細(xì)菌分離鑒定實(shí)驗(yàn)原理及操作注意事項(xiàng)實(shí)驗(yàn)員

細(xì)菌分離鑒定實(shí)驗(yàn)原理及操作注意事項(xiàng)實(shí)驗(yàn)員第1頁(yè)/共33頁(yè)*細(xì)菌分離鑒定實(shí)驗(yàn)的意義*建立無(wú)菌概念，了解無(wú)菌操作*常規(guī)病原菌的分離流程*病原菌分離鑒定實(shí)驗(yàn)原理*細(xì)菌對(duì)藥物的敏感性試驗(yàn)*細(xì)菌學(xué)實(shí)驗(yàn)操作注意事項(xiàng)

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3第2頁(yè)/共33頁(yè)意義細(xì)菌分離鑒定實(shí)驗(yàn)超級(jí)耐藥菌健康養(yǎng)殖確診疾病診療方案第3頁(yè)/共33頁(yè)建立無(wú)菌觀念什么是無(wú)菌

無(wú)菌，指沒(méi)有活菌的意思，又是生物技術(shù)中的一個(gè)重要概念。只有在培養(yǎng)基、發(fā)酵設(shè)備等處于無(wú)菌的前提下，微生物接種后，才能實(shí)現(xiàn)純種培養(yǎng)，最終得到所需的產(chǎn)品。第4頁(yè)/共33頁(yè)第5頁(yè)/共33頁(yè)接種方法曲線劃線法、分區(qū)劃線法傾注法、涂布法（細(xì)菌計(jì)數(shù)）斜面接種法（生化鑒定、保存菌種）穿刺培養(yǎng)法（生化鑒定、保存菌種）液體培養(yǎng)基接種法第6頁(yè)/共33頁(yè)第7頁(yè)/共33頁(yè)第8頁(yè)/共33頁(yè)病原菌的分離鑒定細(xì)菌分離培養(yǎng)

