植物基因克隆的工具酶

植物基因克隆的工具酶第1頁，共71頁，2023年，2月20日，星期五基因工程中的工具酶：應(yīng)用于基因工程的各種酶的總稱，包括核酸序列分析、標(biāo)記探針制備、載體構(gòu)建、目的基因選取、重組DNA制備等過程中所需要的酶。第2頁，共71頁，2023年，2月20日，星期五第3頁，共71頁，2023年，2月20日，星期五一、限制性核酸內(nèi)切酶第一節(jié)

限制性核酸內(nèi)切酶是一類能夠識別雙鏈DNA分子中的特定核苷酸序列（4-8bp），并在識別序列內(nèi)或附近特異切割雙鏈DNA的核酸內(nèi)切酶。限制酶天然存在于細(xì)菌體內(nèi)。（Restrictionendonuclease）第4頁，共71頁，2023年，2月20日，星期五（一）寄主控制的限制與修飾現(xiàn)象（R/M體系）任何物種都有排除異物保護(hù)自身的防御機(jī)制，如人的免疫系統(tǒng)和細(xì)菌的限制與修飾系統(tǒng)，即限制酶與修飾酶組成的系統(tǒng)。早在20世紀(jì)50年代初，有許多學(xué)者發(fā)現(xiàn)了限制與修飾現(xiàn)象，當(dāng)時被稱作寄主控制的專一性。λ噬菌體表現(xiàn)的現(xiàn)象便具有代表性和普遍性，其在不同宿主中的轉(zhuǎn)染頻率可說明這一問題。第5頁，共71頁，2023年，2月20日，星期五這說明K菌株和B菌株中存在一種限制系統(tǒng)，可排除外來的DNA。10-4的存活率是由于宿主修飾系統(tǒng)作用的結(jié)果，此時限制系統(tǒng)還未起作用。第6頁，共71頁，2023年，2月20日，星期五宿主控制限制（host-controlledrestriction）：菌體在某一株細(xì)菌的生長能力在轉(zhuǎn)移到另一株細(xì)菌宿主時，要受到一定限制。實際就是限制酶降解外源DNA，維護(hù)宿主遺傳穩(wěn)定的保護(hù)機(jī)制。第7頁，共71頁，2023年，2月20日，星期五宿主控制修飾（host-controlledmodification）：用作繁殖噬菌體的感染宿主并不會產(chǎn)生DNA降解，這是因為它具有宿主控制性修飾的作用。甲基化是常見的修飾作用，通過甲基化作用達(dá)到識別自身遺傳物質(zhì)和外來遺傳物質(zhì)的目的。如A：N6-甲基腺嘌呤；C：5’-甲基胞嘧啶第8頁，共71頁，2023年，2月20日，星期五第9頁，共71頁，2023年，2月20日，星期五第10頁，共71頁，2023年，2月20日，星期五（二）限制酶的發(fā)現(xiàn)20世紀(jì)60年代，人們就注意到DNA在感染宿主后會被降解的現(xiàn)象，從而提出限制性切酶和限制酶的概念。1968年，首次從E.coliK中分離到限制酶；1970年，美國H.Smith偶然發(fā)現(xiàn)，流感嗜血桿菌能迅速降解外源的噬菌體DNA，其細(xì)胞提取液可降解E.coliDNA，但不能降解自身DNA，從而找到HindⅡ限制性內(nèi)切酶。從此以后，發(fā)現(xiàn)的限制酶越來越多，并且許多已經(jīng)在實踐中得到應(yīng)用。EcoRⅠ是應(yīng)用最廣泛的限制性內(nèi)切酶，酶切位點和切割位點如下：

5'G↓AATTC3'

3'CTTAA↑G5'第11頁，共71頁，2023年，2月20日，星期五據(jù)統(tǒng)計：1986年：615種限制酶，98種甲基化酶1998年：1000種細(xì)菌或古細(xì)菌中存在3000多種酶，且200多種特異性。2006年：4583種酶，其中限制酶3773種，第12頁，共71頁，2023年，2月20日，星期五命名原則：第一個字母（大寫,斜體）：該酶來源的微生物屬名；第二、第三個字母（小寫、斜體）：微生物的種名；若該微生物有不同的變種和品系，再加上該變種和品系的第一個字母（大寫）若從同一微生物發(fā)現(xiàn)多種限制性內(nèi)切酶，則依照發(fā)現(xiàn)和分離的先后順序用羅馬字母表示?？傊合拗泼赣扇糠謽?gòu)成（菌種名、菌系編號、分離順序）（三）限制性內(nèi)切酶的命名1973年Smith和Nathans提出有關(guān)限制酶命名規(guī)則的建議第13頁，共71頁，2023年，2月20日，星期五例如：HindⅢ前三個字母來自于菌種名稱H.influenzae，“ｄ”表示菌系為ｄ型血清型；“Ⅲ”表示分離到的第三個限制酶。EcoRI—EscherichiacoliRIHindⅢ—Haemophilus

influensae

dⅢSacI(II)—Streptomyces

achromagenesI(Ⅱ)（三）限制性內(nèi)切酶的命名第14頁，共71頁，2023年，2月20日，星期五舉例EcoRIEscherichia屬名Coli種類Ry13株系編號

