微生物工程實(shí)驗(yàn)

微生物工程實(shí)驗(yàn)第1頁，共31頁，2023年，2月20日，星期六發(fā)酵工程實(shí)驗(yàn)室規(guī)則實(shí)驗(yàn)室內(nèi)嚴(yán)禁飲食吸煙。進(jìn)入實(shí)驗(yàn)室需穿實(shí)驗(yàn)服。實(shí)驗(yàn)前將桌面清理趕緊，非必要之用品放入抽屜中，必需用的書籍和文具等也應(yīng)放置在非操作區(qū)，以免污染。坐在實(shí)驗(yàn)椅上操作實(shí)驗(yàn)，勿隨意走動(dòng)或奔跑。實(shí)驗(yàn)進(jìn)行之前應(yīng)確實(shí)了解其目的以及進(jìn)行步驟，才能獨(dú)立操作并于實(shí)驗(yàn)結(jié)束后分析結(jié)果。第2頁，共31頁，2023年，2月20日，星期六認(rèn)真進(jìn)行各項(xiàng)實(shí)驗(yàn)，嚴(yán)格掌握無菌技術(shù)。各個(gè)實(shí)驗(yàn)用品按指定地點(diǎn)存放。實(shí)驗(yàn)中發(fā)生差錯(cuò)或意外事故時(shí)，應(yīng)立即報(bào)告老師及時(shí)處理。切勿隱瞞或自作主張不按規(guī)定處理，如萬一發(fā)生有菌材料污染桌面、衣物等，應(yīng)立即用抹布浸沾2～3%來蘇（或5%石炭酸液），泡在污染部位，經(jīng)半小時(shí)后方可抹去。如手上沾有活菌也用上述消毒液浸泡10分鐘左右，再以肥皂及自來水反復(fù)洗凈。要愛護(hù)室內(nèi)儀器設(shè)備，按使用規(guī)則操作，并應(yīng)節(jié)約使用實(shí)驗(yàn)材料。如不慎損壞了器材等，應(yīng)報(bào)告教師。第3頁，共31頁，2023年，2月20日，星期六做好實(shí)驗(yàn)記錄，寫好實(shí)驗(yàn)報(bào)告。關(guān)于實(shí)驗(yàn)材料：培養(yǎng)基、培養(yǎng)液接種前均應(yīng)清楚標(biāo)示日期、組別、菌名及姓名。實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，使用過的儀器、設(shè)備、器皿一律物歸原處，每組小組長(zhǎng)負(fù)責(zé)清理工作。值日生由各組同學(xué)輪流擔(dān)任，負(fù)責(zé)實(shí)驗(yàn)結(jié)束后的整理、清洗及打掃工作，另外離開實(shí)驗(yàn)室后要負(fù)責(zé)水、電、門、窗的安全。每次使用發(fā)酵罐及實(shí)驗(yàn)過程中換人時(shí)，必須填寫好發(fā)酵罐使用記錄本。實(shí)驗(yàn)過程當(dāng)中，一臺(tái)發(fā)酵罐必須要有至少一人看守。第4頁，共31頁，2023年，2月20日，星期六考核方式（1）實(shí)驗(yàn)報(bào)告：要求報(bào)告內(nèi)容包括：題目、目的、原理、操作步驟、實(shí)驗(yàn)結(jié)果及討論。（2）考核方式：平時(shí)成績(jī)（實(shí)驗(yàn)預(yù)習(xí)、考勤、紀(jì)律、實(shí)驗(yàn)儀器的組裝和使用能力，實(shí)驗(yàn)的技能技巧，實(shí)驗(yàn)態(tài)度以及安全、衛(wèi)生和藥品的節(jié)約等）占40%；實(shí)驗(yàn)報(bào)告占60%。第5頁，共31頁，2023年，2月20日，星期六實(shí)驗(yàn)安排液態(tài)發(fā)酵——酵母菌的上罐發(fā)酵菌種的擴(kuò)培發(fā)酵罐的結(jié)構(gòu)和滅菌單因素實(shí)驗(yàn)的設(shè)計(jì)與取樣單因素實(shí)驗(yàn)比較及生長(zhǎng)曲線的測(cè)定固態(tài)發(fā)酵——葡萄酒的釀制及菌種的分離第6頁，共31頁，2023年，2月20日，星期六實(shí)驗(yàn)一.固體發(fā)酵——葡萄酒的釀制及菌種的分離實(shí)驗(yàn)?zāi)康牧私饨湍妇饔孟轮瞥善咸丫频倪^程。熟悉葡萄酒的制作方法。學(xué)習(xí)從發(fā)酵液中分離酵母菌。實(shí)驗(yàn)原理酵母菌在厭氧的狀態(tài)下可把糖分解為酒精和二氧化碳。葡萄酒就是在酵母菌的作用下釀制而成。第7頁，共31頁，2023年，2月20日，星期六實(shí)驗(yàn)藥品及器材葡萄；白砂糖；發(fā)酵器皿；保鮮膜等實(shí)驗(yàn)步驟清洗：用水整串淋洗，用洗凈的手將葡萄盡量撕揉碎，連皮、籽一起裝罐。。入罐：粉碎后的葡萄果液可裝入清潔最好消毒后的干燥陶瓷、玻璃、無毒塑料容器進(jìn)行前發(fā)酵。