流式細(xì)胞術(shù)基本原理

流式細(xì)胞術(shù)基本原理第1頁/共87頁流式細(xì)胞術(shù)

---原理、操作及應(yīng)用第2頁/共87頁教學(xué)參考書實(shí)用流式細(xì)胞術(shù)彩色圖譜。王樹奎、周振英主編。2004.4臨床流式細(xì)胞分析。王建中主編。上海科學(xué)技術(shù)出版社。2005.8流式細(xì)胞術(shù)原理與應(yīng)用教程。吳后男編。北京大學(xué)醫(yī)學(xué)出版社。2008.2實(shí)用流式細(xì)胞術(shù)-血液病篇。劉艷榮主編。北京大學(xué)醫(yī)學(xué)出版社。2010.9流式細(xì)胞術(shù)。陳朱波、曹雪濤編?？茖W(xué)出版社。2010.10第3頁/共87頁主要內(nèi)容一、流式細(xì)胞儀結(jié)構(gòu)和原理流式細(xì)胞術(shù)簡(jiǎn)介流式細(xì)胞儀的結(jié)構(gòu)組成流式細(xì)胞儀的光信號(hào)檢測(cè)流式細(xì)胞術(shù)數(shù)據(jù)的存貯、顯示與分析流式分選二、流式細(xì)胞術(shù)操作與技巧三、流式細(xì)胞術(shù)在生物醫(yī)學(xué)中的應(yīng)用第4頁/共87頁1.1流式細(xì)胞術(shù)簡(jiǎn)介流式細(xì)胞術(shù)（FlowCytometry，F(xiàn)CM）是以流式細(xì)胞儀為檢測(cè)手段的一項(xiàng)能快速、精確的對(duì)單個(gè)細(xì)胞(或生物學(xué)顆粒)的理化特性進(jìn)行多參數(shù)定量分析和分選的技術(shù)。流式細(xì)胞儀（FlowCytometer）是集細(xì)胞與分子生物學(xué)、流體力學(xué)、激光技術(shù)、光電子技術(shù)、計(jì)算機(jī)技術(shù)、細(xì)胞熒光化學(xué)技術(shù)、單克隆抗體技術(shù)為一體的一種新型高科技儀器。第5頁/共87頁流式細(xì)胞術(shù)的特點(diǎn)檢測(cè)對(duì)象：?jiǎn)渭?xì)胞懸液或生物顆粒；檢測(cè)參數(shù)：多參數(shù)；檢測(cè)特點(diǎn)：?jiǎn)渭?xì)胞水平分析；檢測(cè)速度：高速，最高達(dá)上萬個(gè)細(xì)胞/秒；檢測(cè)結(jié)果：精度高、準(zhǔn)確性好；可對(duì)目標(biāo)細(xì)胞進(jìn)行分選；第6頁/共87頁流式：?jiǎn)蝹€(gè)細(xì)胞分析，收集每個(gè)細(xì)胞的數(shù)據(jù)，更精準(zhǔn)；WB：群體分析，得到多個(gè)細(xì)胞的平均值。第7頁/共87頁流式細(xì)胞儀的發(fā)展及商品化1934Moldavanl:Firsttry(固定式細(xì)胞分析-流動(dòng)式)；1953Crosland-Taylor:鞘流系統(tǒng)(解決難題)；1956Coulter原理(血細(xì)胞計(jì)數(shù)器)；1965Kamentsky:分光光度計(jì)定量細(xì)胞成分和散射光應(yīng)用；1967Kamentsky等設(shè)計(jì)了細(xì)胞分選的裝置；1969Vandilla等:第一臺(tái)熒光檢測(cè)細(xì)胞計(jì)(鞘流聚焦、激光)；1972斯坦福大學(xué):研制出熒光激活細(xì)胞分選儀(FACS)；1973BD公司與斯坦福大學(xué)合作，研制生產(chǎn)第一臺(tái)商用流

