病毒性肝炎血清學(xué)檢測的基礎(chǔ)與實(shí)踐

病毒性肝炎血清學(xué)檢測的基礎(chǔ)與實(shí)踐第1頁/共70頁病毒性肝炎血清學(xué)檢測的基礎(chǔ)與實(shí)踐第2頁/共70頁為什么ELISA檢測抗體容易假陽性檢測抗體和抗原的基本原理－－ELISA病毒性肝炎血清學(xué)檢測的基礎(chǔ)和實(shí)踐講解內(nèi)容甲型肝炎乙型肝炎丙型肝炎丁型肝炎戊型肝炎4.如何克服抗-HEV檢測中的假陽性第3頁/共70頁為什么ELISA檢測抗體容易假陽性?抗體的粘附特性，特別是IgM抗體ELISA的高靈敏性抗體結(jié)合抗原的適應(yīng)性：Fab－CDR抗-HIV初篩試驗(yàn)抗-HIV確診試驗(yàn)第4頁/共70頁CLVLVHCH1CH2CH3V區(qū)Fab段Fc段s-ss-ss-ss-sCDR1CDR3CDR2抗體結(jié)構(gòu)簡圖IgM是五聚體，與抗原具有5或10價結(jié)合力。Fab：fragmentantigen-bindingCDR：complementaritydeterminingregionFab段抗體結(jié)合抗原的適應(yīng)性：Fab－CDR第5頁/共70頁抗體產(chǎn)生過程簡圖第6頁/共70頁間接ELISA檢測抗體1.抗原包被2.封閉3.待測血清4.酶標(biāo)二抗5.TMB顯色6.2MH2SO47.OD450EEEEEE+SubstrateTMB抗-IgG抗-IgA抗-IgMIgGIgAIgM第7頁/共70頁抗體的粘附特性00.501.001.502.00原倍10100100010000血清稀釋倍數(shù)OD450間接ELISA，無抗原包被間接法ELISA檢測抗體，靈敏，但容易出現(xiàn)假陽性第8頁/共70頁捕捉法ELISA檢測IgM抗體1.抗mu鏈抗體包被2.封閉3.待測血清4.酶標(biāo)抗原（特異性）5.TMB顯色6.2MH2SO47.OD450CLVLVHCH1CH2CH3V區(qū)s-ss-ss-ss-s敏感性較間接法低，但特異性強(qiáng)第9頁/共70頁ELISA檢測抗原1.抗體包被2.封閉3.待測血清4.酶標(biāo)抗體5.TMB顯色6.2MH2SO47.OD450EEEEEE+SubstrateTMB包被抗體與酶標(biāo)抗體識別的免疫表位必須不同第10頁/共70頁病毒性肝炎甲型乙型丙型丁型戊型HepatitisAVirus,HAVHepatitisBVirus,HBVHepatitisCVirus,HCVHepatitisDVirus,HDVHepatitisEVirus,HEV消化道血液消化道感染途徑血液血液病原學(xué)病程分型急性急性,慢性急性,慢性急性,慢性急性GBV-C，所謂庚型肝炎病毒，不引起肝損，不是肝炎病毒EB病毒、巨細(xì)胞病毒等可引起肝損，但以臟器損傷為主，不稱肝炎病毒第11頁/共70頁病毒性肝炎的病原診斷根據(jù)臨床表現(xiàn)無法確定病原診斷依賴實(shí)驗(yàn)室檢查血清學(xué)方法：血清+免疫技術(shù)檢測抗原或抗體分子生物學(xué)：酶免疫測定：enzymeimmunoassay,EIA酶聯(lián)免疫吸附測定：enzyme-linkedimmunosorbentassay,ELISA分子雜交：同位素或其他物質(zhì)標(biāo)記已知DNA或cDNA，即探針，與待測標(biāo)本中的核酸互補(bǔ)，特異性結(jié)合。－－淘汰聚合酶鏈反應(yīng)：polymerasechainreaction，PCR－－普遍使用第12頁/共70頁甲型肝炎病毒HAV無包膜RNA病毒：抗原種類少正鏈RNA，7.4kbHAV抗原只有一種，即衣殼蛋白；難以測到，不開展特異性抗體：抗-HAVIgG,IgM，保護(hù)性抗體；常用HAVRNA：RT-PCR檢測，但陽性率低，僅用于研究第13頁/共70頁024681012