（容器要稍大，以保證裝葡萄果液后有30%的空間，因?yàn)閯×野l(fā)酵時(shí)會(huì)產(chǎn)生氣泡，會(huì)將葡萄皮往上翻涌，裝得太滿會(huì)溢出容器）加白糖量：每斤葡萄汁要加40-60克白糖（糖加少了，影響發(fā)酵和酒精度；加多了，成本高。而且糖濃度太大，會(huì)使單細(xì)胞酵母的細(xì)胞壁滲透壓過大，影響生長(zhǎng)）。加糖一般分二次加入。第一次在裝入葡萄后24小時(shí)，加入一半，3-4天后視發(fā)酵情況再加剩余的一半。第8頁，共31頁，2023年，2月20日，星期六前發(fā)酵：裝瓶罐后，先在25-28度環(huán)境里放置24小時(shí)，不要加糖。前發(fā)酵時(shí)容器不能密封，酵母繁殖需要氧氣，發(fā)酵過程中會(huì)產(chǎn)生的二氧化碳需要排除，還要將上浮的果皮按入果液中進(jìn)行攪拌，又要分次加糖攪拌等一系列的操作，都需要開蓋才行。經(jīng)過一周左右發(fā)酵，把糖消耗完畢后自然停止發(fā)酵，果皮不再浮上來，即達(dá)到止發(fā)酵點(diǎn)。6-7天后應(yīng)把皮、籽過濾取出。后發(fā)酵：一般前發(fā)酵7天后，將果汁內(nèi)的皮、籽用篩網(wǎng)或尼龍紗網(wǎng)布過濾取出，用濾紙?jiān)龠^濾一次，裝入清潔容器密封進(jìn)行后發(fā)酵20-30天。此時(shí)容器最好不留空隙，切斷氧氣，防止細(xì)菌侵入。也可在液面上加些食用酒精，酒精比重比葡萄酒小，浮在表面形成保護(hù)層隔斷氧氣。同時(shí)要避光，防止酒色氧化變淺，所以，容器不能用透明的瓶。后發(fā)酵時(shí)用軟木塞密封裝瓶第9頁，共31頁，2023年，2月20日，星期六30天后啟封，可以發(fā)現(xiàn)酒液變澄清，底部有一層沉淀，這是酵母完成歷史使命后的“尸體”及雜質(zhì)。上層的清純酒液同樣用虹吸或過濾的方法再提純一次。用不透光的酒瓶灌裝，然后密封，存放溫度最好在12度，酒瓶橫躺或略微瓶口向下傾斜存放，可保存二年左右。酒精度的測(cè)定：對(duì)第7天，第30天的葡萄酒液測(cè)酒精度用4層紗布過濾發(fā)酵液.量取過濾液100ml于蒸餾瓶中，另加入50ml蒸餾水，加入數(shù)粒玻璃珠防止暴沸，裝上冷凝管，加熱蒸餾，直至餾出液體積約為95ml時(shí)，停止蒸餾。用蒸餾水定容至100ml，用酒精計(jì)測(cè)量，按測(cè)得的實(shí)際溫度和酒精計(jì)示值查附表2，換算成20℃時(shí)的酒精度。實(shí)驗(yàn)結(jié)果及討論從色、香、味以及所測(cè)得的酒精度等方面對(duì)所釀制的葡萄酒進(jìn)行評(píng)價(jià)從葡萄酒中分離野生型酵母菌第10頁，共31頁，2023年，2月20日，星期六取成熟前15天的紫皮中等顆粒的葡萄750克，挑出爛葡萄；摘除蒂，用洗凈的手充分捏碎葡萄；裝入清潔的非金屬容器加蓋，在20-25度環(huán)境中放置24小時(shí)；加入30-40克白糖，用木筷拌勻，并把葡萄皮按入果液中；發(fā)酵3-4天后再加入30-40克白糖拌勻，并把浮起的葡萄皮按入果液中；7天后發(fā)酵停止，用非金屬篩網(wǎng)布和濾紙、細(xì)布過濾去掉葡萄皮及籽；靜止12小時(shí)，用乳膠管虹吸出清純酒液（或用濾紙、細(xì)布過濾）后裝瓶密封；30天后，再過濾一次裝瓶密封、避光、低溫、平躺保存。第11頁，共31頁，2023年，2月20日，星期六酒精度的測(cè)定：對(duì)第7天，第30天的葡萄酒液測(cè)酒精度用4層紗布過濾發(fā)酵液.量取過濾液100ml于蒸餾瓶中，另加入50ml蒸餾水，加入數(shù)粒玻璃珠防止暴沸，裝上冷凝管，加熱蒸餾，直至餾出液體積約為95ml時(shí)，停止蒸餾。用蒸餾水定容至100ml，用酒精計(jì)測(cè)量，按測(cè)得的實(shí)際溫度和酒精計(jì)示值查附表2，換算成20℃時(shí)的酒精度。查閱相關(guān)資料，設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)從葡萄酒中分離野生型酵母菌實(shí)驗(yàn)結(jié)果及討論從色、香、味以及所測(cè)得的酒精度等方面對(duì)所釀制的葡萄酒進(jìn)行評(píng)價(jià)對(duì)分離所得的野生型酵母進(jìn)行描述第12頁，共31頁，2023年，2月20日，星期六實(shí)驗(yàn)二、菌種的擴(kuò)培實(shí)驗(yàn)?zāi)康模菏炀氄莆諢o菌操作技術(shù)了解生物發(fā)酵過程中種子的擴(kuò)培過程

