病原微生物生理學(xué)檢驗(yàn)

病原微生物生理學(xué)檢驗(yàn)第1頁，共40頁，2023年，2月20日，星期一（一）培養(yǎng)基由人工方法配制而成的，專供微生物生長繁殖使用的混合營養(yǎng)物制品。

第一節(jié)分離培養(yǎng)一、細(xì)菌的分離培養(yǎng)第2頁，共40頁，2023年，2月20日，星期一1.培養(yǎng)基種類基礎(chǔ)培養(yǎng)基營養(yǎng)培養(yǎng)基鑒別培養(yǎng)基選擇培養(yǎng)基特殊培養(yǎng)基包括厭氧培養(yǎng)基和細(xì)菌L型培養(yǎng)基等。堿性瓊脂血液增菌培養(yǎng)基營養(yǎng)肉湯第3頁，共40頁，2023年，2月20日，星期一分離培養(yǎng)基的選擇依據(jù)衛(wèi)生部臨床檢驗(yàn)中心推薦，應(yīng)備有如下分離培養(yǎng)基：

1．血平板

2．巧克力血平板

3．中國藍(lán)平板或伊紅美藍(lán)平板

4．麥康凱平板

5．SS瓊脂第4頁，共40頁，2023年，2月20日，星期一2.培養(yǎng)基的組成成分營養(yǎng)物質(zhì)凝固物質(zhì)抑制劑和指示劑第5頁，共40頁，2023年，2月20日，星期一第6頁，共40頁，2023年，2月20日，星期一(二)細(xì)菌的接種方法

1.平板劃線分離法

1)連續(xù)劃線分離法

2)分區(qū)劃線分離法第7頁，共40頁，2023年，2月20日，星期一2.斜面接種法3.液體接種法4.穿刺接種法5.傾注平板法6.涂布接種法第8頁，共40頁，2023年，2月20日，星期一(三)細(xì)菌的培養(yǎng)方法

1.需氧培養(yǎng)法2.二氧化碳培養(yǎng)法

1)二氧化碳培養(yǎng)箱

2)燭缸法

3)化學(xué)法3.厭氧培養(yǎng)法第9頁，共40頁，2023年，2月20日，星期一1．動(dòng)物接種動(dòng)物對(duì)病毒的敏感性是不同的，選擇合適動(dòng)物十分重要。小鼠、乳鼠、家兔、豚鼠、猴等常用于分離病毒。二病毒分離培養(yǎng)第10頁，共40頁，2023年，2月20日，星期一2．雞胚接種雞胚是用于分離粘病毒科、皰疹病毒、痘類病毒的較為理想的材料組織培養(yǎng)是指將人或動(dòng)物離體的活組織或分散的活細(xì)胞放在實(shí)驗(yàn)室的試管或培養(yǎng)瓶中,模擬體內(nèi)的生理?xiàng)l件使之生長第11頁，共40頁，2023年，2月20日，星期一

2.組織細(xì)胞培養(yǎng)根據(jù)細(xì)胞的來源、特性和傳代次數(shù)分為：

(1)原代細(xì)胞培養(yǎng)：將細(xì)胞懸液加入營養(yǎng)液培養(yǎng)，形成的單層細(xì)胞，稱之為原代細(xì)胞。

(2)二倍體細(xì)胞株：仍保持二倍體特性。壽命一般為40～50代，如人胚肺細(xì)胞。廣泛用于病毒分離和疫苗制備。

(3)傳代細(xì)胞系：來于腫瘤細(xì)胞，染色體特征類似腫瘤細(xì)胞。常用的有人宮頸癌細(xì)胞(Hela)、人喉上皮癌細(xì)胞(Hep-2)。第12頁，共40頁，2023年，2月20日，星期一三、真菌的分離培養(yǎng)1.大培養(yǎng)2.小培養(yǎng)

(1)玻片法

(2)鋼圈法

(3)方塊法第13頁，共40頁，2023年，2月20日，星期一第二節(jié)毒素的檢測(cè)一、細(xì)菌內(nèi)毒素的測(cè)定主要用于診斷病人是否發(fā)生革蘭陰性細(xì)菌感染。另外，還可用于檢測(cè)注射用液和生物制品有無內(nèi)毒素污染第14頁，共40頁，2023年，2月20日，星期一

1．細(xì)菌內(nèi)毒素的致熱作用常以家兔作為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，家兔正常體溫38.5℃～40℃。抽取被檢物注入家兔耳靜脈，記錄體溫變化情況，分析實(shí)驗(yàn)結(jié)果第15頁，共40頁，2023年，2月20日，星期一

2．鱟試驗(yàn)鱟血液的有核變形細(xì)胞內(nèi)含凝固酶原及凝固蛋白原，當(dāng)內(nèi)毒素與鱟變形細(xì)胞凍融后的溶解物(鱟試劑)接觸時(shí)，可激活凝固酶原，使可溶性的凝固蛋白原變成凝膠狀態(tài)的凝固蛋白，利用此種反應(yīng)來檢測(cè)內(nèi)毒素。本試驗(yàn)對(duì)內(nèi)毒素具有高度特異性，靈敏度高，可檢查出0.005～0.0005μg/ml內(nèi)毒素。且操作簡便，速度快，在2h內(nèi)即可得出結(jié)論。第16頁，共40頁，2023年，2月20日，星期一二、外毒素的測(cè)定

