深圳大學(xué)理科選修《生物安全與人類生活》第四章轉(zhuǎn)基因技術(shù)介紹課件

第四章轉(zhuǎn)基因技術(shù)介紹一、基本概念1、轉(zhuǎn)基因技術(shù)是將人工分離和修飾過(guò)的基因?qū)氲缴矬w基因組中，導(dǎo)入基因的表達(dá)會(huì)引起生物體的形狀的可遺傳的修飾，這一技術(shù)稱之為轉(zhuǎn)基因技術(shù)。轉(zhuǎn)基因簡(jiǎn)稱GM，指運(yùn)用科學(xué)手段從某種生物中提取所需要的基因，將其轉(zhuǎn)入另一種生物中，使與另一種生物的基因進(jìn)行重組，從而產(chǎn)生特定的具有變異遺傳性狀的物質(zhì)?！斑z傳工程”、“基因工程”、“遺傳轉(zhuǎn)化”均為轉(zhuǎn)基因的近義詞。經(jīng)轉(zhuǎn)基因技術(shù)修飾的生物體常稱為“遺傳修飾生物體”

，簡(jiǎn)稱GMOs。利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)可以改變動(dòng)植物性狀，培育新品種。也可以利用其它生物體培育出期望的生物制品，用于醫(yī)藥、食品等方面。2、基因工程又稱分子克隆或重組DNA技術(shù)，指用酶學(xué)方法，將異源基因與載體DNA載體外進(jìn)行重組，將形成的重組基因轉(zhuǎn)入細(xì)胞，使異源基因在其中復(fù)制表達(dá)，從而改造生物特性，大量生產(chǎn)人類所需要的產(chǎn)物?；蚬こ桃话惆?個(gè)方面的內(nèi)容：獲取符合人們要求的DNA片斷，即“目的基因”；將目的基因與質(zhì)?；虿《綝NA（載體）連接成重組DNA；把重組DNA引入某種細(xì)胞（受體細(xì)胞）；把能表達(dá)目的基因的受體細(xì)胞挑選出來(lái)并使之表達(dá)。3、轉(zhuǎn)基因技術(shù)與傳統(tǒng)育種技術(shù)的區(qū)別人類自耕種作物以來(lái)，就未停止過(guò)作物的遺傳改良。過(guò)去幾千年里農(nóng)作物改良的方式主要是對(duì)自然突變產(chǎn)生的優(yōu)良基因和重組體的選擇和利用，通過(guò)隨機(jī)和自然的方式積累優(yōu)良基因。遺傳學(xué)創(chuàng)立后近百年的動(dòng)植物育種則是采用人工雜交的方法，進(jìn)行優(yōu)良基因的重組和外源基因的導(dǎo)入而實(shí)現(xiàn)遺傳改良。轉(zhuǎn)基因技術(shù)是利用重組DNA技術(shù)將外源基因?qū)肷矬w，是對(duì)傳統(tǒng)技術(shù)的發(fā)展和補(bǔ)充，兩者一脈相承，本質(zhì)都是對(duì)基因的遺傳改良。但在基因轉(zhuǎn)移的范圍和效率上有所區(qū)別：傳統(tǒng)技術(shù)一般只能在生物種內(nèi)個(gè)體間實(shí)現(xiàn)基因轉(zhuǎn)移，而轉(zhuǎn)基因技術(shù)所轉(zhuǎn)移的基因則不受生物間親緣關(guān)系的限制；傳統(tǒng)雜交和選擇技術(shù)一般是在生物個(gè)體水平上進(jìn)行，操作對(duì)象是整個(gè)基因組，轉(zhuǎn)移大量的基因，不可能準(zhǔn)確地對(duì)某個(gè)基因進(jìn)行操作和選擇，對(duì)后代的表現(xiàn)預(yù)見性較差；轉(zhuǎn)基因技術(shù)操作和轉(zhuǎn)移的一般是經(jīng)過(guò)明確定義的基因，功能清楚，后代表現(xiàn)可準(zhǔn)確預(yù)期。三、植物轉(zhuǎn)基因方法需要通過(guò)組織培養(yǎng)再生植株：農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化法、基因槍介導(dǎo)轉(zhuǎn)化法；不需要通過(guò)組織培養(yǎng)：花粉管通道法1、農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化法農(nóng)桿菌是普遍存在于土壤里的一種革蘭氏陰性細(xì)菌，在自然條件下可趨化性地感染大多數(shù)雙子葉植物的受傷部位，并誘導(dǎo)產(chǎn)生冠癭瘤或發(fā)狀根。