阿帕替尼和替莫唑胺的協(xié)同作用

阿帕替尼和替莫唑胺的協(xié)同作用阿帕替尼是一種小分子多靶向酪氨酸激酶抑制劑，廣泛應(yīng)用于各種實(shí)體腫瘤的治療。本研究探討阿帕替尼是否具有治療膠質(zhì)瘤的潛力。采用細(xì)胞計(jì)數(shù)Kit8和菌落形成法測(cè)定p53、egfr突變的U251MG膠質(zhì)瘤細(xì)胞和野生型U87MGATCC膠質(zhì)瘤細(xì)胞的細(xì)胞活力。采用流式細(xì)胞術(shù)、浸潤(rùn)法和創(chuàng)傷愈合法檢測(cè)膠質(zhì)瘤細(xì)胞的凋亡和侵襲遷移能力。研究了阿帕替尼聯(lián)合替莫喳胺(替莫喳胺)治療膠質(zhì)瘤的可能性。結(jié)果表明，阿帕替尼通過促進(jìn)p53和egfrmu突變的野生型膠質(zhì)瘤細(xì)胞凋亡，顯著抑制細(xì)胞增殖和集落形成。阿帕替尼治療后細(xì)胞的侵襲和遷移能力明顯下降?？偟膩碚f，本研究提示阿帕替尼與替莫喳胺在膠質(zhì)瘤中的協(xié)同抗腫瘤作用，為阿帕替尼在膠質(zhì)瘤治療中的應(yīng)用提供依據(jù)。惡性膠質(zhì)瘤是原發(fā)性中樞神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤中最常見的類型，占腦和中樞神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤的80%。雖然已經(jīng)有了較大的進(jìn)步，在手術(shù)治療，術(shù)后化療和放療，惡性神經(jīng)膠質(zhì)瘤患者的預(yù)后仍然貧窮，診斷后平均生存大約1年。根據(jù)中國神經(jīng)膠質(zhì)瘤基因組圖譜(CGGA)統(tǒng)計(jì)，總生存期(OS)的膠質(zhì)母細(xì)胞瘤(GBM),世界衛(wèi)生組織(世衛(wèi)組織)等級(jí)IV)病人只有14.4個(gè)月，6個(gè)月，1-3年期和5年期的OS率87,61年15-9%，⑷膠質(zhì)瘤的侵襲性來源于惡性膠質(zhì)瘤細(xì)胞的增殖和侵襲能力，因此控制這些特點(diǎn)是膠質(zhì)瘤治療的潛在治療策略。Temozolomide(替莫唑胺)是一種前體藥物形成O6-methylguanine(O6-MeG)加合物，通過與脫氧胸苷殘留不匹配，導(dǎo)致細(xì)胞毒性誘導(dǎo)處理后細(xì)胞凋亡的錯(cuò)配修復(fù)系統(tǒng)。TMZ在生理pH值下轉(zhuǎn)化為活性化合物3-甲基(triazen-1-yl)咪唑-4-羧酰胺⑺。替莫唑胺的活化形式容易穿過血腦屏障,,因此，通常用于治療原發(fā)性和繼發(fā)性顱內(nèi)腫瘤。盡管替莫唑胺在臨床上取得了成功，但仍有大量患者對(duì)該藥物反應(yīng)不佳，至少部分原因是腫瘤細(xì)胞對(duì)損傷性細(xì)胞死亡的固有抵抗。因此，需要確定一種新的聯(lián)合治療膠質(zhì)瘤的策略。膠質(zhì)瘤是一種高血管性腫瘤，富含血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)，促進(jìn)血管生成。因此，抗vegf單克隆抗體貝伐珠單抗和抗vegf受體酪氨酸激酶抑制劑(anti-VEGFreceptor,VEGFR)，包括舒尼替尼和索拉非尼，被用于膠質(zhì)瘤患者的治療。阿帕替尼是VEGF受體2(VEGFR2)細(xì)胞內(nèi)酪氨酸殘基磷酸化的口服第二代抑制劑。阿帕替尼可防止VEGF誘導(dǎo)的VEGFR2磷酸化以及隨后的下游信號(hào)通路，這些信號(hào)通路對(duì)VEGF的生物學(xué)效應(yīng)負(fù)責(zé)。臨床前研究表明，阿帕替尼在不同類型惡性腫瘤患者中具有抗腫瘤活性。本研究探討阿帕替尼對(duì)膠質(zhì)瘤的治療作用。采用細(xì)胞計(jì)數(shù)kit-8法、菌落形成法、基質(zhì)入侵法和創(chuàng)傷愈合法，研究了阿帕替尼對(duì)細(xì)胞增殖和侵襲的體外抑制作用。研究了阿帕替尼聯(lián)合替莫唑胺治療膠質(zhì)瘤的潛力。由于膠質(zhì)瘤本質(zhì)上是高血管性的，在臨床試驗(yàn)中，舒尼替尼和索拉非尼被用于控制異常的血管。然而，內(nèi)阻限制了VEGF-VEGFR通路第一代抑制劑的使用。既往臨床研究表明，阿帕替尼治療復(fù)發(fā)性膠質(zhì)瘤療效顯著，且能突破腦血屏障。然而，其作用機(jī)制尚不清楚。在本研究中，我們觀察到阿帕替尼治療的膠質(zhì)瘤細(xì)胞具有抗腫瘤活性（顯著抑制細(xì)胞增殖和侵襲）。