1．體內(nèi)毒力試驗(yàn)細(xì)菌外毒素對(duì)機(jī)體的毒性作用，可被相應(yīng)抗毒素中和，若先給動(dòng)物注射抗毒素，然后再注射外毒素，則動(dòng)物不產(chǎn)生中毒癥狀。第17頁，共40頁，2023年，2月20日，星期一

2．體外毒力試驗(yàn)外毒素抗原性強(qiáng)，可刺激機(jī)體產(chǎn)生相應(yīng)的抗體。在體外以細(xì)菌外毒素的特異性免疫血清為抗體與被檢細(xì)菌外毒素(抗原)進(jìn)行抗原抗體反應(yīng)，來檢測(cè)外毒素，從而鑒定細(xì)菌是否產(chǎn)生該種毒素。如白喉棒狀桿菌的Elek平板毒力測(cè)定３．ELISA法如葡萄球菌腸毒素、腸產(chǎn)毒型大腸埃希菌LT及ST等的測(cè)定第18頁，共40頁，2023年，2月20日，星期一第三節(jié)生化反應(yīng)不同細(xì)菌具有各自獨(dú)特的酶系統(tǒng)，因而對(duì)底物的分解能力各異，其代謝的產(chǎn)物也不相同。這些代謝產(chǎn)物又各具有不同的生物化學(xué)特性，為此，可利用生物化學(xué)的方法測(cè)定這些代謝產(chǎn)物以鑒定細(xì)菌第19頁，共40頁，2023年，2月20日，星期一

1．糖(醇、苷)類發(fā)酵試驗(yàn)

(1)原理：由于細(xì)菌含有發(fā)酵不同糖類的酶，故分解糖的能力不同，終末產(chǎn)物亦不一致。有的能分解，有的僅能分解1~2種，還有的不能分解。有的產(chǎn)酸產(chǎn)氣，有的僅產(chǎn)酸，故可利用鑒別細(xì)菌第20頁，共40頁，2023年，2月20日，星期一

(2)培養(yǎng)基：在培養(yǎng)基中加入0.5％-1％的糖類(單糖、雙糖或多糖)、醇類(甘露醇、肌醇等)、苷類(水楊苷、菊糖等)。可為液體、半固體、固體或微量生化管幾種類型

(3)方法：將細(xì)菌接種到糖發(fā)酵培養(yǎng)基中，培養(yǎng)數(shù)小時(shí)至2w后，觀察結(jié)果第21頁，共40頁，2023年，2月20日，星期一

(4)結(jié)果：能分解糖產(chǎn)酸時(shí)，呈酸性反應(yīng)，若產(chǎn)氣可出現(xiàn)氣泡或培養(yǎng)基內(nèi)有裂隙等現(xiàn)象;若不分解，除有細(xì)菌生長外，無任何變化

(5)應(yīng)用：是鑒定細(xì)菌最主要的試驗(yàn)，特別對(duì)腸桿菌科細(xì)菌的鑒定尤為重要第22頁，共40頁，2023年，2月20日，星期一

2．V-P試驗(yàn)(1)原理：某些細(xì)菌分解葡萄糖產(chǎn)生丙酮酸，脫羧產(chǎn)生乙酰甲基甲醇，在堿性環(huán)境中被氧氧化為二乙酰，進(jìn)而與胍基起作用生成紅色化合物，則為V-P試驗(yàn)陽性。(2)培養(yǎng)基：葡萄糖蛋白胨水培養(yǎng)基。第23頁，共40頁，2023年，2月20日，星期一(3)方法：將待檢菌接種于上述培養(yǎng)基中，于35℃培養(yǎng)48h后加入甲液(6％n·萘酚酒精溶液)和乙液(40％KOH溶液)，振搖。(4)結(jié)果：在數(shù)分鐘內(nèi)出現(xiàn)紅色為陽性；如無紅色出現(xiàn)且于35℃4h后仍如故者即為陰性。(5)應(yīng)用：常與甲基紅試驗(yàn)一起使用，因?yàn)榍罢哧栃缘募?xì)菌，后者通常為陰性。