主要針對(duì)性用于臨床發(fā)病動(dòng)物組織臟器，糞便中的細(xì)菌時(shí)對(duì)某一種細(xì)菌的分離，通過(guò)分離，使細(xì)菌在平板中分散生長(zhǎng)，便于觀察單個(gè)菌落特性，也易挑取單個(gè)菌落，進(jìn)行生化鑒定。第9頁(yè)/共33頁(yè)1.基本條件（1）接種用具：棉簽、接種環(huán)、接種針、酒精燈（2）培養(yǎng)箱：普通恒溫培養(yǎng)箱（3）無(wú)菌室和超凈工作臺(tái)（4）培養(yǎng)基：營(yíng)養(yǎng)瓊脂、麥康凱瓊脂、SS瓊脂2.接種方法分區(qū)劃線法①用棉簽先將標(biāo)本涂布在平板的第一區(qū)并作數(shù)次劃線，再在二、三……區(qū)依次用接種環(huán)劃線。②每劃一個(gè)區(qū)域，應(yīng)將接種環(huán)燒灼一次，待冷卻后再劃下一區(qū)域。每一區(qū)域的劃分應(yīng)接觸線應(yīng)接觸上一區(qū)域的接種線2—3次，使菌量逐漸減少，以形成單個(gè)菌落。③劃線完畢，將平板加蓋，倒置，以適宜的培養(yǎng)條件培養(yǎng)。第10頁(yè)/共33頁(yè)（2）液體培養(yǎng)基接種法（增菌法）用棉簽或接種環(huán)挑取病料或菌落，在試管壁和液面交界處輕輕研磨，使菌團(tuán)混勻在液體培養(yǎng)基中。（3）傾注平板法主要用于水質(zhì)（飲水）的細(xì)菌計(jì)數(shù)將滅菌生理鹽水適量稀釋?zhuān)ㄍǔＷ?0-1-10-4稀釋?zhuān)┑乃|(zhì)1ml，置滅菌平皿內(nèi)，注入以滅菌溶化并冷卻至50℃左右的培養(yǎng)基15ml，混勻，待冷卻后，倒置。于37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)后，計(jì)數(shù)培養(yǎng)基內(nèi)菌落數(shù)，乘以稀釋倍數(shù)，即可算出每毫升被檢物的細(xì)菌數(shù)。第11頁(yè)/共33頁(yè)大腸桿菌細(xì)菌分離黑色帶有金屬光澤，圓形隆起粉紅色或深紅色、圓形隆起、光滑濕潤(rùn)、邊緣整齊；第12頁(yè)/共33頁(yè)沙門(mén)氏菌細(xì)菌分離圓形、微凸、邊緣整齊、直徑在1～2mm的小菌落，菌落無(wú)色透明、淡黃色透明或外周透明中心黑色藍(lán)綠色或藍(lán)色菌落，產(chǎn)硫化氫菌株菌落中心帶黑色第13頁(yè)/共33頁(yè)實(shí)驗(yàn)室分離鏈球菌在血液瓊脂中生長(zhǎng)為無(wú)色透明、圓形、光滑、隆起的露滴狀小菌落巴氏桿菌在血瓊脂平板生長(zhǎng)為淡灰白色，閃光的露珠狀小菌落第14頁(yè)/共33頁(yè)形態(tài)學(xué)檢查染色標(biāo)本的檢查通過(guò)對(duì)標(biāo)本的涂片及染色觀察細(xì)菌的形態(tài)、大小、排列、染色特性，一及莢膜、鞭毛、芽孢、異染顆粒等結(jié)構(gòu)，有助于細(xì)菌的初步識(shí)別或診斷。1.涂片：從肉湯或平板上挑取菌液或菌落，涂布在滴有生理鹽水的玻片上，涂片厚薄適當(dāng)。2.固定：涂片干燥后，在火焰上迅速通過(guò)3次，加熱固定。3.染色：滴加染液覆蓋菌膜。4.脫色：乙醇是最常用的脫色劑，70%乙醇和無(wú)機(jī)酸脫色能力強(qiáng)。5.復(fù)染：復(fù)染可使脫色的細(xì)菌重新著色。第15頁(yè)/共33頁(yè)常用的染色方法革蘭氏染色法：最常用的一種染色方法（1）染色步驟①結(jié)晶紫初染：結(jié)晶紫染色1.5min，水洗，甩干②碘液媒染：碘液染色2min，水洗，甩干③酒精脫色：95%乙醇脫色，20—30s，脫色到無(wú)結(jié)晶紫為止，水洗，甩干④石碳酸復(fù)紅復(fù)染：石碳酸復(fù)紅染色1.5min，水洗，吸水紙吸干。（2）結(jié)果革蘭氏陽(yáng)性藍(lán)紫色，革蘭氏陰性紫紅色。第16頁(yè)/共33頁(yè)大腸桿菌形態(tài)鑒定第17頁(yè)/共33頁(yè)沙門(mén)氏菌形態(tài)鑒定第18頁(yè)/共33頁(yè)巴氏桿菌形態(tài)鑒定第19頁(yè)/共33頁(yè)鏈球菌形態(tài)鑒定第20頁(yè)/共33頁(yè)葡萄球菌形態(tài)鑒定第21頁(yè)/共33頁(yè)病原菌的生化鑒定

糖類(lèi)發(fā)酵試驗(yàn)原理：不同細(xì)菌含有發(fā)酵不同糖類(lèi)的酶，分解糖能力不同，產(chǎn)生代謝物不同，看細(xì)菌是否分解各類(lèi)糖，是否產(chǎn)酸產(chǎn)氣。

葡萄糖代謝類(lèi)型鑒別試驗(yàn)原理：又稱(chēng)氧化/發(fā)酵試驗(yàn)，觀察細(xì)菌對(duì)葡萄糖分解過(guò)程中是利用分子氧（氧化性），還是無(wú)氧酵解（發(fā)酵型），或不分解葡萄糖（產(chǎn)堿性）

三糖鐵試驗(yàn)原理：三糖鐵用于觀察細(xì)菌對(duì)糖的發(fā)酵能力，以及是否產(chǎn)生硫化氫，可初步鑒定細(xì)菌的菌屬。第22頁(yè)/共33頁(yè)生化鑒定第23頁(yè)/共33頁(yè)