式細(xì)胞儀-FACSⅠ。1975Kohler和Milstein:單克隆抗體技術(shù)(促進(jìn)流式發(fā)展)。第8頁/共87頁1979年國(guó)家科委重點(diǎn)項(xiàng)目：研制國(guó)內(nèi)第一臺(tái)激光流式細(xì)胞儀；1982年國(guó)內(nèi)第一臺(tái)三參數(shù)激光流式細(xì)胞儀誕生；1984年國(guó)家科委組織科研成果的鑒定驗(yàn)收；1985年獲國(guó)家衛(wèi)生部科技成果乙等獎(jiǎng)；1985年--1990年靈敏度、信噪比、更多參數(shù)；流式分選儀研制開發(fā)；計(jì)算機(jī)四參數(shù)軟件；樣品制備、醫(yī)學(xué)生物學(xué)應(yīng)用。第9頁/共87頁流式細(xì)胞儀的分類分析型流式細(xì)胞儀細(xì)胞樣本分析后最終進(jìn)入廢液桶，不能回收利用。分選型流式細(xì)胞儀既能流式分析，還能對(duì)分析的目的細(xì)胞進(jìn)行分選；進(jìn)樣管道較長(zhǎng)，還需要保持無菌狀態(tài)，所以分選型流式細(xì)胞儀一般只用于分選。第10頁/共87頁BD公司分析型流式細(xì)胞儀FACSCalibur雙激光四色，市場(chǎng)覆蓋率最高LSRII雙激光六色，三激光八色，四激光十色，分析型最高配FACSCantoII雙激光六色，三激光八色FACSVerse雙激光六色，三激光八色第11頁/共87頁BD公司分選型流式細(xì)胞儀FACSVantageSEFACSAriaIIIInflux第12頁/共87頁BeckmanCoulter流式細(xì)胞儀EpicsXL單激光四色，市場(chǎng)覆蓋率高，分析型CyAn三激光九色，分析型FC500單激光或雙激光五色，市場(chǎng)覆蓋率高，分析型Gallios三激光十色，分析型MoFloXDP高端分選型第13頁/共87頁1.2流式細(xì)胞儀的結(jié)構(gòu)組成液流系統(tǒng)流動(dòng)室液流驅(qū)動(dòng)系統(tǒng)光學(xué)系統(tǒng)激發(fā)光源光束收集系統(tǒng)電子系統(tǒng)光電轉(zhuǎn)換器數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)細(xì)胞分選系統(tǒng)噴嘴電偏轉(zhuǎn)板樣本收集器第14頁/共87頁1.2.1液流系統(tǒng)鞘流技術(shù)：根據(jù)層流原理發(fā)展起來的技術(shù)，可以實(shí)現(xiàn)兩種液體的同軸流動(dòng)，樣本細(xì)胞流位于軸心穩(wěn)定流動(dòng)，外面包裹有鞘液(sheath)。流體動(dòng)力學(xué)聚焦：穩(wěn)定的液流從截面積較大的部分流入截面積較小的部分后，有一個(gè)聚焦收縮作用，細(xì)胞流直徑被約束在10-20um，避免了多個(gè)細(xì)胞重疊進(jìn)入檢測(cè)區(qū)。鞘液鞘液細(xì)胞流激光照射點(diǎn)流體動(dòng)力學(xué)聚焦示意圖第15頁/共87頁（一）流動(dòng)室和液流驅(qū)動(dòng)系統(tǒng)流動(dòng)室(flowcell,flowchamber)是流式細(xì)胞儀的核心部件。流動(dòng)室中，被測(cè)細(xì)胞逐個(gè)通過，并在此與激光正交。進(jìn)樣孔熒光信號(hào)激光束鞘液Sheath流動(dòng)室結(jié)構(gòu)圖：?jiǎn)渭?xì)胞發(fā)生器第16頁/共87頁液流驅(qū)動(dòng)系統(tǒng)第17頁/共87頁（二）進(jìn)樣速率控制10psi10.2psi10psi10.8psi通過改變樣本壓力可以調(diào)節(jié)樣本的進(jìn)樣速率，而這并不是提高樣本流的流速，而是改變了細(xì)胞之間的距離。高速時(shí)樣本流變寬，單位時(shí)間內(nèi)流經(jīng)激光照射區(qū)的細(xì)胞數(shù)就增加，這樣會(huì)導(dǎo)致變異系數(shù)增加。第18頁/共87頁1.2.2光學(xué)系統(tǒng)（一）激發(fā)光源：激光器氣體激光器：氬離子(488nm、355nm)、氦氖(633nm)、氪離子(647nm)、氪氬(568nm)；染料激光器：如氬離子激光泵浦的Rhodomin6G水溶液染料激光器，發(fā)出550-650nm可變波長(zhǎng)激發(fā)光；半導(dǎo)體激光器：價(jià)格低、結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單、壽命長(zhǎng)。BD的FACSCalibur已采用635nm半導(dǎo)體激光器。激光特點(diǎn)：?jiǎn)尾ㄩL(zhǎng)、高能量、小發(fā)射角、高穩(wěn)定性光照?，F(xiàn)在儀器常配有儀器選配2-4根激光器，波長(zhǎng)多為488nm、633nm和355nm、405nmUV；第19頁/共87頁（二）光束成行系統(tǒng)第20頁/共87頁FCM的單細(xì)胞照明技術(shù)：這種橢圓形光斑的檢測(cè)區(qū)保證樣本中的細(xì)胞是一個(gè)一個(gè)分別受到最大光照。細(xì)胞流動(dòng)方向第21頁/共87頁（三）光收集系統(tǒng)濾光片的組成長(zhǎng)通濾片(LP)：只允許特定波長(zhǎng)以上的光束通過；短通濾片(SP)：只允許特定波長(zhǎng)以下的光束通過；帶通濾片(BP)：只允許一定波長(zhǎng)范圍內(nèi)的光束通過。Long