阿帕替尼也被證明可以提高替莫唑胺在膠質(zhì)瘤細(xì)胞中的抗腫瘤活性。所有實(shí)驗(yàn)均采用兩種不同突變狀態(tài)的膠質(zhì)瘤細(xì)胞系進(jìn)行?？偟膩碚f，本研究提示阿帕替尼可能為膠質(zhì)瘤提供一種新的治療策略，尤其是與替莫唑胺聯(lián)合應(yīng)用。VEGFR2在內(nèi)皮細(xì)胞中表達(dá)，在腫瘤血管中上調(diào)。VEGFR2通過自分泌或旁分泌VEGF磷酸化已經(jīng)被證明可以激活ERK、Akt、FAK和MAPK通路，這些通路調(diào)節(jié)細(xì)胞的增殖和遷移。鑒于VEGFR2在膠質(zhì)瘤細(xì)胞中高度表達(dá)，我們推測(cè)VEGFR2在膠質(zhì)瘤細(xì)胞的侵襲和增殖中發(fā)揮重要作用。VEGFR2通路酪氨酸激酶抑制劑（TKIs）、舒尼替尼和索拉非尼曾被用于治療膠質(zhì)瘤患者。本研究顯示，VEGFR2在膠質(zhì)瘤細(xì)胞中高表達(dá)，阿帕替尼對(duì)U251MG和U-87MGATCC細(xì)胞中p-VEGFR2、p-Akt和p-ERK蛋白的表達(dá)具有濃度依賴性。阿帕替尼對(duì)p53-和egfr突變的U251MG和野生型U-87MGATCC細(xì)胞也有明顯的抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖和集落形成，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的作用。在阿帕替尼治療的膠質(zhì)瘤細(xì)胞中，膠質(zhì)瘤細(xì)胞的侵襲和遷移受到抑制。這些結(jié)果為阿帕替尼在膠質(zhì)瘤細(xì)胞中的抗腫瘤活性提供了證據(jù)。然而，還需要進(jìn)一步的體內(nèi)研究來證實(shí)阿帕替尼的抗腫瘤活性。獲得對(duì)替莫唑胺的耐藥性仍然是膠質(zhì)母細(xì)胞瘤治療中的一個(gè)局限；大約90%復(fù)發(fā)的膠質(zhì)母細(xì)胞瘤對(duì)額外的替莫唑胺治療有耐藥性。選擇性內(nèi)皮素受體拮抗劑聯(lián)合化療已被研究作為一種治療策略，以改善膠質(zhì)瘤患者的臨床結(jié)果。馬西替坦是一種雙重內(nèi)皮素受體拮抗劑，聯(lián)合替莫唑胺治療耐受性良好，反應(yīng)持久，值得在膠質(zhì)母細(xì)胞瘤中進(jìn)行臨床評(píng)價(jià)。通過下調(diào)o-6-甲基鳥嘌吟DNA甲基轉(zhuǎn)移酶、n-甲基嘌吟DNA糖基化酶和Rad51重組酶，ER應(yīng)激誘導(dǎo)膠質(zhì)瘤細(xì)胞對(duì)替莫唑胺藥物敏感。本研究提示，在替莫唑胺中添加阿帕替尼可提高化療的療效。與未處理細(xì)胞相比，單獨(dú)應(yīng)用阿帕替尼或替莫唑胺治療膠質(zhì)瘤細(xì)胞凋亡增加，增殖和侵襲減少。值得注意的是，與單獨(dú)應(yīng)用替莫唑胺相比，阿帕替尼聯(lián)合應(yīng)用替莫唑胺對(duì)細(xì)胞增殖和侵襲的抑制作用增強(qiáng)。這些發(fā)現(xiàn)證明了阿帕替尼和替莫唑胺在膠質(zhì)瘤細(xì)胞中的協(xié)同抗腫瘤作用，可能解釋了聯(lián)合治療復(fù)發(fā)膠質(zhì)瘤的臨床療效。進(jìn)一步的體內(nèi)研究需要證明阿帕替尼和替莫唑胺在膠質(zhì)瘤中的協(xié)同抗腫瘤作用。既往研究表明Akt和ERK在替莫唑胺耐藥膠質(zhì)瘤細(xì)胞中的活化增強(qiáng)。Akt過表達(dá)抑制了src-沉默介導(dǎo)的替莫唑胺細(xì)胞毒性增強(qiáng)作用。用雌激素治療receptor-8受體激動(dòng)劑(liquiritigenin)增強(qiáng)替莫唑胺-sensitivity神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞通過抑制mTOR/PI3K/Akt通路。TGF-81-dependent激活SMAD/ERK信號(hào)參與結(jié)締組織增長(zhǎng)factor-mediated替莫唑胺-resistance在神經(jīng)膠質(zhì)瘤。MEK-ERK-MDM2-p53信號(hào)通路靶向結(jié)合替莫唑胺被認(rèn)為是治療膠質(zhì)母細(xì)胞瘤的一種新的有前途的治療策略。在本研究中，阿帕替尼對(duì)膠質(zhì)瘤細(xì)胞Akt/ERK活化的抑制作用，可能與阿帕替尼與替莫唑胺在膠質(zhì)瘤中的協(xié)同抗腫瘤作用有關(guān)。綜上所述，阿帕替尼具有高效的抗腫