細(xì)菌對(duì)藥物的敏感性試驗(yàn)□

抗菌藥物敏感性試驗(yàn)（AST，藥敏試驗(yàn)）用于測(cè)試抗菌藥物在體外對(duì)病原微生物有無(wú)抑制作用。常用最低抑菌濃度（MIC）表示，即體外能夠抑制細(xì)菌生長(zhǎng)的最低藥物濃度?！醴椒ǎ簲U(kuò)散法（紙片法）稀釋法（瓊脂稀釋法和液體稀釋法）第24頁(yè)/共33頁(yè)快速藥敏試驗(yàn)：由病料直接涂布藥敏試驗(yàn)與病原菌分離同時(shí)進(jìn)行（16-24h），可根據(jù)藥敏結(jié)果初步進(jìn)行治療。前增菌法藥敏試驗(yàn)：挑取組織培養(yǎng)后菌落，放于滅菌肉湯培養(yǎng)液中，涂抹進(jìn)行藥敏實(shí)驗(yàn)8-12h后觀察結(jié)果。

傳統(tǒng)法藥敏試驗(yàn)：耗時(shí)較長(zhǎng)（2-3天），對(duì)于一般養(yǎng)殖場(chǎng)定期監(jiān)測(cè)病原菌及其敏感性時(shí)，可以使用此方法。能較好地分離出病原菌，病原菌經(jīng)純培養(yǎng)后，進(jìn)行藥敏試驗(yàn)，得出的數(shù)據(jù)可以準(zhǔn)確反應(yīng)出病原菌對(duì)某一藥物的敏感性。試驗(yàn)方法第25頁(yè)/共33頁(yè)（1）樣品處理：用滅菌棉簽沾取組織內(nèi)部，然后打開(kāi)裝有增菌液（營(yíng)養(yǎng)肉湯）的管子，使增菌液與棉簽充分混勻，蓋上蓋子，做好標(biāo)記，放入恒溫箱中37℃培養(yǎng)12-24小時(shí)，此肉湯菌液為前增菌液。（2）細(xì)菌分離培養(yǎng)：待取出裝有沾取病變組織滅菌棉簽的試管，觀察營(yíng)養(yǎng)肉湯中的細(xì)菌變混濁。若變混濁，用接種環(huán)挑取菌液，無(wú)菌操作劃線接種于麥康凱瓊脂、SS瓊脂，37℃培養(yǎng)12-24h，觀察是否有細(xì)菌生長(zhǎng)，初步判定感染病原菌的類(lèi)型。操作過(guò)程前增菌藥敏試驗(yàn)第26頁(yè)/共33頁(yè)（3）涂板、貼紙片：

用滅菌棉簽沾取稀釋的培養(yǎng)液，在管壁清碰幾下，擠掉多余水分，均勻涂抹于營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板上，反復(fù)幾次，每次將平板旋轉(zhuǎn)60度，最后沿周邊繞兩圈，保證涂均勻，并貼上藥敏紙片，37℃倒置培養(yǎng)8-18h，觀察結(jié)果。操作過(guò)程第27頁(yè)/共33頁(yè)（4）結(jié)果觀察、判定標(biāo)準(zhǔn)

抑菌圈：用游標(biāo)卡尺從平板背面精確測(cè)量各個(gè)抑菌圈直徑（精確到0.01mm），抑菌圈的邊緣以肉眼見(jiàn)不到細(xì)菌明顯生長(zhǎng)為限。原料藥判定按《抗微生物藥物敏感性試驗(yàn)執(zhí)行標(biāo)準(zhǔn)2010》成品藥判定標(biāo)準(zhǔn)：﹥20mm極敏15-20mm高敏10-14mm中敏＜10mm不敏

選藥原則：敏感而價(jià)格低的藥，實(shí)際的運(yùn)用過(guò)程中應(yīng)交叉給藥，以減少耐藥菌株的產(chǎn)生第28頁(yè)/共33頁(yè)第29頁(yè)/共33頁(yè)第30頁(yè)/共33頁(yè)細(xì)菌學(xué)實(shí)驗(yàn)操作注