passShortpassBandpass460500540SP500LP500BP500/50460500540460500540第22頁/共87頁第23頁/共87頁FACSCalibur流式細(xì)胞儀信號(hào)檢測(cè)系統(tǒng)透射光路第24頁/共87頁全反射光路FACSAria流式細(xì)胞儀器信號(hào)檢測(cè)系統(tǒng)PE-Cy7PerCP-Cy5.5PE-TexasRedPEFITCSSC第25頁/共87頁1.2.3電子系統(tǒng)光電檢測(cè)器將光信號(hào)轉(zhuǎn)換成電子信號(hào)。前置放大電路將信號(hào)等比例放大，輸出電脈沖信號(hào)。模數(shù)轉(zhuǎn)換器將模擬的電脈沖信號(hào)轉(zhuǎn)換成數(shù)字信號(hào)。數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)計(jì)算機(jī)系統(tǒng)數(shù)據(jù)采集、分析。第26頁/共87頁（一）光電檢測(cè)器(photodetector)光電二極管(photodiode)光靈敏度低，測(cè)定強(qiáng)信號(hào)（FSC）；光電倍增管(photomultiplier,PMT)光靈敏度高，測(cè)定弱信號(hào)（SSC,FL1,FL2,FL3,FL4)。PMT前向散射光光電二極管第27頁/共87頁（二）電信號(hào)兩種放大方式由于光信號(hào)比較弱，需將其等比例放大，方便計(jì)算機(jī)分析處理，一般信號(hào)的放大可以使用線性或?qū)?shù)兩種方式。

線性(linear;lin)對(duì)數(shù)(logarithmic;log)一般FSC和SSC變異范圍較小，故使用線性放大；熒光信號(hào)變異范圍較大，多使用對(duì)數(shù)放大。第28頁/共87頁（三）電脈沖信號(hào)的面積A、高度H和寬度WCreationofaVoltagePulseTimeVoltsPulseAreaPulseHeightPulseWidth0QuantificationofaVoltagePulseWidth=Area/Height第29頁/共87頁光信號(hào)電信號(hào)數(shù)字信號(hào)第30頁/共87頁通道(channel)

一個(gè)光電檢測(cè)器就是一個(gè)通道，有多少個(gè)光電二極管/倍增管，就有多少個(gè)通道：散射光通道:FSC通道和SSC通道；熒光通道通道命名方式：以FL(fluorescence)加數(shù)字命名，如FL1、FL2、FL3等。以該通道接收的主要熒光素命名，如FITC通道、PE通道、APC通道等。Forexample：FACSCalibur有488nm和633nm兩根激光器，488nm能檢測(cè)FSC、SSC、FL1(FITC)、FL2(PE)、FL3(PerCP)，635能檢測(cè)FL4(APC)，代表Calibur有6個(gè)通道，最多能同時(shí)檢測(cè)4個(gè)熒光，6種參數(shù)。第31頁/共87頁1.3流式細(xì)胞術(shù)光信號(hào)檢測(cè)光信號(hào)的類型散射光信號(hào)：與標(biāo)記熒光素?zé)o關(guān)，是細(xì)胞的固有參數(shù)。前向散射光(forwardscatter,FSC);側(cè)向散射光(sidescatter,SSC).熒光信號(hào)自發(fā)熒光：微弱特異熒光：標(biāo)記的熒光素分子發(fā)出

