PCR技術(shù)多媒體課件

PCR技術(shù)生物化學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)PCR技術(shù)目錄PCR的反應(yīng)原理PCR示例PCR技術(shù)

多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR：PolymeraseChainReaction)

KaryB.Mullis

PCR是由美國科學(xué)家穆利斯提出的一種體外簡化條件下模擬DNA體內(nèi)復(fù)制的DNA快速擴(kuò)增的方法，此技術(shù)獲得1993年諾貝爾化學(xué)獎。PCR技術(shù)體內(nèi)DNA的復(fù)制體系DNA聚合酶（IIIIII）拓?fù)洚悩?gòu)酶解旋酶類SSB

引物dNTPMg2+5’3’PCR技術(shù)Mullis的PCR構(gòu)思引物引物DNA聚合酶DNA聚合酶特定DNA片段PCR技術(shù)Taq

DNA聚合酶（thermusaquaticus)酶活性(%)溫度(℃)40506070809010010080604020耐熱DNA聚合酶Saiki（1988）將耐熱DNA聚合酶引入PCR，使利用熱變性解鏈DNA模板可行。PCR技術(shù)PCR反應(yīng)循環(huán)72℃94℃55℃PCR循環(huán)變性退火延伸PCR技術(shù)

PCR的指數(shù)擴(kuò)增（2n）引物延伸延伸5’5’3’3’變性、退火變性、退火PCR技術(shù)TaqP1P2PCR反應(yīng)體系dATPdTTPdGTPdCTPMg2+模板：DNA引物：P1P2DNA聚合酶：Taq原料：dNTP反應(yīng)緩沖液輔助因子：Mg2+PCR技術(shù)1）PCR反應(yīng)成分（1）模板單、雙鏈DNA均可。不能混有蛋白酶、核酸酶、DNA聚合酶抑制劑、DNA結(jié)合蛋白類。

DNA模板一般100ng/100L。模板濃度過高會導(dǎo)致反應(yīng)的非特異性增加。

PCR反應(yīng)條件PCR技術(shù)（2）引物濃度

0.1-0.5mol/L

濃度過高易導(dǎo)致模板與引物錯配,反應(yīng)特異性下降。（3）Taq

DNA聚合酶

0.5-2.5U/50l

酶量增加使反應(yīng)特異性下降;酶量過少影響反應(yīng)產(chǎn)量。PCR技術(shù)（4）dNTP

dNTP濃度取決于擴(kuò)增片段的長度四種dNTP濃度應(yīng)相等濃度過高易產(chǎn)生錯誤堿基的摻入,濃度過低則降低反應(yīng)產(chǎn)量

dNTP可與Mg2+結(jié)合,使游離的Mg2+濃度下降,影響DNA聚合酶的活性。PCR技術(shù)（5）Mg2+

Mg2+是DNA聚合酶的激活劑。適宜濃度為0.5-2.5mmol/L反應(yīng)體系。

Mg2+濃度過低會使Taq酶活性喪失、PCR產(chǎn)量下降；Mg2+過高影響反應(yīng)特異性。

Mg2+可與負(fù)離子結(jié)合,所以反應(yīng)體系中dNTP、EDTA等的濃度影響反應(yīng)中游離的Mg2+濃度。PCR技術(shù)2）循環(huán)參數(shù)變性

使雙鏈DNA解鏈為單鏈

94℃，20-30秒(2)退火

溫度由引物長度和GC含量決定。增加溫度能減少引物與模板的非特異性結(jié)合;降低溫度可增加反應(yīng)的靈敏性。PCR技術(shù)（3）延伸

70-75℃,一般為72℃

延伸時間由擴(kuò)增片段長度決定（4）循環(huán)次數(shù)

主要取決于模版DNA的濃度一般為25-35次次數(shù)過多：擴(kuò)增效率降低錯誤摻入率增加PCR技術(shù)PCR技術(shù)的特點(diǎn)1）高度的靈敏性30輪循環(huán)擴(kuò)增量達(dá)230個拷貝（109拷貝）PCR產(chǎn)物每輪循環(huán)增加一倍PCR技術(shù)2）特異性引物引物

引物的序列及其與模板結(jié)合的特異性是決定PCR反應(yīng)結(jié)果的關(guān)鍵。引物設(shè)計(jì)的最大原則是最大限度地提高擴(kuò)增效率和特異性；同時盡可能減少非特異性擴(kuò)增。PCR技術(shù)引物設(shè)計(jì)：（1)序列應(yīng)位于高度保守區(qū),與非擴(kuò)增區(qū)無同源序列。（2）引物長度以15-40bp為宜。（3）堿基盡可能隨機(jī)分布,G+C占40-60%。（4）引物內(nèi)部避免形成二級結(jié)構(gòu)。（5）兩引物間避免有互補(bǔ)序列。（6）引物3’端為關(guān)鍵堿基；5’端無嚴(yán)格限制。PCR技術(shù)3）操作簡便易行

利用PCR擴(kuò)增,只需要數(shù)小時,就可以擴(kuò)增出可用電泳法檢出的DNA，可用于檢測基因組中僅含數(shù)個拷貝的模板序列。

PCR技術(shù)PCR示例一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康膶W(xué)習(xí)PCR分析的原理與技術(shù)。PCR技術(shù)1、材料：含1Kb插入片段的克隆載體Pmd18-T

質(zhì)粒DNA2、儀器：微量移液器及吸頭、PCR儀及PCR管瓊脂糖凝膠電泳設(shè)備3、試劑：10XPCR 反應(yīng)緩沖液

25mmol/LMgCl2

10mmol/LdNTP10μmol/L引物1和引物2二、實(shí)驗(yàn)材料、儀器和試劑PCR技術(shù)1.按照如下體積向PCR管中按順序加入各試劑并混勻：

10XPCR反應(yīng)緩沖液2.5μL25mmol/LMgCl22.0μL

10mmol/LdNTP1.0μL10μmol/L引物11.0μL10μmol/L引物21.0μL質(zhì)粒DNA1.0μLTaq0.1μL(5U)水補(bǔ)充至25.0μL三、操作步驟PCR技術(shù)2.按照如下體積向PCR管中按順序加入各試劑并混勻：

10XPCR反應(yīng)緩沖液2.5μL25mmol/LMgCl22.0μL

10mmol/LdNTP1.0μL10μmol/L引物11.0μL10μmol/L引物21.0μL質(zhì)粒DNA1.0μLTaq0.