電化學(xué)發(fā)光免疫分析法

電化學(xué)發(fā)光免疫分析法第1頁/共42頁免疫分析基于抗原和抗體的特異性反應(yīng)進(jìn)行檢測的一種手段；免疫標(biāo)記技術(shù)是將一些既易測定又具有高度敏感性的物質(zhì)標(biāo)記到特異性抗原或抗體分子上，通過這些標(biāo)記物的增強(qiáng)放大效應(yīng)來顯示反應(yīng)系統(tǒng)中抗原或抗體的性質(zhì)與含量。第2頁/共42頁免疫學(xué)檢測歷史演進(jìn)放射免疫檢測（興起于20世紀(jì)70年代，現(xiàn)仍普遍使用于縣級(jí)以上醫(yī)院）；酶聯(lián)免疫檢測（興起于20世紀(jì)80年代，各臨床機(jī)構(gòu)普遍使用）；以化學(xué)發(fā)光為代表的光生物學(xué)標(biāo)記及免疫檢測技術(shù)（20世紀(jì)90年代開始推廣使用，產(chǎn)品步入成長期）三個(gè)階段。第3頁/共42頁免疫分析法發(fā)光和化學(xué)發(fā)光化學(xué)發(fā)光免疫分析法電化學(xué)發(fā)光電化學(xué)發(fā)光免疫分析法第4頁/共42頁發(fā)光現(xiàn)象第5頁/共42頁螢火蟲發(fā)光第6頁/共42頁深海魚發(fā)光第7頁/共42頁發(fā)光分類光照發(fā)光:發(fā)光劑經(jīng)短波長入射光照射后進(jìn)入激發(fā)態(tài)，當(dāng)回復(fù)至基態(tài)時(shí)發(fā)出較長波長的可見光。生物發(fā)光：反應(yīng)底物在熒光素酶的催化下利用ATP產(chǎn)能，生成激發(fā)態(tài)的氧化熒光素，后者在回復(fù)到基態(tài)時(shí)多余的能量以光子形式放出?；瘜W(xué)發(fā)光第8頁/共42頁化學(xué)發(fā)光

Chemiluminescence(CL)化學(xué)發(fā)光是指在某些特殊的化學(xué)反應(yīng)中，反應(yīng)的中間體或產(chǎn)物由于吸收了反應(yīng)釋放的化學(xué)能而處于電子激發(fā)態(tài)，當(dāng)其回到基態(tài)時(shí)伴隨產(chǎn)生的光輻射現(xiàn)象。第9頁/共42頁

化學(xué)發(fā)光反應(yīng)包括兩個(gè)關(guān)鍵步驟，即化學(xué)激發(fā)和發(fā)光?；瘜W(xué)發(fā)光反應(yīng)能級(jí)圖第10頁/共42頁

化學(xué)發(fā)光分析根據(jù)化學(xué)發(fā)光反應(yīng)在某一時(shí)刻的發(fā)光強(qiáng)度或反應(yīng)的發(fā)光總量來確定反應(yīng)中相應(yīng)組分含量的分析方法，稱為化學(xué)發(fā)光分析。第11頁/共42頁化學(xué)發(fā)光分析優(yōu)點(diǎn)化學(xué)發(fā)光具有熒光的特異性，同時(shí)不需要激發(fā)光，就避免了熒光分析中激發(fā)光雜散光的影響有很高的靈敏度，并且不象放射分析那樣存在強(qiáng)烈的環(huán)境污染和健康危害，是一種非常優(yōu)秀的定量分析方法。第12頁/共42頁化學(xué)發(fā)光分析缺點(diǎn)雖然化學(xué)發(fā)光具備很高的特異性和很小的干擾，但化學(xué)分析本身的不特異性，制約了整個(gè)方法的使用。第13頁/共42頁免疫分析法發(fā)光和化學(xué)發(fā)光化學(xué)發(fā)光免疫分析法電化學(xué)發(fā)光電化學(xué)發(fā)光免疫分析法第14頁/共42頁化學(xué)發(fā)光免疫分析

chemiluminescenceimmunoassay（CLIA）CLIA是將化學(xué)發(fā)光分析和免疫反應(yīng)相結(jié)合而建立的一種新的免疫分析技術(shù)。這種方法兼有發(fā)光分析的高靈敏度和抗原抗體反應(yīng)的高度特異性。第15頁/共42頁化學(xué)發(fā)光免疫分析（CLIA）分類按分離方法不同分微粒子化學(xué)發(fā)光免疫測定磁顆?；瘜W(xué)發(fā)光免疫測定第16頁/共42頁化學(xué)發(fā)光免疫分析（CLIA）分類按發(fā)光劑不同分為發(fā)光酶免疫測定（chemiluminescenceenzymeimmunoasssay，CLEIA）化學(xué)發(fā)光免疫測定技術(shù)（chemiluminescenceimmunoassay，CLIA）電化學(xué)發(fā)光免疫測定技術(shù)（electro－chemiluminescenceimmunoassay，ECLI）第17頁/共42頁免疫分析法發(fā)光和化學(xué)發(fā)光化學(xué)發(fā)光免疫分析法電化學(xué)發(fā)光電化學(xué)發(fā)光免疫分析法第18頁/共42頁電致化學(xué)發(fā)光（ECL)電致化學(xué)發(fā)光(ECL)是通過在電極上施加一定波形的電壓或電流信號(hào)進(jìn)行電解反應(yīng)的產(chǎn)物之間或與體系中共存組分反應(yīng)產(chǎn)生化學(xué)發(fā)光的現(xiàn)象。第19頁/共42頁電致化學(xué)發(fā)光（ECL)ECL與CL的差異在于ECL是電啟動(dòng)發(fā)光反應(yīng)，而CL是通過化合物混合啟動(dòng)發(fā)光反應(yīng)。因此ECL反應(yīng)易精確控制，具有靈活性。第20頁/共42頁電化學(xué)發(fā)光劑定義：指通過在電極表面進(jìn)行電化學(xué)反應(yīng)而發(fā)出光的物質(zhì)。特點(diǎn)反應(yīng)在電極進(jìn)行化學(xué)發(fā)光劑：三聯(lián)毗啶釕電子供體為：三丙胺（TPA）第21頁/共42頁三聯(lián)毗啶釕分子結(jié)構(gòu)圖第22頁/共42頁三聯(lián)吡啶釕