的熒光，比自發(fā)熒光強(qiáng)很多倍。第32頁/共87頁1.3.1散射光信號(hào)（一）前向散射光FSC

FSC信號(hào)方向與激光束平行，偏離度一般在1-6度范圍內(nèi)，亦稱小角度散射光，主要反映被測(cè)細(xì)胞的體積大小和活力。第33頁/共87頁（二）側(cè)向散射光SSCSSC方向與激光束和液流形成的平面相垂直，亦稱90度散射光，其信號(hào)強(qiáng)度反映細(xì)胞內(nèi)部顆粒度和精細(xì)結(jié)構(gòu)的變化。第34頁/共87頁（三）散射光的作用實(shí)驗(yàn)中，常利用FSC和SSC這兩種參數(shù)的組合，區(qū)分不同的細(xì)胞群體，去除碎片、死細(xì)胞和粘連細(xì)胞的干擾。粒細(xì)胞單核細(xì)胞淋巴細(xì)胞紅細(xì)胞、死細(xì)胞和碎片第35頁/共87頁死細(xì)胞或碎片粘連細(xì)胞腫瘤細(xì)胞株FSC/SSC散點(diǎn)圖死細(xì)胞加藥處理后FSC/SSC散點(diǎn)圖通過FSC/SSC散點(diǎn)圖，gate出目標(biāo)細(xì)胞進(jìn)行分析。第36頁/共87頁（三）閾值Threshold閾值：溶液中的雜質(zhì)或者死細(xì)胞，很容易產(chǎn)生微小的干擾信號(hào)，所以必須設(shè)置閾值，排除雜質(zhì)、細(xì)胞碎片或體積較小的死細(xì)胞。FSC反映細(xì)胞體積的大小，F(xiàn)CM應(yīng)用時(shí)常選取FSC設(shè)定閾值。5%32%默認(rèn)閾值升高閾值后第37頁/共87頁1.3.2熒光信號(hào)（一）熒光：

物質(zhì)中的電子吸收光的能量由低能狀態(tài)轉(zhuǎn)變?yōu)楦吣軤顟B(tài)，再回到低能狀態(tài)時(shí)釋放出的光。發(fā)射波長(zhǎng)(熒光波長(zhǎng))Emissionwavelength激發(fā)波長(zhǎng)Excitationwavelength＜第38頁/共87頁（二）常用熒光素<499nm藍(lán)色熒光（Blue）；

500-549nm，綠色熒光（Green）；550-584nm，黃色熒光（Yellow）；

585-615nm，橙色熒光（Orange）；616-700nm，紅色熒光（Red）；

≥700nm，遠(yuǎn)紅外熒光（Far-Red）。標(biāo)記抗體的熒光素?zé)晒馑胤肿蛹ぐl(fā)光波長(zhǎng)（nm）發(fā)射光波長(zhǎng)（nm）中文名FITC490520異硫氰酸熒光素PE488575藻紅蛋白PerCP490675多甲藻葉綠素蛋白APC650660別藻青蛋白PE-Cy5496/546670藻紅蛋白-花青素5PE-Cy7496/546767藻紅蛋白-花青素7Alexa