抗甲肝抗體濃度感染后周數(shù)病毒血癥大便排病毒轉(zhuǎn)氨酶升高期癥狀期IgMIgGHAV感染后人體抗體應(yīng)答抗-HAVIgM：感染后～3周即可陽性，1-3月后轉(zhuǎn)陰，近期或急性感染?？?HAVIgG：IgM產(chǎn)生后數(shù)天即可陽性，存在數(shù)十年，單純陽性很可能是既往感染，故單獨(dú)檢測抗-HAVIgG通常不用于診斷。第14頁/共70頁甲型肝炎診斷流程同時檢測抗HAVIgM和IgG時：4種情況僅檢測抗-HAVIgM時甲型肝炎抗-HAVIgM陽性抗-HAVIgG陽性甲型肝炎1.2.既往感染，對甲肝有免疫力排除甲肝，而且為易感者抗-HAVIgM陰性抗-HAVIgG陽性抗-HAVIgM陰性抗-HAVIgG陰性3.陽性陰性排除第15頁/共70頁甲型肝炎診斷流程同時檢測抗HAVIgM和IgG時：4種情況甲型肝炎早期或IgM假陽性1-2周后復(fù)查甲型肝炎甲型肝炎IgM假陽性排除甲型肝炎抗-HAVIgM陽性抗-HAVIgG陰性IgM陽性IgG陽性IgM陰性IgG陽性IgM陽性IgG陰性4.第16頁/共70頁乙型肝炎病毒HBV顆粒完整HBV：

Daneparticle；球形，42nm，雙層殼膜結(jié)構(gòu)小球形顆粒：22nm，乙肝表面抗原（hepatitisBsurfaceantigen,HBsAg）絲狀(管狀)顆粒：直徑22nm，長短不等，HBsAg18.7萬倍20萬倍25萬倍HBV雙層殼膜結(jié)構(gòu)，外層是HBsAg，內(nèi)層是HBcAg第17頁/共70頁HBV基因與基因產(chǎn)物pre-S1pre-S2ORFSORFPORFXORFCpre-C+-5’5’HBsAgPolymerase:DNApolymeraseRNaseHReversetranscriptaseothers

HBxAgHBcAgHBeAgpre-S1pre-S2第18頁/共70頁HBV主要結(jié)構(gòu)示意圖HBsAgHBcAgHBVDNAHBeAg不是病毒的結(jié)構(gòu)成份第19頁/共70頁HBVPreC/C基因序列1814atgcaactttttcacctctgcctaatcatctcttgttcatgtcctac1861tgttcaagcctccaagctgtgccttggggggctttgggacatggacattg1911accactataaagaatttggagcttctgtggagttactctcttttttgcct1961tttgacttctttccttctattcgagatctcctcgacaccgcctctgctct2011ctatcgagaggccttagagtctccggaacattgttcacctcaccatacag2061cactcaggcaagctgttctgtgttggggtgagttgatgaatctggccacc2111tgggtgggaagtaatttggaagacccagcatccagggaattagtagtcgg2161ctatgtcaatgttaatatgggcctaaaaatcagacaactattggggtttc2211acatttcctgtcttacttttggaagagaaactgttctagagtatttggtg2261tcttttggagtgtggattcgcactcctcccgcttacagaccaccaaatgc2311ccctatcttatcaacacttccggaaactactgttgttagacgacgaggca2361ggtcccctagaagaagaactccctcgcctcgcagacgaaggtctcaatcg2411ccgcgtcgcagaagatctaaatctcgggaatctcaatgttag第20頁/共70頁MQLFHLCLIISCSCPTVQASKLCLGGLWDM