根瘤農(nóng)桿菌和發(fā)根農(nóng)桿菌中分別含有Ti質(zhì)粒和Ri質(zhì)粒，其上有一段T-DNA。農(nóng)桿菌通過(guò)侵染植物傷口進(jìn)入細(xì)胞后，可將T-DNA插入到植物基因組中，并且可以通過(guò)減速分裂穩(wěn)定的遺傳給后代，這一特性成為農(nóng)桿菌介導(dǎo)法植物轉(zhuǎn)基因的理論基礎(chǔ)。TiPlasmidT-DNAregionLeftborderRightbordervirgenesori農(nóng)桿菌附著到植物細(xì)胞后留在細(xì)胞間隙中。T-DNA先在細(xì)菌中被剪切、復(fù)制，然后轉(zhuǎn)入植物細(xì)胞。auxin農(nóng)桿菌——包含Ti質(zhì)粒2、基因槍介導(dǎo)轉(zhuǎn)化法基因槍法最早由Cornell大學(xué)的薩Sanford提出，是依賴高速運(yùn)動(dòng)的金屬顆粒將外源基因引入活體細(xì)胞的一種轉(zhuǎn)化技術(shù)?；驑尭鶕?jù)其加速裝置可分為火藥式、電動(dòng)式和氣動(dòng)式?；驑尫ǔ晒訋缀醢怂泻坦阮愔参?，如小麥、玉米、水稻、大麥等。優(yōu)點(diǎn)：操作簡(jiǎn)單，效率高，適應(yīng)性強(qiáng)，一次可以向數(shù)以千計(jì)的細(xì)胞導(dǎo)人基因，不受細(xì)胞、組織或器官的類型限制，目標(biāo)命中率高；可以轉(zhuǎn)化線粒體、葉綠體等植物的不同細(xì)胞器。局限性：轉(zhuǎn)化效率不高；基因插入往往是多拷貝的，常造成基因失活或沉默；轟擊過(guò)程可能造成基因的斷裂，使插入的基因成為沒(méi)有活性的片斷；出現(xiàn)非轉(zhuǎn)化體或嵌合體的可能性較高。

應(yīng)用基因槍轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞

a:帶有目的基因的克隆載體；b:氯化鈣沉淀法制備微彈；c:安了微彈的基因槍；d:基因槍轟擊植物樣品；e:轉(zhuǎn)化細(xì)胞的組織培養(yǎng)；f:再生的轉(zhuǎn)基因植株缺點(diǎn)：工作時(shí)間受自然花期限制，必須充分了解每一種植物的開花受精的時(shí)間過(guò)程；自然田間操作，受環(huán)境條件影響很大；轉(zhuǎn)基因隨機(jī)方式整合進(jìn)入受體染色體，轉(zhuǎn)基因后代的遺傳情況較為復(fù)雜；操作經(jīng)驗(yàn)性很強(qiáng)；對(duì)單籽粒小花農(nóng)作物的操作難度較大；獲得大量的轉(zhuǎn)基因種子比較困難，工作效率較低。四、動(dòng)物轉(zhuǎn)基因技術(shù)動(dòng)物轉(zhuǎn)基因研究開始于20世紀(jì)80年代，從原理及技術(shù)可分為以下3個(gè)部分：上游部分：克隆目的基因，分析基因的結(jié)構(gòu)并在體外或其他系統(tǒng)中進(jìn)行功能研究；中游部分：設(shè)計(jì)遺傳修飾策略（包括載體系統(tǒng)的構(gòu)建等），選擇適當(dāng)?shù)陌屑?xì)胞進(jìn)行基因轉(zhuǎn)移和鑒定，在此基礎(chǔ)上將遺傳修飾由細(xì)胞向整體動(dòng)物過(guò)渡，實(shí)現(xiàn)對(duì)整體動(dòng)物基因組進(jìn)行人為修飾的目的；下游部分：按育種程序進(jìn)行工程動(dòng)物的選育和建系，在整體動(dòng)物的背景上對(duì)目的基因的功能進(jìn)行詳細(xì)的研究，并進(jìn)一步開發(fā)利用符合設(shè)計(jì)要求的遺傳工程動(dòng)物。轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的遺傳修飾策略包括：導(dǎo)致產(chǎn)生新功能的基因組修飾（GOF）；導(dǎo)致功能丟失的基因組修飾（LOF），主要有插入突變、大片段缺失突變、點(diǎn)突變及條件性基因缺失突變；導(dǎo)致基因替換的基因組修飾；染色體畸變轉(zhuǎn)基因動(dòng)物制備的主要方法有：顯微原核注射法逆轉(zhuǎn)錄病毒感染法胚胎干細(xì)胞介導(dǎo)法體細(xì)胞核移植技術(shù)精子載體法胞漿內(nèi)單精子注射法卵母細(xì)胞載體法現(xiàn)在的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物研究大都是在Palmiter方法的基礎(chǔ)上有所改進(jìn)而進(jìn)行的。