件比較困難，PCR，由于產(chǎn)物序列相對(duì)固定，引物設(shè)計(jì)的選擇自由度較低。在這種狀況只能退而求其次，盡量去滿(mǎn)足條件。PCR計(jì)上所要求的參數(shù)是不同的。引物設(shè)計(jì)的要求：G.2)Tm=58-603〕GC=30-80%.52GC.正向引物與探針離得越近越好，但不能重疊。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)度：引物的產(chǎn)物大小不要太大，一般在80-250bp之間都可；〔300bp〕。引物的退火溫度要高，一般要在60度以上；要特別留意避開(kāi)引物二聚體和非特異性擴(kuò)增的存在。DNADNAPRIMER3,PRIMER5,PRIMEREXPRESS做染料法最關(guān)鍵的就是查找到適宜的引物和做污染的預(yù)防工作。對(duì)于引物，你不簡(jiǎn)潔。BLAST有和其他物種或其他序列當(dāng)中存在一樣的序列，如和你的目標(biāo)序列之外的序列一樣的序列，則可能擴(kuò)出其他序列的產(chǎn)物，那么這個(gè)引物的特異性就很差，從而不能用。簡(jiǎn)介寡聚核苷酸引物的選擇，通常是整個(gè)擴(kuò)增反響成功的關(guān)鍵。所選的引物序列將Tm要物理參數(shù)。好的引物設(shè)計(jì)可以避開(kāi)背景和非特異產(chǎn)物的產(chǎn)生，甚至在RNA-PCR中也能識(shí)別cDNA或基因組模板。引物設(shè)計(jì)也極大的影響擴(kuò)增產(chǎn)量：假設(shè)使用設(shè)計(jì)粗糙的引物，產(chǎn)物將很少甚至沒(méi)有；而使用正確設(shè)計(jì)的引物得到的產(chǎn)物量可接近于反響指數(shù)期的產(chǎn)量理論值。固然，即使有了好的引物，照舊需要進(jìn)展Mg2+濃度，使用特別的共溶劑如二甲基亞砜、甲酰胺和甘油。PCR體“質(zhì)量”〔由用戶(hù)在程序參數(shù)中設(shè)定〕保證優(yōu)于通過(guò)人工導(dǎo)出的引物。別位點(diǎn)或5’端的各種修飾，這種對(duì)引物的修飾不會(huì)阻礙PCR反響，而會(huì)在以后使用擴(kuò)增子時(shí)發(fā)揮作用。根本PCR引物設(shè)計(jì)參數(shù)引物設(shè)計(jì)的目的是在兩個(gè)目標(biāo)間取得平衡：擴(kuò)增特異性和擴(kuò)增效率。特異性是指發(fā)生錯(cuò)誤引發(fā)的頻率。特異性不好或劣等的引物會(huì)產(chǎn)生額外無(wú)關(guān)和不想要的PCR中一對(duì)引物擴(kuò)增的產(chǎn)物與理論上成倍增長(zhǎng)量的接近程度。①引物長(zhǎng)度；PCRTm〔引物/模板雙鏈體的解鏈溫度〕幾度的范圍內(nèi)，1824核苷酸鏈?zhǔn)怯泻芎玫男蛄刑禺愋缘摹Ｒ镌介L(zhǎng)，擴(kuò)增退火時(shí)被引發(fā)的模板越54℃的最短的引物，可獲得最好的效率和特異性。總的來(lái)說(shuō)，最好在特異性允許的范圍內(nèi)尋求安全性。每增加一個(gè)核苷酸，引物18時(shí)使合成的寡核苷酸鏈〔18～24聚物〕適用于多種試驗(yàn)條件仍不失為明智之舉。②引物的二級(jí)構(gòu)造包括引物自身二聚體、發(fā)卡構(gòu)造、引物間二聚體等。這些因素會(huì)影響引物和模3’ΔGmol5’端的要求可適當(dāng)放寬。引物自身形成3’3’端對(duì)引物-模板結(jié)合影響更大；影響發(fā)卡構(gòu)造的穩(wěn)定性的因素除了堿基互補(bǔ)配對(duì)的鍵能之外，與莖環(huán)構(gòu)造形式亦有很大的關(guān)3’末端有發(fā)卡構(gòu)造的引物。GCTmPCRGC50％G+C20Tm56～62℃范圍內(nèi)，這可為有效退火供給足夠熱度。一對(duì)引物的GCTmTmTm也越大。假設(shè)承受太高的退火溫度，TmGC量和Tm值的協(xié)調(diào)格外關(guān)鍵。一般來(lái)說(shuō)，一對(duì)引物的Tm值相差盡量不超過(guò)2～3Tm，20T7RNAGC5’端添加無(wú)關(guān)序列不會(huì)影響引物特異序列的退火。