DIDHYKEFGASVELLSFLPFDFFPSIRDLLDTASALYREALESPEHCSPHHTALRQAVLCWGELMNLATWVGSNLEDPASRELVVGYVNVNMGLKIRQLLGFHISCLTFGRETVLEYLVSFGVWIRTPPAYRPPNAPILSTLPETTVVRRRGRSPRRRTPSPRRRRSQSPRRRRSKSRESQC147-149HBVPreC/C編碼HBcAg/HBeAgHBcAg:21.5kDHBeAg:15.5kD第21頁/共70頁HBV抗原5’3’5’3’42nmHBsAgHBcAgHBVDNAHBeAg不是HBV本身的成分是HBcAg的裂解產(chǎn)物能釋放到細(xì)胞外外周血能測到能釋放到細(xì)胞外外周血能測到不能釋放到細(xì)胞外外周血不能測到外周血無游離HBVDNA檢測時先裂解HBVHBV示意圖第22頁/共70頁HBV抗原5’3’5’3’42nmHBsAgHBcAgHBVDNAHBeAg不是HBV本身的成分是HBcAg的裂解產(chǎn)物能釋放到細(xì)胞外外周血能測到能釋放到細(xì)胞外外周血能測到不能釋放到細(xì)胞外外周血不能測到外周血無游離HBVDNA檢測時先裂解HBVHBV示意圖第23頁/共70頁HBV攜帶者肝臟每天釋放1010~12病毒血液HBsAg是HBV的1000~100000倍HBV編碼抗原特點(diǎn)第24頁/共70頁HBsAg抗-HBsHBsAg+，有傳染性HBsAg+和HBeAg+，傳染性強(qiáng)HBsAg-，無傳染性，除隱匿性感染或變異外抗-HBs+，>10mIU/ml，有保護(hù)力HBeAg抗-HBe抗-HBc乙型肝炎病原學(xué)檢測HBVDNA有條件的開展抗病毒治療考核療效第25頁/共70頁乙肝血清學(xué)檢測結(jié)果的意義HBsAg抗-HBsHBeAg抗-HBe抗-HBc臨床意義+-+-+感染、傳染性強(qiáng)+--++感染、有傳染性+--+-感染、有傳染性+---+感染、有傳染性+-+--感染、傳染性強(qiáng)+++/-+/-+/-感染、有傳染性、病毒可能變異+----感染潛伏期、有傳染性+----接種疫苗后、無傳染性第26頁/共70頁HBsAg抗-HBsHBeAg抗-HBe抗-HBc臨床意義-+-++既往感染已恢復(fù)、有保護(hù)力-+--+既往感染已恢復(fù)、有保護(hù)力-+-+-既往感染已恢復(fù)、有保護(hù)力-+---接種疫苗或既往感染已恢復(fù)、有保護(hù)力---++既往感染已恢復(fù)、無保護(hù)力---+-既往感染已恢復(fù)、無保護(hù)力----+既往感染已恢復(fù)、無保護(hù)力-----既往無感染、易感人群乙肝血清學(xué)檢測結(jié)果的意義第27頁/共70頁為什么可通過檢測外周血抗原診斷HBV感染？HBeAg能釋放到細(xì)胞外－－比較容易測到HBsAg能釋放到細(xì)胞外－－可測到HBV攜帶者肝臟每天釋放1010~12病毒血液HBsAg是HBV的1000~100000倍其他病毒復(fù)制過程中，缺乏類似特性，不釋放游離抗原，故通常不檢測抗原，而通過檢測特異性抗體而診斷。以上原因，決定了診斷HBV感染可通過檢測病毒抗原。容易測到第28頁/共70頁抗-HBc的意義抗-HBcIgG：長期存在，陽性時如HBsAg陰性，既往感染抗-HBcIgM：短期存在，陽性時，通常HBsAg也陽性；見于急性感染或慢性攜帶者急性發(fā)作實(shí)際工作中，抗-HBc陽性具有傳染性－－基本不正確－－抗-HBcIgM具有傳染性－－正確目前檢測的抗-HBc是總抗體，包括IgG、IgM等，只要IgG陽性，抗-HBc即陽性；多數(shù)情況下，抗-HBc陽性僅是IgG抗體陽性。正確－－HBsAg陽性具有傳染性第29頁/共70頁HBsAg(－)HBeAg(+)陽性HBV攜帶者M(jìn)arch2008October2008January2009HBsAg(IU/ml)--(0.01)-(0.00)抗-HBs(mIU/ml)++