繼Palmiter將大鼠GH基因?qū)胄∈蟮玫骄扌托∈蠛?，牛、綿羊以及人的GH基因也先后導(dǎo)入小鼠，得到的轉(zhuǎn)基因小鼠生長(zhǎng)速度達(dá)到對(duì)照組小鼠的4倍。1994年Sham用同源性豬-球蛋白的基因做啟動(dòng)子連接入β-球蛋白基因編碼區(qū)，在轉(zhuǎn)基因豬中高效表達(dá)出人的血紅蛋白。1996年，新西蘭科學(xué)家Damak等將小鼠超高硫角蛋白啟動(dòng)子與綿羊的IGF-IcDNA融合基因顯微注射到綿羊原核期胚胎，移植后生出5只羔羊，其中兩只（一公一母）為轉(zhuǎn)基因陽(yáng)性。用轉(zhuǎn)基因羊與43只母羊交配，生出85只羔羊，其中43只（50.6%）為轉(zhuǎn)基因陽(yáng)性。羔羊在14月齡剪毛時(shí)，轉(zhuǎn)基因羊凈毛平均產(chǎn)量比其半同胞非轉(zhuǎn)基因羊提高了6.2%，公羔羊產(chǎn)毛量提高的幅度9.2%，高于母羊3.4%。在毛纖維直徑、髓質(zhì)以及周歲體重方面無(wú)明顯差別。用乳腺生產(chǎn)重組蛋白（乳腺生物反應(yīng)器）可能是轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的最大應(yīng)用，也是轉(zhuǎn)基因研究的熱點(diǎn)之一。優(yōu)點(diǎn)：外源基因的導(dǎo)入整合效率較高；

不需要載體，直接轉(zhuǎn)移目的基因；目的基因的長(zhǎng)度可達(dá)250Kb；可以直接獲得純系，實(shí)驗(yàn)周期短。缺點(diǎn)：需要貴重精密儀器；

技術(shù)操作較難；外源基因的整合位點(diǎn)和整合的拷貝數(shù)都無(wú)法控制，易造成宿主動(dòng)物基因組的插入突變，引起相應(yīng)的性狀改變，重則致死；整合率極低，在小鼠上獲得轉(zhuǎn)基因動(dòng)物不到注射卵的5%，大家畜和其他動(dòng)物更低；據(jù)統(tǒng)計(jì)，一頭顯微注射轉(zhuǎn)基因牛大約要花費(fèi)30萬(wàn)美元。固定吸管之內(nèi)、外徑分別為30、80μm較為合適；定吸管內(nèi)徑太小會(huì)導(dǎo)致吸力不足，對(duì)受精卵操控不易；如太大則受精卵易受傷害，影響胚胎的存活率。顯微注射針自針尖起20μm處的外徑為4μm時(shí)，可獲得良好的轉(zhuǎn)染效率。注射針尖如果太粗，則導(dǎo)致插入透明帶及原核的阻力增加，且DNA流量過(guò)多，受精卵易于裂解；太細(xì)則導(dǎo)致針內(nèi)DNA流出速率過(guò)慢，且易阻塞，而使DNA無(wú)法順利流入原核內(nèi)，影響注射效率。顯微注射所使用的受精卵固定吸管及注射針制備困難，是影響轉(zhuǎn)基因效率及基因注入后之胚胎存活及轉(zhuǎn)基因成功與否極其重要的因子。將目的基因重組到逆轉(zhuǎn)錄病毒RNA載體上，制成高滴度的病毒顆粒，人為感染著床前或著床后的胚胎，也可讓胚胎與能釋放逆轉(zhuǎn)錄病毒的單培養(yǎng)層細(xì)胞共孵育以達(dá)到感染的目的；逆轉(zhuǎn)錄病毒RNA進(jìn)入宿主細(xì)胞后，被反轉(zhuǎn)錄為cDNA；并在整合酶和其末端特殊核酸序列作用下，整合到宿主細(xì)胞的基因組，進(jìn)行表達(dá)和遺傳得到轉(zhuǎn)基因動(dòng)物。逆轉(zhuǎn)錄病毒具有高效感染和在宿主細(xì)胞DNA上高度整合的特性，一旦細(xì)胞為逆轉(zhuǎn)錄病毒所感染，所產(chǎn)生的病毒DNA在轉(zhuǎn)錄和整合后，即變成宿主基因組的一部分，在宿主細(xì)胞中終生維持。用逆轉(zhuǎn)錄病毒感染早期胚胎，由于整合只能發(fā)生在發(fā)育的晚期，故產(chǎn)生的是嵌合體，只有部分細(xì)胞或組織獲得外源基因。Jaenisch于1975年首次發(fā)現(xiàn)鼠白血病病毒(MLV)可以整合到宿主小鼠的基因組，原病毒基因可以傳遞給子代，但在新生動(dòng)物中卻幾乎不表達(dá)，這成為反轉(zhuǎn)錄病毒轉(zhuǎn)基因載體發(fā)展的一大障礙。