若種名頭2個字母相同則其中一個可用種名的第一和第三個字母。第15頁，共71頁，2023年，2月20日，星期五

限制酶的生物學(xué)功能一般是保護(hù)宿主不受外來DNA的感染，可降解外來的DNA，從而阻止其復(fù)制和整合到細(xì)胞中。一般來說，與限制酶伴生的修飾酶是甲基轉(zhuǎn)移酶，能保護(hù)自身的DNA不被降解。它們與對應(yīng)的限制酶識別相同的序列，但其作用不是切割DNA，而是在兩條鏈上對某個堿基進(jìn)行甲基化。限制酶和甲基轉(zhuǎn)移組成限制和修飾系統(tǒng)。（四）限制性內(nèi)切酶的種類第16頁，共71頁，2023年，2月20日，星期五I：能識別專一的核苷酸順序，并在識別點附近的一些核苷酸上切割DNA分子雙鏈，但它隨機(jī)切割核苷酸的順序，無專一性。Ⅱ：能識別專一的核苷酸順序，并在該順序內(nèi)的固定位置上切割雙鏈。這類限制性內(nèi)切酶的識別和切割的核苷酸都是專一的，這種限制性內(nèi)切酶是DNA重組技術(shù)中常用的工具酶。Ⅲ：也有專一的識別順序，但不是對稱的回文順序，在識別順序旁邊幾個核苷酸對的固定位置上切割雙鏈，但這幾個核苷酸不是特異性的。這種限制性內(nèi)切酶切割后產(chǎn)生的一定長度DNA片段，具有各種單鏈末端。（四）限制性內(nèi)切酶的種類第17頁，共71頁，2023年，2月20日，星期五性質(zhì)酶Ⅰ酶Ⅱ酶Ⅲ結(jié)構(gòu)與功能三亞基多功能酶單一功能的酶二亞基雙功能的酶限制與修飾酶蛋白同時具有甲基化作用酶蛋白不具有甲基化作用酶蛋白同時具有甲基化作用限制作用的輔助因子ATP,Mg2+,SAMMg2+ATP,Mg2+,SAM寄主特異性位點序列特異性,非對稱序列特異性,旋轉(zhuǎn)對稱序列特異性,非對稱序列切割位點在距寄主特異性位點至少1kb的地方位于寄主特異性位點或其附近在距寄主特異性位點3′端24~26bp處切割方式隨機(jī)切割特異切割特異切割甲基化作用位點寄主特異性的位點寄主特異性的位點寄主特異性的位點在DNA克隆中的用途無十分有用有用表2-1限制性內(nèi)切酶的類型及其主要特征第18頁，共71頁，2023年，2月20日，星期五

限制性內(nèi)切酶以雙鏈DNA為底物，識別特定的核苷酸序列，切斷特定位置的磷酸二酯鏈，產(chǎn)生具有3’-OH和5’-P的DNA片段。（五）限制性內(nèi)切酶作用機(jī)制第19頁，共71頁，2023年，2月20日，星期五限制性內(nèi)切酶作用過程點擊播放第20頁，共71頁，2023年，2月20日，星期五（六）限制性內(nèi)切酶的識別與切割1.在DNA分子雙鏈的特異性識別序列部位切割DNA分子產(chǎn)生鏈的斷裂2.識別由4-8個（多數(shù)4-6個）核苷酸組成的特定的核苷酸序列3.識別堿基對的順序呈回文結(jié)構(gòu)（Palindromic），切點就在其內(nèi)部。識別第21頁，共71頁，2023年，2月20日，星期五第22頁，共71頁，2023年，2月20日，星期五回文結(jié)構(gòu)（Palindromic）ABCC’B’A’A’B’C’C

BAABNB’A’A’B’NBA大多數(shù)識別位點具有180度旋轉(zhuǎn)對稱的結(jié)構(gòu)形式，即這些核苷酸對的順序是回文結(jié)構(gòu)。第23頁，共71頁，2023年，2月20日，星期五