(5356)+

(11578)

HBeAg++

(72.78)+

(72.89)抗-HBe--(4.33)-(4.28)抗-HBc++

(11.89)+

(15.91)抗-HBcIgMnotdone--ALT(U/L)21.024.221.5HBVDNA(copies/ml)notdone+

(491)+

(370)第30頁/共70頁HBsAg(－)HBeAg(+)陽性攜帶者新的S基因變異PCR產(chǎn)物測序克隆后測序第31頁/共70頁preS2geneHBsAg(－)HBeAg(+)陽性攜帶者前S2基因序列PCR產(chǎn)物測序克隆后測序第32頁/共70頁HBsAg(－)HBeAg(+)陽性HBV攜帶者IF3.124第33頁/共70頁具有研究價值的HBV標(biāo)本HBsAg抗-HBsHBeAg抗-HBe抗-HBc研究內(nèi)容+++/-+/-+/-變異+----轉(zhuǎn)歸+-+--轉(zhuǎn)歸+--+-？抗c陰性-+-+-？抗c陰性-+---？抗c陰性*---+-？抗c陰性*未接種疫苗，即自然感染除外。第34頁/共70頁丙型肝炎病毒HCVHCV30-60nm有包膜的RNA病毒，核心含有核心蛋白和RNA－－單鏈正義HBVHCV抵抗力弱，且RNA容易降解，檢測核酸時，標(biāo)本需在30分鐘內(nèi)分離血清，-80oC保存。第35頁/共70頁Lipidlayer脂質(zhì)層Core,核心蛋白E1,包膜蛋白1E2,包膜蛋白2RNA,病毒核酸直徑30-60nm結(jié)構(gòu)蛋白HCV結(jié)構(gòu)簡圖糖基化蛋白HCV示意圖第36頁/共70頁HCV基因與基因產(chǎn)物hypervariableregion1,HVR1UntranslatedRegion,UTRNoncodingregion,NCR針對HCV所有抗原的抗體都沒有證實(shí)有中和作用第37頁/共70頁HVR138clones15sequencesHCV高度變異HVR1第38頁/共70頁抗原檢測HCVcore:僅用于研究抗-HCVIgM：一般不開展，陽性率低HCVRNA：有條件的開展；抗病毒治療考核療效抗-HCVIgG：開展，(+)通常表示有HCV感染HCV病原學(xué)診斷針對HCV所有抗原的抗體都沒有證實(shí)有中和作用第39頁/共70頁抗-HCVIgM：一般不開展抗-HCVIgG：開展，90-95％的(+)提示HCV感染HCV病原學(xué)診斷－－抗-HCV檢測包被抗原1st代3rd代2nd代50-75%90-95%95-99%陽性率第40頁/共70頁丁型肝炎病毒HDVDeltavirusgenus中的唯一病毒HDV,36nmHDVRNA,1.7kb缺陷病毒，必須有HBsAg第41頁/共70頁HDAg：僅用于研究抗-HDIgM：(＋)近期感染抗-HDIgG：(＋)感染HDVRNA：僅用于研究HDV病原學(xué)檢測僅在HBsAg陽性人群中檢測才有意義：第42頁/共70頁戊型肝炎病毒HEV屬于familyHepeviridae,genusHepevirusHEV,30-32nm無包膜：抗原種類少新的HEV發(fā)現(xiàn)：兔HEV－－王佑春等第43頁/共70頁HEV基因及其蛋白ORF1ORF3？ORF25’3’核衣殼Capsid非結(jié)構(gòu)蛋白結(jié)構(gòu)蛋白主要抗原決定簇中和免疫459607核酸：單鏈正義RNA，7.2kb第44頁/共70頁02468101214轉(zhuǎn)氨酶升高期癥狀期IgMIgG病毒血癥大便排病毒