Flour488495519AlexaFlour647650665第39頁/共87頁核酸熒光染料PI（碘化丙啶535,623）可選擇性的插入核酸雙螺旋堿基對(duì)中。常用于DNA分析，需要用RNase處理細(xì)胞排除RNA對(duì)DNA熒光定量的影響；PI不能透過活細(xì)胞膜，常用于鑒定死細(xì)胞。7-AAD（7-氨基放線菌素D545,647）以插入的方式與DNA鏈的G-C堿基對(duì)結(jié)合，不能透過活細(xì)胞膜，常用于鑒定死細(xì)胞。DAPI（4,4,6-二脒基二苯基吲哚358,456）可以非嵌入方式與DNA鏈上的A-T堿基對(duì)特異性結(jié)合。變異系數(shù)明顯小于其他染料，一種理想的DNA定量染料。Hoechst（343,450）常見為Hoechst33342和Hoechst33258，非嵌入的方式與DNA鏈上的A-T堿基對(duì)結(jié)合。能對(duì)活細(xì)胞染色，用于活細(xì)胞DNA定量分析，如精子分選；還用于側(cè)群細(xì)胞的分選。PY（派若寧560,573）RNA染料，能進(jìn)入活細(xì)胞。AO（吖啶橙509,525）DNA、RNA染料，染色后DNA呈黃綠色熒光，RNA呈橙黃色熒光，可進(jìn)行DNA/RNA雙參數(shù)分析。第40頁/共87頁其他常用熒光染料測(cè)量參數(shù)熒光染料激發(fā)波長(zhǎng)(nm)熒光波長(zhǎng)(nm)報(bào)告基因GFP475509YFP514527細(xì)胞示蹤染料CFSE495519FAM488525細(xì)胞膜電位DiO-C6485505Rhodamine123511546細(xì)胞內(nèi)pH值SNARF-1514587/640細(xì)胞內(nèi)鈣濃度Fluo3506528Indo-1(low）361485Indo-1(high）330405氧自由基DCFHDA505535第41頁/共87頁（三）熒光抗體的選擇A根據(jù)流式細(xì)胞儀選擇抗體流式細(xì)胞儀能檢測(cè)的通道數(shù)(由激光器種類、數(shù)量和使用的光學(xué)濾片決定)。如FACSCalibur：多色標(biāo)記熒光素搭配原則：每個(gè)通道只能選擇一種熒光素；各個(gè)通道之間的熒光素可以隨意搭配。FACSCalibur常用四色搭配：FITC、PE、PerCP、APC。488FL1BP530/30515-545FITC、AF488FL2BP585/42564-606PEFL3670LP﹥670PE-Cy5、PerCP、PE-Cy7635FL4BP661/16653-669APC、AF647第42頁/共87頁（三）熒光抗體的選擇本實(shí)驗(yàn)室的FACSCantoII配置兩根激光器激發(fā)六色熒光。第一激光器：488nm藍(lán)色固態(tài)激光器激發(fā)四色。第二激光器：633nm紅色氦氖激光器激發(fā)二色。熒光濾片：488nm激光：530/30nm、585/42nm、695/40nm、780/60nm633nm激光：660/20nm、780/60nm總共可以檢測(cè)6色熒光可選擇的熒光如下：帶通濾片（530/30nm）：代表允許530nm±15nm波長(zhǎng)(515-545nm)的光通過第43頁/共87頁B根據(jù)抗原表達(dá)強(qiáng)弱合理選擇抗體不同的熒光素強(qiáng)度有所不同；高表達(dá)的抗原可用不太“亮”的染料，更“亮”的熒光素分配給表達(dá)低的抗原：CD4-FITC、CD25-APC、Foxp3-PEC選擇熒光波譜間光譜重疊較小的熒光染料進(jìn)行組合，同時(shí)需要正確的調(diào)節(jié)補(bǔ)償。CD5第44頁/共87頁1.4FCM數(shù)據(jù)存儲(chǔ)、顯示與分析標(biāo)準(zhǔn)的FCM數(shù)據(jù)采用列表模式（listmode），記錄了每個(gè)細(xì)胞的所有參數(shù)的信息。每個(gè)細(xì)胞檢測(cè)5個(gè)參數(shù)，那么獲取10000個(gè)細(xì)胞，容量為5×10000（字或雙字）。Event#FSCSSCFL1FITCFL2PEFL3APC110050010650421105057007006390480720670104954901572015……第45頁/共87頁FCM數(shù)據(jù)顯示方式單參數(shù)直方圖(Histogram)雙參數(shù)數(shù)據(jù)顯示：散點(diǎn)圖(DotPlot)偽彩圖(Pseudo-colorPlot)等高線圖(ContourPlot)密度圖(DensityPlot)假三維圖(Pseudo3DPlot)三維圖(3DPlot)常用分析軟件CellQuestDivaFlowJOWinMDIFCSExpress第46頁/共87頁直方圖Histogram細(xì)胞的某一單參數(shù)數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)分布圖，橫坐標(biāo)表示熒光信號(hào)或散射光信號(hào)相對(duì)強(qiáng)度的值，單位是道數(shù)，縱坐標(biāo)一般是細(xì)胞數(shù)。Event#FL1FITC11027003720415……0…………10…………100…………1000CountsFITC熒光強(qiáng)度第47頁/共87頁橫坐標(biāo)既可以是線性的，也可以是對(duì)數(shù)的。DNA倍體分析抗原表達(dá)分析Overlay圖第48頁/共87頁散點(diǎn)圖散點(diǎn)圖中每個(gè)點(diǎn)代表一個(gè)細(xì)胞，X軸與Y軸分別代表一種參數(shù)，優(yōu)點(diǎn)是比直方圖直觀。FL1FL2第49頁/共87頁散點(diǎn)圖和偽彩圖第50頁/共87頁等高圖和密度圖等高圖：類似于地圖中的等高線，同一條線上的細(xì)胞數(shù)目相等，越在里面的曲線代表細(xì)胞數(shù)目越多。密度圖：點(diǎn)密度越大的地方細(xì)胞越多，點(diǎn)密度越小的地方細(xì)胞少。第51頁/共87頁假三維圖和三維圖SSC-HeightFSC-HeightCountsSSC→CD45→CD14→第52頁/共87頁設(shè)門與數(shù)據(jù)分析門(Gate，簡(jiǎn)寫G)是流式細(xì)胞術(shù)中的一個(gè)重要術(shù)語，F(xiàn)CM數(shù)據(jù)分析過程實(shí)際上就是選門和設(shè)門的過程。橢圓形圓形第53頁/共87頁矩形任意形狀R(Region，區(qū)域)。門可以是單一區(qū)域(G=R1)，也可以是幾個(gè)區(qū)域組合在一起：G=R1andR2;G=R1orR2;G=R1notR2。第54頁/共87頁十字門線性門第55頁/共87頁1.5流式分選