限制性內(nèi)切酶切斷DNA鏈上磷酸二酯鍵的位置一般在識別序列內(nèi)部，如G↓GATCC，AT↓CGAT；也有少數(shù)在識別序列的兩端如↓GATC，CATG↓。切割注意：環(huán)狀DNA分子上，若某種限制性內(nèi)切酶有n個識別序列，則完全切割后可獲得n個片段。線狀DNA分子，若某種限制性內(nèi)切酶有n個識別序列，則完全切割后可獲得n+1個片段。第24頁，共71頁，2023年，2月20日，星期五幾種II型限制性核酸內(nèi)切酶的酶切位點PstIProvindenciastuartii164

CTGCAGGACGTCHaemophilusinfluenzaeRd

第25頁，共71頁，2023年，2月20日，星期五EcoRIPstI5’……CTGCAG……3’3’……GACGTC...…5’不同核酸內(nèi)切酶的特異識別位點5’……GAATTC……3’3’……CTTAAG……5’第26頁，共71頁，2023年，2月20日，星期五AAGCTTTTCGAAAAGCTTTTCGAADNAABCDDNAHindⅢHindⅢ切割位點核酸內(nèi)切酶HindⅢ對雙鏈DNA分子的切割作用第27頁，共71頁，2023年，2月20日，星期五酶生物來源識別序列黏/平末端EcoRI大腸桿菌GAATTC黏末端BamHI淀粉芽孢桿菌GCATCC黏末端BalII枯草芽孢桿菌AGATCT黏末端PvuI普通變形菌CGATCG黏末端PvuII普通變形菌CAGCTG平末端HindIII流感嗜血桿菌RdAAGCCT黏末端HinfI流感嗜血桿菌RfGANTC黏末端Sau3A金黃色葡萄球菌GATC黏末端AluI藤黃節(jié)桿菌AGCT平末端TaqI水聲棲熱菌TCGA黏末端HaeIII埃及嗜血菌GGCC平末端NotI豚鼠耳炎諾卡氏菌GCGGCCGC黏末端SfiI鑲邊鏈霉菌GGCCNNNNNGGCC黏末端最常用的限制性內(nèi)切酶的識別序列第28頁，共71頁，2023年，2月20日，星期五切割方式平頭末端（bluntendorflushend）經(jīng)酶切所形成的末端具有互補(bǔ)堿基對完好的末端，稱為平頭末端。第29頁，共71頁，2023年，2月20日，星期五粘性末端（cohesiveend）切割方式

大多數(shù)Ⅱ型限制性內(nèi)切酶結(jié)合并切割的DNA序列是一種回文序列，經(jīng)切割一端產(chǎn)生5′-磷酸突出的末端，另一端產(chǎn)生3′-OH突出的末端，即DNA片段雙鏈的兩個末端含有幾個等長核苷酸堿基互補(bǔ)配對的單鏈末端，稱為粘性末端。第30頁，共71頁，2023年，2月20日，星期五第31頁，共71頁，2023年，2月20日，星期五部分常用的限制性內(nèi)切酶第32頁，共71頁，2023年，2月20日，星期五第33頁，共71頁，2023年，2月20日，星期五第34頁，共71頁，2023年，2月20日，星期五第35頁，共71頁，2023年，2月20日，星期五有一些限制酶的識別順序不是對稱結(jié)構(gòu)５’－CCGCTC－３’３’－GGCGAG－５’AccBSIBssSI５’－CTCGTG－３’３’－GAGCAC－５’第36頁，共71頁，2023年，2月20日，星期五同裂酶（isoschizomers）

概念

用途

有一些同裂酶對于切割位點上的甲基化堿基的敏感性有所差別，所以可以用來研究DNA甲基化作用。KpnIGGTACCAsp718GGTACCSstICCGCGGSacICCGCGG

有一些來源不同的限制性酶識別的是相同的核苷酸靶序列，這類酶稱為同裂酶。第37頁，共71頁，2023年，2月20日，星期五識別位點的序列相同同裂酶（Isoschizomers)①完全同裂酶（同序同切酶）識別位點和切點完全相同。

如HindⅢ

和HsuI。HindⅢ5’-AAGCTT-3’3’-TTCGAA-5’

HsuI5’-AAGCTT-3’3’-TTCGAA-5’

第38頁，共71頁，2023年，2月20日，星期五XmaI5’-CCCGGG-3’3’-GGGCCC-5’

SmaI5’-CCCGGG-3’3’-GGGCCC-5’