抗戊肝抗體濃度感染后周數(shù)HEV感染后人體抗體應(yīng)答－－與HAV類似抗-HEVIgM：感染后～3周即可陽性，1-3月后轉(zhuǎn)陰，近期或急性感染。抗-HEVIgG：IgM產(chǎn)生后數(shù)天即可陽性，存在數(shù)十年，單純陽性很可能是既往感染，故單獨(dú)檢測抗-HAVIgG通常不用于診斷。第45頁/共70頁HEV抗原：一般不開展，僅用于研究HEV病原學(xué)檢測－－與甲肝類似抗-HEVIgM：(＋)近期感染抗-HEVIgG：雙份血清HEVRNA：一般不開展，僅用于研究第46頁/共70頁HEV病原診斷－－抗-HEV同時檢測抗HAVIgM和IgG時：4種情況僅檢測抗-HEVIgM時戊型肝炎抗-HEVIgM陽性抗-HEVIgG陽性戊型肝炎1.2.既往感染，對戊肝有免疫力排除戊肝，而且為易感者抗-HEVIgM陰性抗-HEVIgG陽性抗-HEVIgM陰性抗-HEVIgG陰性3.陽性陰性排除第47頁/共70頁同時檢測抗HAVIgM和IgG時：4種情況戊型肝炎早期或IgM假陽性1-2周后復(fù)查戊型肝炎戊型肝炎IgM假陽性排除戊型肝炎抗-HEVIgM陽性抗-HEVIgG陰性IgM陽性IgG陽性IgM陰性IgG陽性IgM陽性IgG陰性4.HEV病原診斷－－抗-HEV第48頁/共70頁抗-HEV檢測試劑質(zhì)量差異很大(國外)方法種類抗原ORF來源病毒+血<6月9例+血>6月20例-血清22例1EIAR2昆蟲巴基91802EIAR2昆蟲緬甸92003WBR2昆蟲緬甸9201[6]4WBR2,3大腸中國8190[1]5EIAR2大腸緬甸91906EIAR2,3大腸緬,墨51407EIAR2,3大腸緬,墨91708EIAR2,3大腸緬,墨614[1]09EIAS3－緬甸115[2]10EIAS2－緬甸7[1]3[6]011EIAS3－緬,墨22012EIAS2,3－緬,墨6100Hepatology1998;27:857-861.第49頁/共70頁12種檢測方法早期康復(fù)期血清抗-HEV滴度Hepatology1998;27:857-861.WBWB昆蟲大腸桿菌合成肽第50頁/共70頁抗-HEVIgG診斷試劑陽性率比較(國內(nèi)外)廠商結(jié)果明確人群(符合率%)總符合率%230例普通人群(%)患者24例非患者30例萬泰+23(95.83)1(3.33)96.3073(31.74)-1(4.17)29(96.67)高達(dá)+21(87.50)094.4440(17.39)-3(12.50)30(100)華美+21(87.50)1(3.33)92.5955(23.91)-3(12.5)29(96.67)GeneLab+16(66.67)085.1818(7.83)-8(33.33)30(100)科華+11(45.83)075.938(3.48)-13(54.17)30(100)不同試劑檢測結(jié)果偏差很大，尤其在血清流行病學(xué)調(diào)查。中華實(shí)驗(yàn)和臨床病毒學(xué)雜志2007;21(1):59-61.第51頁/共70頁抗-HEVIgM抗-HEVIgG檢測方法存在一定假陽性和假陰性第52頁/共70頁607-660ORF21-111458-607ORF3-EORF3-S112391123ORF36601主要抗原決定簇GeneLabs試劑的抗原，間接法JVirolMethods1992;38(1):175–86.包被抗原ORF2ORF31和2型、合成肽和細(xì)菌表達(dá)靈敏度和特異性低第53頁/共70頁ORF2衣殼蛋白，72kDa國產(chǎn)抗-HEV試劑盒所用抗原萬泰公司抗原：IgM，包被mu鏈，酶標(biāo)抗原IgG，包被抗原，酶標(biāo)二抗3946061660特異性高靈敏度較高458-607高達(dá)試劑：合成肽？