2、逆轉(zhuǎn)錄病毒感染法Vander使用缺失MLV病毒LTR區(qū)增強(qiáng)子序列的重組逆轉(zhuǎn)錄病毒感染小鼠的8細(xì)胞胚胎，獲得轉(zhuǎn)基因小鼠，證明了逆轉(zhuǎn)錄病毒也許是通過(guò)LTR區(qū)增強(qiáng)子序列調(diào)節(jié)其基因的表達(dá)。之后Salter等用禽白血病病毒感染早期的雞胚胎，制備了轉(zhuǎn)基因雞。傳統(tǒng)逆轉(zhuǎn)錄病毒載體法的缺陷：宿主范圍狹窄（種屬特異性，即病毒膜蛋只和特異的細(xì)胞膜受體發(fā)生作用），僅能感染分裂細(xì)胞， 感染效率低慢病毒能感染各種非分裂細(xì)胞，其目的基因整合至靶細(xì)胞基因組能夠長(zhǎng)期表達(dá)，免疫反應(yīng)小等優(yōu)點(diǎn)成為了研究的熱點(diǎn)2002年，Lois等利用SINLV攜帶eGFP外源基因成功感染了小鼠受精卵Pfeifer等利用類似載體感染8、16細(xì)胞的小鼠桑椹胚，成功制備了轉(zhuǎn)基因小鼠這是首次在哺乳動(dòng)物中通過(guò)LV攜帶外源基因整合人宿主并有外源基因表達(dá)，整合了的外源基因可以遺傳給子代（F1代），并且在F1代中也有表達(dá)3、胚胎干細(xì)胞介導(dǎo)法胚胎干細(xì)胞（ES細(xì)胞）是從早期胚胎的內(nèi)細(xì)胞團(tuán)經(jīng)體外抑制分化培養(yǎng)建立起來(lái)的多能細(xì)胞系。通常利用一定方法如脂質(zhì)體介導(dǎo)、電擊或反轉(zhuǎn)錄病毒感染等，把外源基因?qū)敫杉?xì)胞中，將有功能的轉(zhuǎn)入基因整合到ES細(xì)胞基因組內(nèi)的非必需基因位點(diǎn)上，經(jīng)篩選培養(yǎng)，而后用于生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因動(dòng)物。20世紀(jì)80年代初，從小鼠囊胚的內(nèi)細(xì)胞團(tuán)分離出了胚胎干細(xì)胞。Thomas等（1987）首先對(duì)小鼠ES細(xì)胞進(jìn)行了基因打靶，然后移植進(jìn)入小鼠囊胚，將此重組胚移植進(jìn)入代孕母鼠，最后產(chǎn)出嵌合體仔鼠，通過(guò)相互交配獲得基因敲除的純合小鼠。基因打靶包括：基因敲除和基因敲入技術(shù)胚胎干細(xì)胞法是目前生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因小鼠的主要方法，并在研究基因功能和疾病模型研究方面作出貢獻(xiàn)使用胚胎干細(xì)胞法生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因小鼠有3個(gè)優(yōu)點(diǎn)：數(shù)量上的優(yōu)點(diǎn)，1個(gè)10cm的組織培養(yǎng)皿可以培養(yǎng)105個(gè)ES細(xì)胞，且都可以用于轉(zhuǎn)染試驗(yàn)；如果轉(zhuǎn)染的是細(xì)菌的抗生素基因，如新霉素磷酸基轉(zhuǎn)移酶、嚓吟霉素或者潮霉素抗性等基因，陽(yáng)性ES細(xì)胞則可以在抗生素篩選環(huán)境下生長(zhǎng)；在經(jīng)過(guò)轉(zhuǎn)染、抗生素篩選及冷凍保存后，經(jīng)過(guò)遺傳選擇的亞細(xì)胞系仍然會(huì)保留原始細(xì)胞系的特征。因此，使用ES細(xì)胞來(lái)生產(chǎn)嵌合體轉(zhuǎn)基因小鼠有時(shí)候比顯微注射法生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因小鼠更快或者效率更高。隨著核移植技術(shù)的發(fā)展，可把陽(yáng)性干細(xì)胞的核移入去核卵母細(xì)胞中，進(jìn)一步提高轉(zhuǎn)基因效率。小鼠的ES細(xì)胞系已經(jīng)建立，人的ES細(xì)胞系也己經(jīng)建立，但家畜如兔、豬、牛、羊的ES細(xì)胞研究進(jìn)展不大，只獲得一些類干細(xì)胞系。