電泳分離課件

第七節(jié)電泳分離電泳（electrophoresis,EP）：

指帶電粒子在電場中向著與其所帶電荷性質相反的電極方向移動的過程。電泳技術是根據各種帶電粒子在電場中遷移速度的不同而對物質進行分離的實驗技術。1一、電泳的基本理論

1.原理:在一定pH條件下（用buffer），不同大小、形狀的帶電顆粒在電場中的移動速度不同（用遷移率表示），各自集中到特定的位置上而形成緊密的泳動帶。

+2遷移率與內在特性和外界條件有關內在特性：顆粒性質（凈電荷量，顆粒大小、形狀）外界條件：電場強度、溶液性質、支持體特性帶電粒子在單位時間內移動的距離稱為電泳遷移率。

移動速度(V)是電場(E)和遷移率(m)的乘積，即：V＝mE

3自由界面電泳：又稱移動界面電泳（movingboundaryelectrophoresis,MBEP），指在沒有支持介質的溶液中進行的電泳。區(qū)帶電泳:（zoneelectrophoresis,ZEP）指有支持介質的電泳，待分離物質在支持介質上分離成若干區(qū)帶。支持介質的作用:防止電泳過程中的對流和擴散。2.電泳的分類5按支持介質種類的不同，區(qū)帶電泳可分為：①紙電泳：用濾紙作為支持介質，多用于核苷酸的定性定量分析。②醋酸纖維素薄膜電泳：醫(yī)學上，常用于分析血清蛋白、胎盤球蛋白，優(yōu)點是簡便迅速，便于保存照相，比紙電泳分辨率高。以上兩種類型的電泳，由于介質的孔徑度大，沒有分子篩效應，主要靠被分離物的電荷多少進行分離。

6③瓊脂糖凝膠電泳：從瓊脂中精制分離出的膠狀多糖，一般用于核酸的分離分析。（1）瓊脂糖凝膠孔徑較小，具有分子篩效應；（2）機械強度高：可以在濃度1%以下使用；（3）無毒；（4）染色、脫色程序簡單，背景色較低；（5）熱可逆性；（6）生物中性：一般不與生物材料結合。④聚丙烯酰胺凝膠電泳：可用于核酸和蛋白質的分離、純化及檢測。分辨率較高。聚丙烯酰胺和瓊脂糖是目前實驗室最常用的兩種支持介質。7

3.電泳常用設備

（1）電泳儀：為電泳提供穩(wěn)定直流電源的裝置。

常壓電泳儀（600V）

高壓電泳儀（3000V）

超高壓電泳儀（30000V～50000V）（2）電泳槽：

自由界面電泳槽管狀電泳槽板狀電泳槽（3）附屬設備：

外循環(huán)恒溫系統(tǒng):高電壓會產生高熱，需冷卻。灌膠模具：制膠，玻璃板和梳子。810111.原理

聚丙烯酰胺凝膠是由丙烯酰胺單體（acrylamide，簡稱Acr）和交聯(lián)劑N，N’-甲叉雙丙烯酰胺（methylanebisacrylamide，簡稱Bis）在催化劑和加速劑作用下聚合的。13CH2=CHC=ONH2CH2=CHC=ONHCH2NHC=OCH2=CH-CH2-CH-[CH2-CH-]nCH2-CH-C=OC=OC=ONH2NH2NHCH2NHC=O-CH2-CH-[CH2-CH-]nCH2-CH-C=OC=ONHNH2丙烯酰胺N,N’-甲叉雙丙烯酰胺聚丙烯酰胺1415

聚丙烯酰胺凝膠聚合的催化體系有兩種：1）化學催化系統(tǒng)：AP-TEMED催化劑：過硫酸銨（ammoniumpersulfate，AP）加速劑：TEMED（N，N，N’，N’-四甲基乙二胺）2）光催化系統(tǒng)：核黃素－光催化劑:核黃素（維生素B2）

引發(fā)劑:光TEMED的存在，可加速聚合。.17聚丙烯酰胺凝膠：丙烯酰胺＋N,N’－甲叉雙丙烯酰胺聚合而成18凝膠的機械強度、彈性和透明度、粘著度取決于凝膠總濃度（T）和交聯(lián)度（C）。