（[Ru(bpy)3]2+

）特點(diǎn)ECL分析中采用[Ru(bpy)3]2+作為標(biāo)記物，其活化衍生物是[Ru(bpy)3]2+＋N羥基琥珀酸胺酯（NHS），該衍生物具有水溶性，且高度穩(wěn)定，保證電化學(xué)發(fā)光反應(yīng)的高效和穩(wěn)定，而且避免了本底噪聲的干擾。第23頁/共42頁三聯(lián)吡啶釕（[Ru(bpy)3]2+

）特點(diǎn)[Ru(bpy)3]2+衍生物與免疫球蛋白結(jié)合的分子比超過20仍不會(huì)影響抗體的可溶性和免疫活性；[Ru(bpy)3]2+分子量小，空間位阻小，即便小分子的核酸也能標(biāo)記，使檢測的菜單大大豐富，更重要的是為其檢測菜單的開發(fā)前景提供了廣闊空間。第24頁/共42頁電化學(xué)發(fā)光原理圖基態(tài)激發(fā)態(tài)不穩(wěn)定第25頁/共42頁免疫分析法發(fā)光和化學(xué)發(fā)光化學(xué)發(fā)光免疫分析法電化學(xué)發(fā)光電化學(xué)發(fā)光免疫分析法第26頁/共42頁電化學(xué)發(fā)光免疫分析

(Electro-ChemiluminescenceImmunoassay,ECLI)ECLI是繼EIA、RIA、FIA、時(shí)間分辨熒光免疫技術(shù)（TRFIA）之后的新一代標(biāo)記免疫測定技術(shù)；ECLI是電化學(xué)發(fā)光(ECL)和免疫測定相結(jié)合的產(chǎn)物；ECLI是目前最先進(jìn)的標(biāo)記免疫測定技術(shù)之一。第27頁/共42頁ECLI原理在電極表面由電化學(xué)引發(fā)的特異性化學(xué)發(fā)光反應(yīng)，用電化學(xué)發(fā)光劑三聯(lián)吡啶釕[Ru(bpy)3]2+標(biāo)記Ab，通過Ag-Ab反應(yīng)和磁珠分離技術(shù)，根據(jù)三聯(lián)吡啶釕在電極上發(fā)出的光強(qiáng)度對(duì)待測的Ag或Ab進(jìn)行定量/定性。第28頁/共42頁ECLIA檢測流程圖一（雙抗體夾心的形成）第29頁/共42頁ECLIA檢測流程圖二（生物素與親和素結(jié)合）第30頁/共42頁ECLIA體系結(jié)構(gòu)圖第31頁/共42頁ECLIA檢測流程圖三（磁珠吸引吸附于電極表面）第32頁/共42頁ECLIA檢測流程圖四（電極充電啟動(dòng)電化學(xué)反應(yīng)）第33頁/共42頁ECLIA檢測流程圖五（撤消磁場沖洗磁珠）第34頁/共42頁方法評(píng)價(jià)采用的固相載體是帶有磁性的直徑約2.8μm的聚苯乙烯微粒。其特點(diǎn)是反應(yīng)面積比板式擴(kuò)大20－30倍，吸附效率高；在液體中形成均勻的懸液，參與反應(yīng)時(shí)類似液相，反應(yīng)速度大大加快；第35頁/共42頁方法評(píng)價(jià)“鏈霉親和素-生物素”是是具有很強(qiáng)的非共價(jià)相互作用的一對(duì)化合物，具有牢固而特異的結(jié)合，應(yīng)用此放大系統(tǒng)，使檢測的靈敏度大大提高；第36頁/共42頁方法評(píng)價(jià)利用氧化鐵的磁性，使用電磁場分離結(jié)合態(tài)和游離態(tài)，方便迅速，實(shí)現(xiàn)了精確的全自動(dòng)化；標(biāo)記物的再循環(huán)利用，使發(fā)光時(shí)間更長、強(qiáng)度更高、易于測定。第37頁/共42頁ELIA優(yōu)越性高度敏感，可達(dá)pg／ml或pmol水平；特異性強(qiáng)，重復(fù)性好，CV＜5％。測定范圍寬，可達(dá)7個(gè)數(shù)量級(jí)。試劑穩(wěn)定，無毒害，無污染，有效期長，達(dá)數(shù)月甚至數(shù)年。操作簡單，耗時(shí)短，易于自動(dòng)化。在對(duì)環(huán)保很重視的國家，CLIA成了取代