因此該方法的應(yīng)用受到限制，但應(yīng)用前景看好。Kuroiwa等（2004）通過(guò)敲除牛朊蛋白（PRNP）基因制作了無(wú)瘋牛病的牛。Yang等（2006）把體細(xì)胞核移植入源于同一母牛的去核卵子，克隆后激活的同體重組胚中基因重排要大大優(yōu)于異體重組胚，解決了異體克隆胚可能由于基因印記導(dǎo)致的核質(zhì)相互作用的不協(xié)調(diào)而導(dǎo)致的克隆動(dòng)物效率低的問(wèn)題；同體重組胚的囊胚發(fā)育率達(dá)38.5%，高于異體胚的22%；同體重組胚移植后克隆動(dòng)物出生率達(dá)23%，高于異體胚的5.6%。劉忠華等（2008）對(duì)脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染豬胎兒成纖維細(xì)胞的技術(shù)程序進(jìn)行了篩選，以綠色熒光蛋白（GFP）基因轉(zhuǎn)染后的陽(yáng)性細(xì)胞作為體細(xì)胞核移植的核供體，以體外成熟卵母細(xì)胞為核受體，構(gòu)建了綠色熒光蛋白轉(zhuǎn)基因克隆豬胚胎，將重構(gòu)胚移植于受體，在國(guó)內(nèi)首次通過(guò)體細(xì)胞核移植技術(shù)得到GFP陽(yáng)性轉(zhuǎn)基因克隆豬，并首次發(fā)現(xiàn)通過(guò)核移植路線生產(chǎn)的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物具有嵌合基因型，即僅在肌肉組織中無(wú)目的基因。目前影響克隆技術(shù)的應(yīng)用是由于其效率低，隨著去核方法、供體細(xì)胞和受體卵母細(xì)胞的融合效率、激活、以及重建胚培養(yǎng)等技術(shù)水平的提高，有學(xué)者認(rèn)為轉(zhuǎn)基因動(dòng)物克隆技術(shù)將有望成為21世紀(jì)創(chuàng)建遺傳工程動(dòng)物的主導(dǎo)技術(shù)。5、精子載體法精子載體法是將精子作為外源基因的載體，在受精過(guò)程中將外源基因?qū)雱?dòng)物胚胎，并使外源DNA整合到染色體中，從而使外源基因進(jìn)入子代的基因組中以精子為載體介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移主要通過(guò)以下途徑來(lái)實(shí)現(xiàn)的：體外精子轉(zhuǎn)染法：分精子與外源DNA直接共孵育法、體外電穿孔導(dǎo)入法和脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法體內(nèi)精子轉(zhuǎn)染法：又分為輸精管注射轉(zhuǎn)染法、曲細(xì)精管注射轉(zhuǎn)染法、睪丸注射轉(zhuǎn)染法等1971年，Bracket等首次證實(shí)精子具有吸附結(jié)合外源DNA能力，并將外源DNA在受精時(shí)攜帶進(jìn)入卵母細(xì)胞1992年，Lavitrano等應(yīng)用此法得到陽(yáng)性轉(zhuǎn)基因小鼠，并發(fā)現(xiàn)成熟精子頭部具有吸收外源DNA的能力，其吸收區(qū)域是具有特異性的，位于精子頭部的頂體后區(qū)，即靠近精核的區(qū)域沈新明等（2002）直接用人CMV啟動(dòng)子調(diào)控的增強(qiáng)型GFP表達(dá)載體注射到小鼠的曲精細(xì)管內(nèi)，最后通過(guò)與雌鼠交配，成功獲得了表達(dá)GFP的轉(zhuǎn)基因仔鼠袁進(jìn)等（2005）報(bào)道向通過(guò)向曲精細(xì)管內(nèi)注射外源DNA，結(jié)合對(duì)曲精細(xì)管電擊或電穿孔處理，使外源基因進(jìn)入睪丸生精細(xì)胞，然后將這些處理的雄鼠與母鼠交配，得到的小鼠中有一組的陽(yáng)性檢測(cè)率達(dá)25%Shen等（2006）將方法簡(jiǎn)化，直接向雄兔睪丸內(nèi)注射攜帶GFP表達(dá)的外源DNA及DMSO的介質(zhì)，使DNA進(jìn)入睪丸細(xì)胞和生精細(xì)胞；一個(gè)月后與雌兔交配，所產(chǎn)生后代的56%仔兔能高效地表達(dá)所導(dǎo)入的外源基因李碧春等（2008）以重組GFP基因?yàn)闃?biāo)記，首次采用公雞睪丸內(nèi)轉(zhuǎn)染精原干細(xì)胞和體外轉(zhuǎn)染SSCs再移植的方法成功地生產(chǎn)出轉(zhuǎn)基因雞，并在家鴨和家雞上轉(zhuǎn)染功能基因進(jìn)行驗(yàn)證。