識別位點相同，但切點不同。

如XmaI和

SmaI。②不完全同裂酶（同序異切酶）：第39頁，共71頁，2023年，2月20日，星期五

用途

如：限制酶HpaⅡ和MspⅠ是一對同裂酶，共同的靶序列是CCGG。當(dāng)其靶序列中含有一個5-甲基胞嘧啶（CCGG，*號表示甲基化的堿基），HpaⅡ不能夠切割它，而MspⅠ對于這個核苷酸的甲基化作用的反應(yīng)則是中性的，它不管C殘基甲基化與否都能夠切割。*

現(xiàn)已研究發(fā)現(xiàn)，許多動物DNA中90%以上的甲基，都是在序列CG處以5-甲基胞嘧啶的形式出現(xiàn)。所以，通過比較HpaⅡ和MspⅠ的DNA消化產(chǎn)物就可以檢測出甲基化的存在。第40頁，共71頁，2023年，2月20日，星期五同尾酶（isocaudamer）

概念

與同裂酶對應(yīng)的一類限制性酶，它們雖然來源各異，識別的靶序列也各不相同，但都產(chǎn)生出相同的粘性末端，這類酶稱為同尾酶。

常用的限制酶BamHⅠ、BclⅠ、BglⅡ、Sau3AⅠ和XhoⅡ就是一組同尾酶，它們切割DNA后都形成由GATC4個核苷酸組成的粘性末端。

舉例第41頁，共71頁，2023年，2月20日，星期五識別的序列不同，但能切出相同的粘性末端。如BamHI、Bgl

Ⅱ、BclI、Xho

Ⅱ等5’-GGATCC-3’3’-CCTAGG-5’

BamHIBclI5’-TGATCA-3’3’-ACTAGT-5’

5’-AGATCT-3’3’-TCTAGA-5’

Bgl

Ⅱ5’-UGATCY-3’3’-YCTAGU-5’Xho

ⅡU代表嘌呤；Y代表嘧啶。第42頁，共71頁，2023年，2月20日，星期五

用途

由于同尾酶切割DNA后產(chǎn)生的是粘性末端，因此，可以通過粘性末端之間的互補(bǔ)作用而彼此連接起來，這在基因克隆實驗中是很有用處的。同尾酶（isocaudamer）由一對同尾酶分別產(chǎn)生的粘性末端共價結(jié)合形成的位點，特稱為雜種位點（hybridsite）第43頁，共71頁，2023年，2月20日，星期五5’-GATC----3’3’----CTAG-5’

Sau3A同尾酶的粘性末端互相結(jié)合后形成的新位點一般不能再被原來的酶識別。？5’-G3’-CCTAG

GATCT-3’

A-5’

BamHIBgl

Ⅱ5’-GGATCT-3’3’-CCTAGA-5’

BamHIBglⅡSau3A第44頁，共71頁，2023年，2月20日，星期五（七）Ⅱ型限制性內(nèi)切酶的反應(yīng)條件第45頁，共71頁，2023年，2月20日，星期五（八）影響限制性內(nèi)切酶活性的因素

酶的純度

DNA樣品的純度

DNA的甲基化程度酶切反應(yīng)的溫度和時間

DNA分子的結(jié)構(gòu)限制性內(nèi)切核酸酶的反應(yīng)緩沖液第46頁，共71頁，2023年，2月20日，星期五

高質(zhì)量的限制性核酸內(nèi)切酶，要求:

不存在其他核酸內(nèi)切酶或外切酶的污染;

長時間酶解不出現(xiàn)識別順序特異性的下降;

酶解的DNA片段連接后能重新被識別和切割等.

酶的純度第47頁，共71頁，2023年，2月20日，星期五1.DNA制劑中可能抑制限制性內(nèi)切酶活性的物質(zhì):

蛋白質(zhì)、酚、氯仿、酒精

乙二胺四乙酸（EDTA）

十二烷基硫酸鈉（SDS）高濃度的鹽離子等

DNA樣品的純度第48頁，共71頁，2023年，2月20日，星期五2.提高限制性內(nèi)切酶對低濃度DNA制劑反應(yīng)效率的方法①增加內(nèi)切酶的用量，平均每微克底物DNA可高達(dá)10單位甚至更多些；②擴(kuò)大酶催化反應(yīng)的體積，以使?jié)撛诘囊种埔蛩乇幌鄳?yīng)地稀釋；③延長酶催化反應(yīng)的保溫時間。第49頁，共71頁，2023年，2月20日，星期五