實(shí)驗(yàn)原理：500ml500L10L擴(kuò)培過程第13頁，共31頁，2023年，2月20日，星期六實(shí)驗(yàn)器材實(shí)驗(yàn)儀器搖床1臺(tái)；超凈工作臺(tái)6臺(tái)；電爐6個(gè)；玻璃棒12個(gè)；50ml量筒6個(gè)；500ml量筒6個(gè)；100ml燒杯6個(gè)；500ml燒杯6個(gè)；250ml三角燒瓶12個(gè)；500ml三角燒瓶30個(gè)；接種環(huán)6個(gè)；酒精燈6個(gè)；棉線、紗布、報(bào)紙若干；天平6個(gè)藥品蛋白胨、葡萄糖NH4Cl、蒸餾水菌種酵母菌斜面6支種子培養(yǎng)基及發(fā)酵培養(yǎng)基蛋白胨10g葡萄糖40g，蒸餾水1000ml，pH自然，115℃，20min第14頁，共31頁，2023年，2月20日，星期六實(shí)驗(yàn)步驟斜面的活化：PDA培養(yǎng)基100ml，分裝試管，滅菌后擺成斜面。接酵母于斜面中，28℃，48h種子的培養(yǎng)種子培養(yǎng)液的配置500ml，取部分種子液于2個(gè)250ml錐形瓶，每個(gè)錐形瓶裝50ml（作一級(jí)種子瓶），余下種子液分裝于四個(gè)500ml錐形瓶中，每個(gè)錐形瓶裝100ml（作二級(jí)種子瓶），115℃，20min滅菌。用接種環(huán)挑取斜面2環(huán)轉(zhuǎn)接于一級(jí)種子液中，150rpm，28℃，48h。取一級(jí)種子液，無菌操作將種子液混合均勻以后，用移液槍以10%的接種量接種于二級(jí)種子液中，150rpm，28℃，48h。準(zhǔn)備一瓶無菌蒸餾水500ml，滅菌，待用。第15頁，共31頁，2023年，2月20日，星期六實(shí)驗(yàn)步驟通過按照給定的研究題目，獨(dú)立查閱相關(guān)資料，設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)方案，并對(duì)實(shí)驗(yàn)所需的各種藥品、玻璃儀器及分析設(shè)備列出清單，寫出詳盡的試驗(yàn)過程及需要。各組獨(dú)立的進(jìn)行試驗(yàn)，并觀察試驗(yàn)中的各種現(xiàn)象，分析總結(jié)實(shí)驗(yàn)得出的各種數(shù)據(jù)并撰寫相應(yīng)的研究及實(shí)驗(yàn)報(bào)告等各過程第16頁，共31頁，2023年，2月20日，星期六實(shí)驗(yàn)三、發(fā)酵罐的結(jié)構(gòu)與滅菌