電荷式分選超聲振動(dòng)器(15-100kHz)液流充電系統(tǒng)高壓偏轉(zhuǎn)板收集裝置(流式管、培養(yǎng)板)lasers斷裂點(diǎn)(充電)高壓偏轉(zhuǎn)板第56頁/共87頁四路分選原理電荷式分選裝置第57頁/共87頁液滴延遲在含有分選細(xì)胞的液滴上準(zhǔn)確加電是有效分選的關(guān)鍵，但是細(xì)胞經(jīng)過檢測(cè)區(qū)(激光照射點(diǎn))到加電位置(斷裂點(diǎn))有一個(gè)時(shí)間差，這稱為液滴延遲(dropdelay)。延遲時(shí)間直接影響著分選純度，準(zhǔn)確測(cè)定延遲時(shí)間是一個(gè)重要步驟。液滴延遲激光斷裂點(diǎn)照射點(diǎn)第58頁/共87頁分選指標(biāo)分選速度、分選純度和分選收獲率，相互影響。分選時(shí)間由三方面決定：進(jìn)樣速度、目標(biāo)細(xì)胞所占比例、需要收集的細(xì)胞數(shù)。需要細(xì)胞數(shù)目標(biāo)細(xì)胞所占比例(%)15501041.7min20s2s10516.8min3.4min20s1062.8h3.4min3.4min1071.2天5.6h34min分選時(shí)間表(機(jī)器流速10000個(gè)/s時(shí))第59頁/共87頁分選純度指被分選出來的細(xì)胞所占的百分比，一般能達(dá)99%以上。分選收獲率是指被分選出的細(xì)胞與原來總細(xì)胞的百分比。分選純度和收獲率永遠(yuǎn)是相互矛盾的，純度提高，收獲率降低，反之亦然。富集模式(enrichmode)純化模式(purifymode)單細(xì)胞模式(singlecellmode)第60頁/共87頁流式分選和磁珠分選FACS(Fluorescence-ActivatedCellSorting)流式分選MACS(Magnetic-ActivatedCellSorting)磁珠分選磁性標(biāo)記未標(biāo)記的細(xì)胞先行流出洗脫陽性細(xì)胞陽性分選策略第61頁/共87頁比較項(xiàng)目流式分選(FACS)磁珠分選(MACS)設(shè)備要求分選型流式細(xì)胞儀專用的磁鐵和柱子操作員要求要求高，需專門培訓(xùn)操作簡(jiǎn)單，要求不高試劑熒光素偶聯(lián)抗體磁珠結(jié)合抗體對(duì)細(xì)胞刺激刺激大刺激小多參數(shù)分選可以不可以低表達(dá)群細(xì)胞分選可以不可以胞內(nèi)熒光分選可以不可以流式分選與磁珠分選比較流式分選結(jié)合磁珠分選的方法，常應(yīng)用于分選低比例細(xì)胞群。如分選調(diào)節(jié)性T細(xì)胞CD4＋CD25

＋CD127low

，先用磁珠分選純化CD4

＋

T細(xì)胞，再用流式分選的方法分選CD4＋CD25

＋CD127low調(diào)節(jié)性T細(xì)胞。第62頁/共87頁二、流式細(xì)胞術(shù)操作與技巧流式細(xì)胞術(shù)操作流程：培養(yǎng)細(xì)胞血液骨髓新鮮組織石蠟包埋單細(xì)胞懸液制備熒光染色上機(jī)檢測(cè)表型測(cè)定細(xì)胞分選繼續(xù)培養(yǎng)FISHPCR統(tǒng)計(jì)學(xué)分析第63頁/共87頁2.1單細(xì)胞懸液制備2.2免疫熒光標(biāo)記2.3對(duì)照的設(shè)置2.4光譜重疊與補(bǔ)償?shù)?4頁/共87頁2.1單細(xì)胞懸液制備2.1.1新鮮實(shí)體組織的樣本制備