T=

C=凝膠濃度越大（?。?，孔徑越?。ù螅?，可分離分子量較小（大）的顆粒。

Acr與Bis的質量比應在30左右。

凝膠濃度和交聯(lián)度與孔徑大小的關系Acr（g）+Bis（g）V（ml）X100%Acr（g）+Bis（g）Bis（g）X100%192.分離效應

PAGE根據其有無濃縮效應，分為：連續(xù)電泳（continuouselectrophoresis）采用相同孔徑的凝膠和相同的緩沖系統(tǒng)不連續(xù)電泳（discontinuouselectrophoresis）

采用不同孔徑的凝膠和不同緩沖體系電荷效應不連續(xù)PAGE分子篩效應濃縮效應

連續(xù)PAGE211）電荷效應:分離膠中，蛋白質表面凈電荷不同，遷移率不同。2）分子篩效應：大小和形狀不同的樣品分子通過一定孔徑的分離膠時，受阻滯的程度不同而表現(xiàn)出不同的遷移率。3）濃縮效應：使樣品在濃縮膠中被濃縮成一條窄帶，然后再進入分離膠進行分離。在直流電場作用下電泳情況示意圖圖中A，B，C均為陰離子分子量大小依次為MA=MB>MC，所帶電荷量相同QA=QB=QC。22不連續(xù)聚丙烯酰胺凝膠電泳系統(tǒng)的不連續(xù)性表現(xiàn)在以下幾個方面：1.凝膠由上、下兩層凝膠組成，兩層凝膠的孔徑不同，上層為大孔徑的濃縮膠，下層為小孔徑的分離膠。2.緩沖液離子組成及各層凝膠的pH不同。電極緩沖液為pH8.3的Tris-甘氨酸緩沖液，濃縮膠為pH6.7的Tris-HCl緩沖液，而分離膠為pH8.9的Tris-HCl緩沖液。

3.在電場中形成不連續(xù)的電位梯度。因此，在這樣一個不連續(xù)的系統(tǒng)里，存在三種物理效應，即樣品的濃縮效應，凝膠的分子篩效應和電荷效應，提高了分辨率。8.38.38.96.723

SDSseparatesproteinsbyMW251.原理：SDS是一種陰離子去污劑，帶有大量負電荷，與蛋白質結合后使蛋白質所帶負電荷大大超過了天然蛋白質原有的負電荷，因而消除或掩蓋了不同種類蛋白質間原有電荷的差異。SDS破壞蛋白質氫鍵、疏水鍵，巰基乙醇使二硫鍵打開，引起蛋白質構象改變，使蛋白質－SDS復合物形狀近似橢圓形，短軸相同（1.8nm），長軸與蛋白質分子量成正比。因此，蛋白質—SDS復合物(SDS-denaturedprotein)在凝膠中的遷移率不受蛋白質原有電荷和形狀的影響，只與橢圓棒長度（蛋白質分子量）有關。26292.操作：（SDS及PAGE，即變性及非變性）1）制膠:（變性：buffer中加0.4%SDS）a.分離膠：根據待分離樣品的分子大小選擇一定濃度的分離膠（查表），配制分離膠溶液：Acr:Bis=29:1，分離膠buffer,TEMED,AP,水迅速倒膠，加水使液面平坦，室溫0.5h聚合完全。b.濃縮膠：用濃縮膠buffer。插上梳子。302）樣品制備：a.PAGE:樣品＋樣品緩沖液（蔗糖或甘油＋指示劑溴酚藍）b.SDS:樣品＋樣品緩沖液（SDS，甘油，巰基乙醇，溴酚藍），煮沸2~5min，以除去亞穩(wěn)態(tài)聚合。3）加樣及電泳：SDS:電極buffer中加0.1%SDS，溴酚藍距下端1cm時停止電泳。314）固定及染色a.固定：將凝膠浸于7％乙酸或12.5％三氯乙酸（TCA）中固定蛋白質組分。b.染色：

考馬斯亮藍染色法

銀染法（靈敏度比前者高100倍）其它的染色方法：氨基黑、阿爾辛藍，過碘酸－Schiff試劑（糖蛋白）。3233四、等電聚焦(isoelectricfocusing，IEF)利用蛋白質具有不同等電點的特性，以聚丙烯酰胺為電泳支持物，在其中加入載體兩性電解質（商品名：Ampholine，一種含有各種連續(xù)