迄今已在12種動(dòng)物中獲得了轉(zhuǎn)基因后代，包括小鼠、家兔、牛、豬和雞等精子載體法利用精子的自然屬性克服人為機(jī)械操作給胚胎造成的損傷，具有簡(jiǎn)便易行、耗費(fèi)低、轉(zhuǎn)染率高和適應(yīng)性廣等特點(diǎn)存在問(wèn)題：外源基因隨機(jī)整合；無(wú)法利用此法隨意地獲得理想的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物6、胞漿內(nèi)單精子注射法（ICSI）精子載體法中精子孵育前的預(yù)處理通常使精子的受精能力下降，于是許多學(xué)者嘗試借鑒醫(yī)學(xué)上的輔助生殖技術(shù)ICSI使處理精子受精。精子胞質(zhì)內(nèi)顯微受精技術(shù)是借助顯微操作儀，將一個(gè)精子或生精細(xì)胞直接注入卵母細(xì)胞質(zhì)內(nèi)，從而完成受精的過(guò)程。它降低了對(duì)精子各種指標(biāo)的要求，使各種在體內(nèi)外不可能發(fā)生正常受精的卵子受精，同時(shí)可以避免多精子受精，也為研究異種間受精提供了有效的途徑。1999年美國(guó)科學(xué)家Perry等首次應(yīng)用ICSI技術(shù)成功地獲得了轉(zhuǎn)基因小鼠；隨即研究者們分別在獼猴、豬上進(jìn)行ICSI轉(zhuǎn)基因嘗試，胚胎轉(zhuǎn)基因陽(yáng)性率也很高，但最終并沒(méi)有得到出生的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物。2006年Kurome等把精子與攜帶有人白蛋白（hALB）基因和綠色熒光蛋白（GFP）基因的DNA序列片斷共孵化，通過(guò)ICSI方法生產(chǎn)的胚胎移植后生產(chǎn)出一頭含有hALB和GFP基因的轉(zhuǎn)基因小豬。優(yōu)點(diǎn)：胞漿內(nèi)單精子注射仍需顯微操作，但與原核注射相比難度降低很多；對(duì)一些卵質(zhì)透明度不好的物種（如牛、羊、豬），ICSI更能體現(xiàn)出技術(shù)上的優(yōu)勢(shì)；再有，精子注射針的尖端截面積約為顯微注射針的100倍左右，對(duì)DNA沒(méi)有任何剪切，尤其適合基因組DNA、BAC或YAC庫(kù)、DNA大片段操作同時(shí)ICSI法還具有受精率比較高、多精受精率低、排除透明帶和卵質(zhì)膜對(duì)精子入卵的阻礙作用，其受精率不受精子濃度、形態(tài)和活力的影響等一系列優(yōu)點(diǎn)缺點(diǎn)：通過(guò)該方法生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因動(dòng)物，體外發(fā)育率低，仍許多問(wèn)題有待解決7、卵母細(xì)胞載體法卵母細(xì)胞是一種全能細(xì)胞，可隨著細(xì)胞分化、胚胎發(fā)育，把基因組所貯存的全部遺傳信息擴(kuò)大到生物體所有的細(xì)胞中采用受精卵前卵母細(xì)胞作為外源基因的導(dǎo)入點(diǎn)，讓目的基因比精子染色質(zhì)先進(jìn)入卵細(xì)胞，這樣只要發(fā)生外源基因的整合，其后的受精卵分裂、直至發(fā)育成為成熟的個(gè)體，每一個(gè)細(xì)胞就肯定攜帶外源基因，避免了嵌合體動(dòng)物的產(chǎn)生Carballada等（2000）對(duì)脂質(zhì)體介導(dǎo)外源基因在體外轉(zhuǎn)染卵母細(xì)胞和胚胎進(jìn)行初步研究，證明這是一條簡(jiǎn)單有效的轉(zhuǎn)基因途徑Jonathan等（2004）發(fā)現(xiàn)卵巢中存在卵原干細(xì)胞，將外源基因整合到卵原干細(xì)胞中，可獲得整合有外源基因的卵子，受精后可獲得整合有外源基因的動(dòng)物Yang等（2007）直接對(duì)小鼠的卵巢注射綠色熒光蛋白基因，得到轉(zhuǎn)基因小鼠，后代陽(yáng)性率達(dá)54%，并發(fā)現(xiàn)6代以內(nèi)的轉(zhuǎn)基因小鼠都具有較好的遺傳穩(wěn)定性同樣方法制作轉(zhuǎn)基因雞，陽(yáng)性率高達(dá)67.65%優(yōu)點(diǎn)：通過(guò)性腺轉(zhuǎn)基因，操作簡(jiǎn)便、技術(shù)要求較低、難度較小，將成為制作轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的一個(gè)方向,有可能用于如豬和牛這樣的大動(dòng)物的轉(zhuǎn)基因。