對(duì)于不同組織來源的實(shí)體組織和實(shí)體瘤標(biāo)本，應(yīng)該根據(jù)各自特點(diǎn)選擇不同的分散細(xì)胞方法，以期達(dá)到單細(xì)胞產(chǎn)量高、損傷小的目的。常用方法有：酶消化法機(jī)械法化學(xué)試劑處理法第65頁/共87頁酶消化法：根據(jù)分散組織類型來確定使用的酶類：胰蛋白酶—水解酯鍵、肽鍵；膠原酶—降解幾種分子類型的膠原；溶菌酶—水解糖蛋白、肽的糖苷鍵；彈性蛋白酶—消化糖蛋白、彈性蛋白的纖維。將新鮮組織置于離心管中，加入1-2ml酶消化20-30min（恒溫37℃或室溫），間斷振蕩或吹打；終止消化，收集細(xì)胞懸液，300目尼龍網(wǎng)過濾，除去細(xì)胞團(tuán)塊，低速離心除去細(xì)胞碎片；將制備好的單細(xì)胞懸液進(jìn)行熒光標(biāo)記或保存?zhèn)溆?。注意：酶的使用濃度、溫度、消化時(shí)間、酶活性的pH值。第66頁/共87頁機(jī)械法特點(diǎn)：易造成細(xì)胞碎片和團(tuán)塊，實(shí)際操作時(shí)，應(yīng)注意碎片和團(tuán)塊的去除，常與其他方法（如酶消化法）配合使用。組織解離器機(jī)械法：有剪碎法、網(wǎng)搓法、研磨法等。利用機(jī)械方法、物理方法給予組織交大的壓力，使細(xì)胞從組織間分散開來。第67頁/共87頁化學(xué)處理法：作用原理：將組織細(xì)胞間起黏著作用的鈣、鎂離子置換出來，從而使細(xì)胞分散開來，常用試劑有EDTA、EGTA、TPB等。EDTA是一種螯合劑，可以和組織間的鈣、鎂離子形成螯合物，實(shí)際運(yùn)用中常采用螯合物加酶法（主要是胰蛋白酶）。特點(diǎn)：用化學(xué)法細(xì)胞存活率低、細(xì)胞產(chǎn)額低，細(xì)胞碎片和聚集量不穩(wěn)定。第68頁/共87頁機(jī)械法往往造成嚴(yán)重的細(xì)胞損傷，而結(jié)果卻是較低的細(xì)胞產(chǎn)量，注意去除細(xì)胞碎片和團(tuán)塊以免影響FCM結(jié)果，如低速離心去碎片、尼龍網(wǎng)過濾團(tuán)塊等。酶消化法、化學(xué)試劑處理法對(duì)實(shí)體組織的分散效果較理想，但會(huì)造成所測(cè)化學(xué)成分的不良影響。根據(jù)實(shí)驗(yàn)?zāi)康娜ミx擇合適的單細(xì)胞懸液制備方法，最終要求細(xì)胞呈單個(gè)分散狀態(tài)；細(xì)胞碎片、團(tuán)塊盡量少；細(xì)胞活性不受到明顯損傷，保證下一步熒光染色。第69頁/共87頁2.1.2石蠟包埋組織樣本制備切片：將石蠟組織切成50um厚的組織片4-5片，放入1試管中；脫脂：加入二甲苯3-5ml脫脂，室溫下1-2天，脫凈后棄二甲苯；水化：依次加入100%、95%、70%、50%梯度乙醇5ml，每步10min，去乙醇后加入蒸餾水3-5ml，3-5min后棄水；消化：加入5ml0.5%胃蛋白酶（pH1.5-2.0），37℃恒溫水浴30min，每隔5-10min振蕩一次；終止消化：加冷的PBS或生理鹽水終止消化；過濾：用300目尼龍網(wǎng)過濾，未消化好的組織可做第二次消化；收集細(xì)胞懸液：將過濾液離心沉淀，再用PBS漂洗1-2次，低速離心沉淀去除碎片；根據(jù)實(shí)驗(yàn)?zāi)康臉?biāo)記熒光抗體，或保存細(xì)胞備用。第70頁/共87頁2.1.3血液、骨髓樣本制備外周血單個(gè)核細(xì)胞PBMC的分離血液層Ficoll層血漿層PBMCFicoll層紅細(xì)胞層離心前離心后Ficoll密度梯度離心法分離PBMC注意：由于多核粒細(xì)胞比較大，粒細(xì)胞沉降在紅細(xì)胞層，所以該法不適合粒細(xì)胞研究；該法操作過程中可能丟失一些有意義的細(xì)胞或細(xì)胞亞群，所以臨床上一般不主張分離血液或骨髓的單個(gè)核細(xì)胞。