同時包括了ORF2和ORF3多肽抗原，具體不詳？首都公共衛(wèi)生2007;1(4):168-170.華美公司和科華公司：第54頁/共70頁靈長動物實(shí)驗(yàn)感染后抗-HEVIgM和IgG應(yīng)答Yu,etal.CGLI2003第55頁/共70頁急性戊肝病人抗-HEVIgM和IgG應(yīng)答Seriwatana,etal.CGLI2002第56頁/共70頁如何提高戊型肝炎診斷的準(zhǔn)確性？急性HEV感染，發(fā)病時抗-HEVIgM和IgG通常同時陽性確診同時檢測抗-HEVIgG和IgMIgG＋I(xiàn)gM＋I(xiàn)gG－IgM＋I(xiàn)gG＋I(xiàn)gM－IgG－IgM－1－2周后復(fù)查排除既往感染IgG＋I(xiàn)gM＋I(xiàn)gG－IgM＋I(xiàn)gG－IgM－確診假陽性假陽性第57頁/共70頁Ch1374(Sar-55,I)A450Ch1375(Sar-55,1)458-6071660112-6070.00.53.03.50246810131517112-607458-607475-607475-607Ch1374(Sar-55,1)感染后周數(shù)感染后周數(shù)0.00.51.01.52.02.53.03.50246810131517112-607458-607475-607A4501.01.52.02.5利用抗原主要決定簇多肽的高反應(yīng)性檢測陽性標(biāo)本利用抗原主要決定簇截短肽的無反應(yīng)性排除假陽性如何提高戊型肝炎診斷的準(zhǔn)確性？第58頁/共70頁表達(dá)載體HEVORF21660459459607594ORF2多肽的蛋白表達(dá)472607將重組質(zhì)粒導(dǎo)入大腸桿菌第59頁/共70頁123123123459-607459-594472-607kDa362216ORF2多肽大腸桿菌表達(dá)ORF2多肽SDS電泳結(jié)果第60頁/共70頁459-607459-594472-607459-607459-594472-607kDa36221650二聚體單體SDS加樣緩沖液煮沸5min不加熱ORF2多肽的二聚體特性SDS電泳結(jié)果第61頁/共70頁3622二聚體單體抗-His6抗-HEV抗-HEV459-607459-594472-607459-607459-594472-607459-607459-594472-607抗-HEV僅與ORF2多肽二聚體反應(yīng)1660459459607594472607+--kDaWesternblotting蛋白免疫印跡結(jié)果ORF2第62頁/共70頁點(diǎn)突變對459-607多肽二聚體的影響595562580476二聚體單體SDSWesternblotting突變ORF2多肽無突變無突變595562580476突變ORF2多肽及其抗體反應(yīng)性變化從不同角度證實(shí)抗-HEV僅與二聚體反應(yīng)第63頁/共70頁0.000.501.001.502.002.50E10E15E29E31E32E34E57E83E100E101E102E110E127E130E136E153樣本OD450459-607多肽472-607多肽抗-HEVIgM陽性血清僅與459-607多肽反應(yīng)，幾乎不與472-607多肽反應(yīng)(ELISA檢測結(jié)果)第64頁/共70頁SerumGenelabs

本室OD450ALTOD450Result459-607472-607ResultE42.376+2.5061.206+