不足：仍然存在外源基因隨機(jī)整合進(jìn)入宿主基因組的問(wèn)題，還無(wú)法利用此方法隨意地獲得理想的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物。常見的動(dòng)物細(xì)胞基因轉(zhuǎn)染方法1、電穿孔技術(shù)1982年Neumann.E將外源DNA在電場(chǎng)條件下導(dǎo)入小鼠真核細(xì)胞，從而實(shí)現(xiàn)了基因重組和外源基因的功能研究。隨之這一技術(shù)得到廣泛應(yīng)用：細(xì)菌、酵母、植物和動(dòng)物細(xì)胞的體外應(yīng)用；器官植入、皮膚損傷修復(fù)的電化學(xué)療法、疫苗的注射等體內(nèi)體外臨床應(yīng)用；小分子或大分子物質(zhì)功能性研究；研制轉(zhuǎn)基因動(dòng)物、轉(zhuǎn)基因植物新品種等。電穿孔前后細(xì)胞質(zhì)膜的變化示意圖電穿孔技術(shù)主要包括電轉(zhuǎn)染和電融合：電轉(zhuǎn)染是利用脈沖電場(chǎng)將外源DNA導(dǎo)入細(xì)胞中，當(dāng)細(xì)胞處于高壓電場(chǎng)時(shí)，瞬時(shí)電脈沖可將細(xì)胞膜穿孔產(chǎn)生可逆性孔徑，從而DNA進(jìn)入細(xì)胞與染色體整合；電融合是利用高強(qiáng)度的電場(chǎng)脈沖，引起相鄰的細(xì)胞融合。電穿孔原理和應(yīng)用示意圖2、磷酸鈣—DNA共沉淀法基因轉(zhuǎn)移技術(shù)這種方法是受二價(jià)金屬離子能促進(jìn)細(xì)胞吸收外源DNA的啟發(fā)而發(fā)展起來(lái)的。當(dāng)核酸以磷酸鈣—DNA共沉淀物的形式在時(shí)，細(xì)胞攝取DNA的能力顯著加強(qiáng)。轉(zhuǎn)移效率較低，僅有1~5%的外源DNA可以進(jìn)入受體細(xì)胞核中，僅約1%的DNA可以在細(xì)胞中穩(wěn)定表達(dá)。3、脂質(zhì)載體包埋法將需轉(zhuǎn)移的外源DNA或RNA包裹于脂質(zhì)體內(nèi)，由于脂質(zhì)體具有磷脂雙層結(jié)構(gòu)，與細(xì)胞膜類似，因此可以與受體細(xì)胞膜融合，從而將外源DNA轉(zhuǎn)入宿主細(xì)胞。這種方法轉(zhuǎn)基因效率高?；虮磉_(dá)產(chǎn)物選擇劑抗生素類

neo基因

tpt基因博萊霉素抗性基因除草劑類

csr1-1基因

aroA基因

tfdA基因代謝試劑類

dhfr基因新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶Ⅱ潮霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶結(jié)合蛋白乙酰乳酸合成酶5-烯醇丙酮莽草酰-3-磷酸合成酶2,4-二氯苯氧乙酸-氧化物酶二氫葉酸還原酶卡那霉素、新霉素潮霉素博萊霉素氯磺隆草甘膦2,4-D甲氨蝶呤五、轉(zhuǎn)基因作物常用的標(biāo)識(shí)基因--容易被遺忘的角落1、標(biāo)記基因的安全技術(shù)目前是利用抗生素、除草劑抗性基因作為選擇標(biāo)記基因進(jìn)行篩選，但完成篩選后，這些標(biāo)記基因就變成不需要和多余甚至是有害的。潛在危險(xiǎn)性包括：標(biāo)記基因通過(guò)花粉和種子等途徑在種群之間擴(kuò)散，可能轉(zhuǎn)移到雜草，產(chǎn)生抗除草劑的“超級(jí)雜草”；向其他植物中轉(zhuǎn)移，從而對(duì)生態(tài)環(huán)境和生物多樣性產(chǎn)生潛在的危害；在健康領(lǐng)域，標(biāo)記基因及其產(chǎn)物可能對(duì)人或動(dòng)物健康有害，標(biāo)記基因可能被轉(zhuǎn)移到人或動(dòng)物的腸道微生物或上皮細(xì)胞，從而降低抗生素在臨床治療中的有效性。