有時(shí)候，引物中添455’端序列已經(jīng)參加到模板中，計(jì)算得出的退火溫度下進(jìn)展其余的循環(huán)。在引物上添加限制酶位點(diǎn)時(shí)一個(gè)重要的考慮是大多數(shù)限制5’23基，這樣就會(huì)增加引物的非模板特異序列的長(zhǎng)度。長(zhǎng)引物序列的另一個(gè)缺點(diǎn)是PCR20TmTm=4(G+C)+2(A+T)計(jì)算。而對(duì)于較Tm的PCR引物設(shè)計(jì)軟件大多數(shù)都承受這種方式。⑤引物的3’末端核苷酸組成引3’末端最終5到6個(gè)核苷酸的錯(cuò)配應(yīng)盡可能的少。假設(shè)3’末端的錯(cuò)配過(guò)多，通過(guò)降低反響的退火溫度來(lái)補(bǔ)償這種錯(cuò)配不會(huì)有什么效果，反響幾乎注定要失3’末端的另一個(gè)問(wèn)題是防止一對(duì)引物內(nèi)的同源性。應(yīng)特別留意引物3’末端。引物間的互補(bǔ)將導(dǎo)致不想要的引物雙鏈體的消滅PCR3’末端的穩(wěn)定性5ΔG。此值的大小對(duì)3’末端穩(wěn)定性高，擴(kuò)增效率更高，同時(shí)也更3’TTT,GC⑥PCRPCRPCR產(chǎn)物長(zhǎng)度對(duì)擴(kuò)增效率有影響。特定的應(yīng)用狀況下，PCR板材料。預(yù)期產(chǎn)物的特定長(zhǎng)度常常取決于應(yīng)用的需要。假設(shè)目的是建立測(cè)定特異DNA120～300bpDNA應(yīng)具有好的特異性和高的產(chǎn)生效率，并含有能用于探針捕獲雜交試驗(yàn)的足夠信息。這一長(zhǎng)度范圍的產(chǎn)物可以通過(guò)承受兩步擴(kuò)增循環(huán)方法得到，從而削減擴(kuò)增時(shí)間。其他PCR方法有不同的最正確產(chǎn)物長(zhǎng)度。例如，通過(guò)定量的RNA-PCR檢測(cè)基因表達(dá)時(shí)，產(chǎn)物應(yīng)當(dāng)足夠大以便構(gòu)成競(jìng)爭(zhēng)性模板，這樣，產(chǎn)物和競(jìng)爭(zhēng)物都能250～750bpmRNA3’末端非以便使RNA特異的PCR產(chǎn)物與從污染DNA中產(chǎn)生的產(chǎn)物在大小上相區(qū)分。假設(shè)PCR的目的是克隆一個(gè)基因或cDNA的特異序列，產(chǎn)物的大小是依據(jù)具體應(yīng)用預(yù)選的。在這里，計(jì)算機(jī)程序可以供給關(guān)于期望區(qū)域側(cè)翼選擇引物對(duì)的信息。在DNAmRNA5’3’末端非翻3．簡(jiǎn)并引物設(shè)計(jì)①設(shè)計(jì)簡(jiǎn)并引物時(shí)，肯定要檢查靶擴(kuò)增區(qū)域選定氨基酸遺傳密碼的簡(jiǎn)并度。很明顯，我們期望選擇簡(jiǎn)并度最低的氨基酸，到達(dá)提高特異性的目的。②充分留意物種對(duì)于密碼子的偏好性，選擇該物種使用頻率高的密碼子，以降低引物的簡(jiǎn)并性。③應(yīng)努3’末端不要位于密碼子的第三位。④在一些多義位置使用脫氧次黃嘌呤〔dI〕代替簡(jiǎn)并堿4．測(cè)序引物設(shè)計(jì)固然，測(cè)序引物的設(shè)計(jì)一般都由測(cè)序公司來(lái)完成，假設(shè)需要自己設(shè)計(jì)的話；那么除了依據(jù)上面所提到的引物設(shè)計(jì)通用標(biāo)準(zhǔn)外，還需要留意兩點(diǎn)：①測(cè)序引物的特異性的標(biāo)準(zhǔn)把握應(yīng)當(dāng)更嚴(yán)格一些，也就是說(shuō)設(shè)計(jì)時(shí)更優(yōu)先考慮特異性。由于在測(cè)序反響中，假設(shè)引物與模板在非預(yù)期位置退火并引發(fā)鏈延長(zhǎng)，會(huì)對(duì)結(jié)果對(duì)來(lái)很大的干擾甚至造成結(jié)果無(wú)法識(shí)讀。②測(cè)序引