實(shí)驗(yàn)四、單因素實(shí)驗(yàn)的設(shè)計(jì)與取樣

實(shí)驗(yàn)?zāi)康模赫莆招⌒桶l(fā)酵罐管路消毒、空消、實(shí)消、菌種培養(yǎng)等技術(shù)。學(xué)習(xí)掌握小型發(fā)酵罐接種、取樣操作系統(tǒng)。實(shí)驗(yàn)原理：發(fā)酵罐是進(jìn)行液體發(fā)酵的特殊設(shè)備。發(fā)酵罐配備有控制器和各種電極，可以自動(dòng)的調(diào)控實(shí)驗(yàn)所需的培養(yǎng)條件，是微生物學(xué)、遺傳工程、醫(yī)藥工業(yè)等學(xué)科研究所必需的設(shè)備。第17頁，共31頁，2023年，2月20日，星期六第18頁，共31頁，2023年，2月20日，星期六小型發(fā)酵罐：它主要有6部分組成。罐體、攪拌系統(tǒng)、傳熱裝置、通氣系統(tǒng)、消泡系統(tǒng)和各種參數(shù)檢測(cè)器．離位發(fā)酵罐和在位發(fā)酵罐

第19頁，共31頁，2023年，2月20日，星期六第20頁，共31頁，2023年，2月20日，星期六實(shí)驗(yàn)器材高壓蒸汽滅菌鍋3臺(tái)；在位機(jī)械攪拌式發(fā)酵罐3臺(tái)；離位機(jī)械攪拌式發(fā)酵罐3臺(tái)菌種：E.coli種子液；無菌蒸餾水；泡敵鐵架臺(tái)6個(gè)；試管架6個(gè)；三角燒瓶；小試管；酒精棉球若干；工業(yè)用酒精一瓶棉線手套6雙；接種用的大試管60支；第21頁，共31頁，2023年，2月20日，星期六實(shí)驗(yàn)步驟在位發(fā)酵罐滅菌空氣過濾器及管路的消毒：蒸汽經(jīng)空氣過濾器及以后的空氣管道進(jìn)入發(fā)酵罐內(nèi)。壓力保持在0.10～0.11MPa之間。（注：壓力不得超過0.12MPa，否則過濾器芯會(huì)損壞）。消毒時(shí)間為30min。到時(shí)間后，關(guān)閉蒸汽閥。將空氣經(jīng)流量計(jì)進(jìn)入空氣過濾器（0.4VVM），吹干20min?？障号疟M蒸汽管中的冷凝水，使蒸汽從罐底緩慢進(jìn)入發(fā)酵罐（微開）。打開上部蒸汽閥，使蒸汽通過進(jìn)氣管進(jìn)入發(fā)酵罐；對(duì)發(fā)酵罐進(jìn)行空消。在滅菌過程中，應(yīng)時(shí)刻注意罐壓，并控制在0.11～0.12MPa之內(nèi)，空消時(shí)間為30～50min。當(dāng)溫度降至80℃以下時(shí)，才能排盡發(fā)酵罐內(nèi)的冷凝水，隨即關(guān)閉冷凝水閥。調(diào)節(jié)進(jìn)氣管和排氣口，使罐壓保持在0.03～0.05MPa之間。第22頁，共31頁，2023年，2月20日，星期六加培養(yǎng)基液：打開發(fā)酵罐的排氣閥，調(diào)小進(jìn)氣閥得開度，卸去罐內(nèi)壓力；按要求各組配制不同的發(fā)酵培養(yǎng)基2.5L，加入培養(yǎng)基。加消泡劑1.5ml（0.03~0.035%）。擰緊加料口螺母。實(shí)消（必須將安全防護(hù)罩裝上）排盡加熱管的冷凝水，通入蒸汽，加熱培養(yǎng)基，同時(shí)開通電源，開啟攪拌電機(jī)，調(diào)節(jié)電機(jī)轉(zhuǎn)速至150rpm左右，進(jìn)行慢速攪拌。當(dāng)發(fā)酵罐內(nèi)溫度達(dá)到85℃后，打開蒸汽閥門，將蒸汽徐徐進(jìn)入發(fā)酵罐，繼續(xù)升溫。當(dāng)溫度達(dá)到95～100℃后，停止攪拌，并將排氣閥微開。調(diào)節(jié)底部及上部的蒸汽閥及排氣閥，使壓力保持在0.1～0.11MPa之間，嚴(yán)禁超壓。（罐壓不得超過0.12MPa，防止引起設(shè)備的損壞）。實(shí)消時(shí)間一般為20min。到時(shí)間后，關(guān)閉所有的閥門,自然冷卻10min左右。第23頁，共31頁，2023年，2月20日，星期六關(guān)閉加熱管蒸汽閥，通冷卻水打開電磁閥，按冷卻鍵至“自動(dòng)”狀態(tài)。當(dāng)溫度降至發(fā)酵８0℃后，慢速（150rpm）開啟攪拌機(jī)，加速降溫。當(dāng)蒸汽閥門關(guān)閉以及通冷卻水后，發(fā)酵罐的罐壓將迅速下降，當(dāng)罐內(nèi)壓力降至0.03MPa時(shí)，必須間隙開氣進(jìn)氣閥，讓空氣進(jìn)入發(fā)酵罐內(nèi)，并保持壓力在0.03~0.05MPa之間，溫度控制在28℃?！臃椒ǎ捍蜷_排氣閥，用蒸汽消毒20～30min。關(guān)閉蒸汽閥，放出少量料液。關(guān)閉閥門，再用蒸汽消毒。第24頁，共31頁，2023年，2月20日，星期六離位發(fā)酵罐的滅菌實(shí)消關(guān)閉電源開關(guān)，旋下電機(jī)接頭、溫度傳感器接頭、泡沫傳感器接頭、加熱器接頭、pH接頭、DO接頭；向上取出電機(jī)，并妥善放置；取出溫度傳感器、加熱器、pH電極、DO電極。