目前提高標(biāo)記基因安全性的策略主要有：一是利用無(wú)爭(zhēng)議的生物安全標(biāo)記基因。已發(fā)現(xiàn)的生物安全標(biāo)記基因有綠色熒光蛋白基因、甜菜醛脫氫酶基因、6-磷酸甘露糖異構(gòu)酶基因、木糖異構(gòu)酶基因、核糖醇操縱子等。二是轉(zhuǎn)化時(shí)使用標(biāo)記基因，獲得轉(zhuǎn)基因植株后再將其去除。去除轉(zhuǎn)基因作物中標(biāo)記基因主要采用共轉(zhuǎn)化、位點(diǎn)特異重組酶系統(tǒng)、轉(zhuǎn)座子和同源重組等方法。三是利用無(wú)選擇標(biāo)記基因的轉(zhuǎn)化系統(tǒng)。2、轉(zhuǎn)基因檢測(cè)技術(shù)根據(jù)表型的檢測(cè)技術(shù)——直接觀察轉(zhuǎn)基因賦予生物的外表特征，包括發(fā)芽測(cè)定、紙巾測(cè)定和生物測(cè)定。前兩種主要用于分析轉(zhuǎn)基因作物對(duì)除草劑的耐受性質(zhì)，后者檢查殺蟲能力。根據(jù)產(chǎn)物蛋白的檢測(cè)方法——以產(chǎn)物蛋白作為抗原與相應(yīng)抗體的免疫反應(yīng)根據(jù)DNA的檢測(cè)方法——PCR法，由于許多轉(zhuǎn)基因結(jié)構(gòu)都被列為商業(yè)機(jī)密，給引物設(shè)計(jì)帶來(lái)困難其它新技術(shù)——質(zhì)譜分析、毛細(xì)管電泳、近紅外光譜、DNA芯片、光纖生物傳感器六、轉(zhuǎn)基因技術(shù)的應(yīng)用1、醫(yī)藥——藥物、疫苗、基因治療2、農(nóng)業(yè)——轉(zhuǎn)基因植物、動(dòng)物3、食品——基因工程菌替代凝乳酶生產(chǎn)奶酪4、能源——三次采油工藝：采用轉(zhuǎn)基因技術(shù)構(gòu)建能產(chǎn)生大量二氧化碳和甲烷等氣體的工程菌，在油層中產(chǎn)生氣體增加壓力，而且分泌高聚物、糖酯等表面活性劑，降低油層表面張力使原油從巖石、沙土中松開，提高采油量；——纖維素酶——乙醇；氫氣——紫色硫細(xì)菌基因5、環(huán)境——高效降解殺蟲劑和除草劑的基因工程菌；——抗汞污染的轉(zhuǎn)基因煙草；——降解鹵代芳烴、尼龍寡聚物的工程菌；——清除石油污染的基因工程菌轉(zhuǎn)基因技術(shù)對(duì)農(nóng)業(yè)發(fā)展的意義——農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中存在的主要問(wèn)題主要農(nóng)作物的病蟲害逐年增加高產(chǎn)品種需肥量大水資源日趨缺乏鹽堿地等限制了種植與產(chǎn)量主要農(nóng)作物品質(zhì)差且產(chǎn)量有限轉(zhuǎn)基因生物技術(shù)有有爭(zhēng)議的問(wèn)題1）食品安全爭(zhēng)議 2）生物富集爭(zhēng)議3）藥食關(guān)系爭(zhēng)議 4）生態(tài)影響爭(zhēng)議5）基因污染爭(zhēng)議 6）全球監(jiān)管爭(zhēng)議7）機(jī)遇泡沫爭(zhēng)議七、我國(guó)轉(zhuǎn)基因生物安全管理法律法規(guī)法律法規(guī)名稱 頒布時(shí)間 頒布部門《基因工程安全管理辦法》 1993 科技部《新生物制品審批辦法》 1999 農(nóng)業(yè)部《農(nóng)業(yè)轉(zhuǎn)基因生物安全管理?xiàng)l例》 2001 農(nóng)業(yè)部《農(nóng)業(yè)轉(zhuǎn)基因生物進(jìn)口安全管理辦法》 2001 農(nóng)業(yè)部《農(nóng)業(yè)轉(zhuǎn)基因生物標(biāo)識(shí)管理辦法》 2001 農(nóng)業(yè)部《農(nóng)業(yè)轉(zhuǎn)基因生物安全評(píng)價(jià)管理辦法》 2001 農(nóng)業(yè)部《農(nóng)