DNA的甲基化

1.原核生物的限制-修飾系統(tǒng)的組成成分是：甲基化酶：對自身DNA起修飾作用，從而使限制性內(nèi)切核酸酶不能識別，保護(hù)自身DNA免受降解。限制性內(nèi)切核酸酶：破壞入侵的外源DNA，防御異源遺傳信息進(jìn)入體內(nèi)。因此，甲基化作用直接影響限制性內(nèi)切酶的活性第50頁，共71頁，2023年，2月20日，星期五2.從大腸桿菌寄主細(xì)胞中分離而來的質(zhì)粒DNA，通常都混有兩種作用于特定核苷酸序列的甲基化酶：dam甲基化酶：催化GATC序列中的腺嘌呤殘基甲基化。dcm甲基化酶：催化CCAGG或CCTGG中胞嘧啶殘基甲基化。第51頁，共71頁，2023年，2月20日，星期五3.基于基因工程

從以上知識可知：從正常大腸桿菌菌株中分離出來的質(zhì)粒DNA，只能被限制性內(nèi)切核酸酶局部消化，甚至完全不被消化。

因此，在基因工程中，為了避免產(chǎn)生上述問題，通常使用失去了甲基化酶的大腸桿菌菌株制備質(zhì)粒DNA。第52頁，共71頁，2023年，2月20日，星期五

酶切反應(yīng)的溫度

DNA酶切反應(yīng)的溫度是影響限制性內(nèi)切核酸酶活性的另一個重要因素。不同的核酸內(nèi)切酶，具有不同的最適溫度，而且彼此之間有很大的變動范圍。

但，大多數(shù)限制性核酸內(nèi)切酶的標(biāo)準(zhǔn)反應(yīng)溫度都是37℃。第53頁，共71頁，2023年，2月20日，星期五酶反應(yīng)溫度（℃）ApaⅠBanⅠBstEⅡMaeⅠMaeⅡMaeⅢSmaⅠTaqⅠ3050604550552565表2-2部分限制性核酸內(nèi)切酶的最適反應(yīng)溫度第54頁，共71頁，2023年，2月20日，星期五

DNA分子結(jié)構(gòu)DNA分子的不同的構(gòu)型對限制性內(nèi)切核酸酶的活性也有很大的影響。

某些核酸內(nèi)切酶切割超螺旋的質(zhì)粒DNA或病毒DNA所需要的酶量，要比消化線性DNA高出許多倍，最高的可達(dá)20倍。第55頁，共71頁，2023年，2月20日，星期五

某些限制性內(nèi)切核酸酶，對于同一DNA分子上不同位置的識別序列，切割效率明顯不同。

DNA分子結(jié)構(gòu)原因可能是側(cè)翼序列的核苷酸成分的差異造的。

一般來說，一種限制性內(nèi)切核酸酶對其不同識別位點切割速率的差別最多不會超過10倍。第56頁，共71頁，2023年，2月20日，星期五

限制性核酸內(nèi)切酶的反應(yīng)緩沖液1.緩沖液的主要成分Tris-Cl：使反應(yīng)混合物的pH恒定在酶活性所要求的最佳數(shù)值范圍內(nèi)。對絕大數(shù)限制酶來說，最佳pH=7.4。MgCl2：保證酶活性的正常發(fā)揮。NaCl或KCl：同上。第57頁，共71頁，2023年，2月20日，星期五β-巰基乙醇：防止限制酶的氧化（但也可能有利于潛在污染雜質(zhì)的穩(wěn)定性）。牛血清白蛋白（BSA）：對某些限制酶是必需的，它是一種中性蛋白，可防止酶在低濃度蛋白質(zhì)溶液中變性。

限制性核酸內(nèi)切酶的反應(yīng)緩沖液1.緩沖液的主要成分第58頁，共71頁，2023年，2月20日，星期五2.緩沖液的分類

不同酶對緩沖液的離子強(qiáng)度要求不同，據(jù)此緩沖液可分為如下三種：低鹽緩沖液（L）：10mmol/LNaCl

中鹽緩沖液（M）：50mmol/LNaCl

高鹽緩沖液（H）：100mmol/LNaCl

限制性核酸內(nèi)切酶的反應(yīng)緩沖液第59頁，共71頁，2023年，2月20日，星期五

限制性核酸內(nèi)切酶的反應(yīng)緩沖液3.星號活性（staractvity）

限制性內(nèi)切核酸酶的識別位點是在特定的消化條件下測定的，當(dāng)條件改變時，有些酶的識別位點也隨之改變，可能切割一些與特異識別序列相類似的序列，這種現(xiàn)象稱為星號活性。①概念第60頁，共71頁，2023年，2月20日，星期五