將2.5L培養(yǎng)液從接種口倒入發(fā)酵罐內(nèi)，蓋上接種口螺帽。將所有閥門擰緊，補(bǔ)料口用硅膠管兩兩連上，保持密封。

進(jìn)氣口與空氣過濾器之間用膠管夾夾住，以防在實(shí)消時(shí)發(fā)酵液倒流至空氣過濾器中，造成過濾器失效。取樣口、進(jìn)氣口及空氣通道必須用夾子加緊。將發(fā)酵罐（連支架）平穩(wěn)的端起，并放入立式滅菌鍋內(nèi)。開啟滅菌鍋進(jìn)行滅菌，115℃，滅菌25分鐘。

第25頁，共31頁，2023年，2月20日，星期六注：滅菌時(shí)間到后，不要手動(dòng)排高壓蒸汽鍋內(nèi)的蒸汽，必須是高壓滅菌鍋內(nèi)的壓力慢慢降下來。如果手動(dòng)排高壓滅菌鍋內(nèi)的正氣，則發(fā)酵罐內(nèi)的物料會(huì)因快速沸騰，造成料液溢出發(fā)酵罐；而且，還可能引發(fā)酵罐內(nèi)的壓力比高壓滅菌鍋內(nèi)的壓力高很多，造成發(fā)酵罐的破裂。

冷卻：實(shí)消結(jié)束后，待發(fā)酵罐在滅菌鍋內(nèi)自然冷卻20min且溫度小于80℃后取出。將電極按原位安裝于發(fā)酵罐頂部，并聯(lián)接妥電機(jī)線。通入空氣；正確連接冷卻水進(jìn)、出管道。打開電源開關(guān)，調(diào)整轉(zhuǎn)速、溫度設(shè)定值（建議：轉(zhuǎn)速：150rpm；溫度：培養(yǎng)溫度）第26頁，共31頁，2023年，2月20日，星期六※取樣方法：打開取樣口的膠管夾即可取出樣液。取樣后，打開取樣管空氣，將取出管中殘留的發(fā)酵液吹出，用膠管夾將取樣口封閉；然后封閉進(jìn)入取樣管的空氣管。注意：必須輕拿輕放，以免引起玻璃筒損傷和損