pI

的小分子混合物）的電泳方法稱聚丙烯酰胺等電聚焦電泳（IEF）。34原理

兩性電解質載體在電場作用下，按各自pI形成從陽極到陰極逐漸增加的平滑和連續(xù)的pH梯度。蛋白質在此pH梯度凝膠中泳動，當遷移至pH值等于pI處時不再泳動，被濃縮成狹窄的區(qū)帶。35優(yōu)點：分辨率高；電泳時間延長，區(qū)帶越來越窄；樣品可以加在電泳系統(tǒng)的任何部位；濃度很低的樣品也可以進行分離；可用于準確測定蛋白質或其他兩性電解質的等電點。36缺點：電泳過程要求使用無鹽溶液，可能會使某些在無鹽溶液中溶解度較低的蛋白質產生沉淀；電泳后樣品中各組分都聚焦到各自的等電點，對某些在等電點時溶解度較低或可能變性的組分不適用。37兩性電解質載體(carrierampholytes)(1)易溶于水，有足夠的緩沖能力——以便保持穩(wěn)定的pH梯度。(2)導電性能好——以保持電場強度的均勻性。(3)分子量小——電泳后易分離除去。(4)化學組成不同于蛋白質——不干擾測定。(5)與樣品中各組分不發(fā)生化學反應。38pH梯度的形成兩性電解質在溶液中的行為可從兩方面看，一方面溶液的pH決定它帶電荷的性質。如溶液是pH7，對pI=9的兩性電解質來說，是處于酸性環(huán)境，故帶正電荷；但對pI=3的兩性電解質來說，卻是處于堿性環(huán)境，故而帶負電荷。所以，不同pI的兩性電解質，在同一環(huán)境中帶有不同性質和數(shù)量的電荷；另一方面，溶液中的兩性電解質又破壞了水的解離平衡：使溶液pH有所改變。當某一兩性電解質pI較低，即釋放質子(H+)能力較強，使溶液pH值下降，這類兩性電解質稱為酸性兩性電解質；反之，pI高的可使溶液pH值上升，稱為堿性兩性電解質。所以，在溶液中的兩性電解質一方面受溶液pH值的影響，決定其帶電的性質；另一方面，它又影響周圍環(huán)境(水溶液)，使其pH值有所改變。

39載體兩性電解質是一系列多氨基多羧基的混合物，其pI分布在3～11之間。在制備聚丙烯酰胺凝膠時，將其混溶其中。電泳時凝膠板正極的電極液是磷酸，負極是氫氧化鈉。正極是酸性環(huán)境，載體兩性電解質都帶正電荷，但由于pI的不同，其所帶正電荷數(shù)量就有所差異電泳時向負極泳動的速度也就因此不同。同理，負極是堿性環(huán)境，載體兩性電解質帶有數(shù)量不等的負電荷，以不同速度向正極泳動。根據兩性電解質的特性，在泳動過程中又不斷地與溶液交換質子，改變了溶液的pH。當達到平衡時，即得失質子相等，不再出現(xiàn)質子的交換時，載體兩性電解質到達等電點并各處于自己的pI區(qū)域，pI即是指溶液的pH值。所以，溶液也因此呈現(xiàn)不同的pH，隨載體兩性電解質的pI梯度而形成pH梯度。40等電聚焦電泳41422.操作：

1）凝膠配制：凝膠濃度T為5％~7.5％（C=3%左右）2）加樣：任意位置

433）電泳：要求開始電泳時恒壓60V，15min，目的在于使小分子的，泳動快的載體兩性電解質可在短時間內形成一個粗略的pH梯度。此后，恒流為8mA，是為了避免電泳開始時介質中帶電顆粒較多，電泳電流過高而破壞凝膠。當各種蛋白質逐漸泳動到各自等電點位置時，帶電顆粒逐漸減少，出現(xiàn)電阻增大，電壓隨之增高現(xiàn)象。當電壓升到550V時，帶電顆粒已大為減少，電流不再偏高，故恒壓到580V，繼續(xù)電泳120min后，蛋白質顆粒慢慢地集中到它等電點位置。電流接近于零時，蛋白質顆粒不再泳動，電泳也到此結束。

4）固定及染色：TCA固定，考馬斯亮藍染色。445）等電點測定：Marker與未知樣品同時電泳染色后，以pH值為縱軸，距陰極距離為橫軸，做pH梯度標準曲線，據未知蛋白遷移距離可推知pI。IEF測定蛋白質pI453.應用：蛋白質的分離純化測等電點46第一相：等電聚焦第二相：SDS－PAGE目的：為了獲得更詳細的蛋白質組分信息。目前已經廣泛應用于蛋白質組研究中雙相電泳4748（1）在沒有電場時，載