第71頁/共87頁紅細(xì)胞裂解液去除紅細(xì)胞原理：紅細(xì)胞裂解液成分為低滲的NH4Cl溶液，利用雙凹型的紅細(xì)胞膜抗性差，白細(xì)胞膜抗性比較好的特點(diǎn)，加入低滲透壓的紅細(xì)胞裂解液時(shí)，紅細(xì)胞膜脹破，而白細(xì)胞膜不受影響，從而達(dá)到去除紅細(xì)胞的目的。溶血/免洗(lyse/nowash)技術(shù)臨床上應(yīng)用溶血/免洗技術(shù)，既簡(jiǎn)化了操作步驟，又避免了洗滌過程中可能造成的某些亞群細(xì)胞的丟失。尤其在檢測(cè)嚴(yán)重污染性標(biāo)本時(shí)，避免了因離心等處理可能導(dǎo)致氣溶膠產(chǎn)生引起病毒感染的可能。第72頁/共87頁2.1.4培養(yǎng)細(xì)胞單細(xì)胞懸液制備2.1.5體液脫落細(xì)胞樣本制備懸浮生長(zhǎng)細(xì)胞吸管反復(fù)吹打貼壁生長(zhǎng)細(xì)胞消化處理離心獲得單細(xì)胞懸液洗脫液尿液胸腹水離心收集細(xì)胞，用生理鹽水或PBS洗滌3次300目尼龍膜過濾后離心沉淀去上清單細(xì)胞懸液第73頁/共87頁FCM可檢測(cè)下列細(xì)胞成分：表面標(biāo)記物胞漿標(biāo)記物核內(nèi)標(biāo)記物可溶性成分2.2免疫熒光染色黏附因子表面受體細(xì)胞因子分泌到胞外的細(xì)胞因子胞內(nèi)抗原核酸含量核內(nèi)抗原第74頁/共87頁熒光素偶聯(lián)抗體抗體上偶聯(lián)熒光素(FITC、PE等)，通過抗原抗體反應(yīng)讓目標(biāo)細(xì)胞特異性的帶上熒光。染色過程即抗原抗體反應(yīng)過程。熒光染料/熒光化合物PI、DAPI等插入核酸鏈中；CFSE和蛋白質(zhì)共價(jià)結(jié)合；AnnexinV-FITC檢測(cè)凋亡。熒光蛋白如GFP，不需要染色，直接檢測(cè)。第75頁/共87頁免疫熒光染色主要包括直接和間接免疫熒光染色兩種方法。間接標(biāo)記的方法難以進(jìn)行多色標(biāo)記，而且操作復(fù)雜、信噪比高，所以一般首先直標(biāo)熒光抗體。熒光抗體熒光二抗第一抗體直接標(biāo)記間接標(biāo)記第76頁/共87頁一般檢測(cè)時(shí)，獲取1～2萬個(gè)細(xì)胞，標(biāo)記0.5～1×106細(xì)胞即可。下述情況細(xì)胞量需相應(yīng)增加：檢測(cè)胞內(nèi)/核內(nèi)抗原，離心次數(shù)多；細(xì)胞周期乙醇固定損失細(xì)胞多；檢測(cè)細(xì)胞在標(biāo)本中比例低···0.5～1×106個(gè)細(xì)胞孵育體積50-100ul上機(jī)體積200-500ul終濃度約1×106個(gè)/ml加染料洗滌后補(bǔ)加液體細(xì)胞表面抗原標(biāo)記第77頁/共87頁表面抗原分析是流式應(yīng)用中最廣泛的，標(biāo)記步驟也相對(duì)簡(jiǎn)單。標(biāo)記：取0.5～1×106細(xì)胞，加入適量抗體(根據(jù)抗體說明書)，充分混勻后(總體積50-100ul)，4℃避光孵育10-30min。洗滌：加入1mlPBS洗液，300g離心洗滌5min。上機(jī)檢測(cè)：棄去上清后加入200-500ulPBS，重懸細(xì)胞后立即上機(jī)檢測(cè)；如不能及時(shí)上機(jī)檢測(cè)，則加入同樣體積的1%多聚甲醛，混勻后置于4℃冰箱內(nèi)保存，一般不超過24h。第78頁/共87頁胞內(nèi)抗原熒光標(biāo)記細(xì)胞內(nèi)抗原：如MPO；核內(nèi)抗原：如FoxP3；細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞因子(胞內(nèi)因子)：IFN-r、IL-4、IL-17等。固定：4％多聚甲醛破膜/透化0.05%皂素(saponin)；0.01%Trito