第24頁，共40頁，2023年，2月20日，星期一3．甲基紅試驗(yàn)(1)原理：某些細(xì)菌分解葡萄糖產(chǎn)生丙酮酸，進(jìn)一步分解，產(chǎn)生甲酸等，使pH降至4.5以下，加入甲基紅試劑則呈紅色為陽性。若分解葡萄糖產(chǎn)酸量少，則pH6.2以上，故加入甲基紅指示劑呈黃色，為陰性。第25頁，共40頁，2023年，2月20日，星期一(2)培養(yǎng)基：葡萄糖蛋白胨水培養(yǎng)基。(3)方法：將待檢菌接種于上述培養(yǎng)基中，培養(yǎng)2~4d，于培養(yǎng)基內(nèi)加入甲基紅試劑，立即觀察結(jié)果。(4)結(jié)果：呈現(xiàn)紅色為陽性；橘紅色為弱陽性；黃色為陰性。第26頁，共40頁，2023年，2月20日，星期一(5)應(yīng)用：主要用于鑒別大腸埃希菌與產(chǎn)氣腸桿菌，前者為陽性，后者為陰性。此外腸桿菌科中沙門菌屬、志賀菌屬、枸櫞酸桿菌屬、變形桿菌屬等為陽性，而腸桿菌屬則為陰性。第27頁，共40頁，2023年，2月20日，星期一4.枸櫞酸鹽試驗(yàn)(Simmons法）

原理:枸櫞酸鹽利用試驗(yàn)是檢測(cè)細(xì)菌能否利用枸櫞酸鹽作為碳的唯一來源的特征，培養(yǎng)基含有枸櫞酸鈉和磷酸二氫胺

結(jié)果：培養(yǎng)基由綠色變?yōu)樯钏{(lán)色為陽性

用途：用于腸桿菌科內(nèi)各種細(xì)菌的鑒別第28頁，共40頁，2023年，2月20日，星期一5.丙二酸鹽試驗(yàn)?zāi)承┘?xì)菌以丙二酸鹽為唯一碳源，生成碳酸鈉使培養(yǎng)基變堿性陽性結(jié)果藍(lán)色溴麝香草酚藍(lán)第29頁，共40頁，2023年，2月20日，星期一6.氰化鉀抑制試驗(yàn)原理：檢測(cè)細(xì)菌能否被一定濃度的氰化鉀抑制而不能生長結(jié)果：不能生長為陽性培養(yǎng)基：含氰化鉀用途：鑒別與沙門菌屬、痢疾桿菌屬相類似的腸道桿菌第30頁，共40頁，2023年，2月20日，星期一7.硝酸鹽（Nitrate）還原試驗(yàn)有些細(xì)菌具有還原硝酸鹽的能力，可將硝酸鹽還原為亞硝酸鹽，有效菌可進(jìn)一步分解亞硝酸鹽產(chǎn)生氨或氮?dú)獾?。本試?yàn)陰性的原因：細(xì)菌不能還原硝酸鹽；亞硝酸鹽繼續(xù)分解；培養(yǎng)基不適宜細(xì)菌生長。第31頁，共40頁，2023年，2月20日，星期一加鋅粉檢驗(yàn)。加鋅粉——紅色，說明產(chǎn)生芳基肼，硝酸鹽還在。無紅色時(shí)，說明以分解氨和氮，也可加倒管收集氣體。第32頁，共40頁，2023年，2月20日，星期一

原理:檢測(cè)細(xì)菌能否分解色氨酸而產(chǎn)生靛基質(zhì)

培養(yǎng)基：含有色氨酸

結(jié)果：形成玫瑰靛基質(zhì)（紅色）

用途：鑒別腸道桿菌8.靛基質(zhì)（Imdole）試驗(yàn)第33頁，共40頁，2023年，2月20日，星期一9.H2S試驗(yàn)原理：檢測(cè)細(xì)菌能否產(chǎn)生H2S培養(yǎng)基：含醋酸鉛硫酸亞鐵氯化亞鐵或枸櫞酸鐵結(jié)果：形成黑色沉淀物用途：鑒別腸道桿菌的種類第34頁，共40頁，2023年，2月20日，星期一原理：檢測(cè)能否產(chǎn)生脲酶培養(yǎng)基：含有尿素結(jié)果：培養(yǎng)基變堿性，呈紅色用途：腸道桿菌等的鑒定10.尿素酶（Urease）試驗(yàn)第35頁，共40頁，2023年，2月20日，星期一11.明膠液化試驗(yàn)原理：檢測(cè)細(xì)菌能否產(chǎn)生膠原酶培養(yǎng)基：明膠結(jié)果：半固體的明膠變?yōu)榱鲃?dòng)液體狀態(tài)用途：腸桿菌科細(xì)菌的鑒定第36頁，共40頁，2023年，2月20日，星期一12.氧化酶（Oxidase）試驗(yàn)

原理：檢測(cè)細(xì)菌是否具有氧化酶

培養(yǎng)基：含有二甲基對(duì)苯二胺

結(jié)果：形成紅色化合物

用途：鑒別腸桿菌科細(xì)菌與假單胞菌第37頁，共40頁，2023年，2月20日，星期一13.觸酶試驗(yàn)原理：檢測(cè)細(xì)菌是否具有觸酶的特性結(jié)果：具有觸酶的細(xì)菌能催化過氧化氫生成水與新生態(tài)氧，形成呢個(gè)分子氧出現(xiàn)水泡，為觸酶陽性用途：革蘭陽性球菌的初步分群第38頁，共40頁，2023年，2月20日，星期一

14.苯丙氨酸脫氨酶試驗(yàn)

原理方法將細(xì)菌大量接種于上述培養(yǎng)基斜面，在35℃