細(xì)胞分選技術(shù)

細(xì)胞分選技術(shù)第1頁，共35頁，2023年，2月20日，星期日細(xì)胞分選和基本原理細(xì)胞分選是把一種細(xì)胞從多細(xì)胞樣品中分離出來用抗體標(biāo)記細(xì)胞，同時被用的抗體被螢光標(biāo)記或連接免疫磁珠或其它利用螢光和免疫磁珠的特性來分離細(xì)胞第2頁，共35頁，2023年，2月20日，星期日細(xì)胞分選常用方法密度梯度離心(Ficoll)離心抗體標(biāo)記分離免疫密度離心免疫磁珠流式第3頁，共35頁，2023年，2月20日，星期日正選和負(fù)選正選需要得細(xì)胞標(biāo)記需要得細(xì)胞需要得細(xì)胞標(biāo)記不需要得細(xì)胞負(fù)選第4頁，共35頁，2023年，2月20日，星期日正選只需要一種抗體分離出的細(xì)胞純度高對于比例小的細(xì)胞群，正選容易得到高純度正選和負(fù)選的比較優(yōu)點負(fù)選需要的細(xì)胞沒有被抗體等標(biāo)記對需要的細(xì)胞，不需要特異性的細(xì)胞標(biāo)記缺點需要多種抗體標(biāo)記不需要的細(xì)胞需要特異性的靶細(xì)胞標(biāo)記可能引起細(xì)胞活化第5頁，共35頁，2023年，2月20日，星期日細(xì)胞分選產(chǎn)品第6頁，共35頁，2023年，2月20日，星期日StemCellTechnologiesInc.

的細(xì)胞分選原理利用抗體四聚體(TetramericAntibodyComplex,TAC)來分選細(xì)胞TACCell磁珠直接標(biāo)記TACCell磁珠間接標(biāo)記第7頁，共35頁，2023年，2月20日，星期日適用于人的全血細(xì)胞樣品是一種負(fù)選方法基本原理：抗體標(biāo)記和免疫密度離心法需要的儀器：離心機(jī)第8頁，共35頁，2023年，2月20日，星期日DirectLabelingofHumanCells不需要的細(xì)胞第9頁，共35頁，2023年，2月20日，星期日離心把細(xì)胞樣品置于密度分離液上分選的過程標(biāo)記把RosetteSep?抗體混合液加入細(xì)胞樣品中室溫下20分鐘用緩沖液稀釋收集第10頁，共35頁，2023年，2月20日，星期日的密度分離液DM-L為了最大限度回收淋巴細(xì)胞，StemCell專門研制了一種適合RosetteSep?的密度分離液——DM-LDM-L的密度：1.081g/mLDM-L的滲透壓與人外周血的滲透壓相同(iso-osmolar)適用于以下的淋巴細(xì)胞分選:CD3+Tcells - CD8+TcellsCD4+Tcells - Bcells第11頁，共35頁，2023年，2月20日，星期日DensityofFreshLeukocytesFrom:“CentrifugationTechniquesIII”,NycomedAmersham

MonocytesLymphocytesBasophilsNeutrophilsEosinophilsErythrocytes1.060 1.070 1.080 1.090 1.100Densitying/mLDM-L:1.081g/mLFicoll:1.077g/mL第12頁，共35頁，2023年，2月20日，星期日低溫冷藏的外周血單個核細(xì)胞人和小鼠脾細(xì)胞第13頁，共35頁，2023年，2月20日，星期日負(fù)選,只需要離心機(jī)可以同時分選多份樣品取決于離心機(jī)的容量分選的細(xì)胞量在106

cellsinEppendorf-109cellsin50mLtube適用于低溫冷藏的人外周血單個核細(xì)胞(PBMC)和小鼠脾細(xì)胞的特點Sep第14頁，共35頁，2023年，2月20日，星期日直接標(biāo)記人的細(xì)胞Anti-cellAnti-particleTetramericAntibodyComplex(TAC)DenseParticle(1mm)UnwantedCell第15頁，共35頁，2023年，2月20日，星期日間接標(biāo)記小鼠的細(xì)胞

TetramericAntibodyComplex(TAC)BiotinylatedAntibodyAnti-Anti-BiotinParticleDenseParticle(1mm)UnwantedCell第16頁，共35頁，2023年，2月20日，星期日SpinSep的分選過程LabelLayer&SpinCollectAntibodyCocktailAnti-BiotinTAC(mouseonly)DenseParticles4. LayeroverSpinSep?DensityMediumSpin10-20minat1200xgCollectalmostentirevolume7.WashtoremoveDensityMedium第17頁，共35頁，2023年，2月20日，星期日的細(xì)胞分選資料人的外周血細(xì)胞(PBMC)小鼠的脾細(xì)胞Valuesarethemean±SD第18頁，共35頁，2023年，2月20日，星期日新型，高效，易行的免疫磁珠分選技術(shù)新：不用柱子，只需用磁極，所用的磁珠很小高效：效率-分選過程不用洗細(xì)胞(省時省力);效果-分選的細(xì)胞純度高易：操作過程簡單易行廣：可做正選和負(fù)選適應(yīng)性強(qiáng)：在理論上可以分選任何一種細(xì)胞第19頁，共35頁，2023年，2月20日，星期日

Anti- Anti-CellParticleTetramericAntibodyComplex(TAC)MagneticNanoparticle(160nm)直接標(biāo)記人的細(xì)胞Cell第20頁，共35頁，2023年，2月20日，星期日MagneticNanoparticle(160nm)TetramericAntibodyComplex(TAC)Biotin/FluoAntibodyAnti-Anti-biotin/FluoParticle間接標(biāo)記小鼠細(xì)胞Cell第21頁，共35頁，2023年，2月20日，星期日RelativeSizesofMagneticParticlesusedinCellSeparationCell第22頁，共35頁，2023年，2月20日，星期日的細(xì)胞分選過程

Ab(TAC)(人)

Abbiotinanti-biotinTAC(小鼠)標(biāo)記放置磁極中倒出未標(biāo)記的細(xì)胞分選結(jié)合磁珠加入免疫磁珠孵育后稀釋第23頁，共35頁，2023年，2月20日，星期日正選資料人的外周血細(xì)胞(PBMC)小鼠脾或骨髓細(xì)胞第24頁，共35頁，2023年，2月20日，星期日負(fù)選資料人的外周血細(xì)胞(PBMC)小鼠脾細(xì)胞第25頁，共35頁，2023年，2月20日，星期日可正選或去除任何一種細(xì)胞PE標(biāo)記的抗體分選KitFITC標(biāo)記的抗體分選KitBiotin標(biāo)記的抗體分選KitCell第26頁，共35頁，2023年，2月20日，星期日細(xì)胞分選常見的問題分選方法的選擇樣品種類樣品數(shù)量每次需要分選的細(xì)胞數(shù)第27頁，共35頁，2023年，2月20日，星期日常見問題樣品的前處理Ficoll離心機(jī)全血和單采的細(xì)胞細(xì)胞計數(shù)稀釋液細(xì)胞數(shù)第28頁，共35頁，2023年，2月20日，星期日常見問題分選過程中細(xì)胞濃度緩沖液細(xì)胞混勻動作要點第29頁，共35頁，2023年，2月20日，星期日CalculatingPurityandRecovery%Purity = #desiredcellsinenrichedfractionx100

#totalnucleatedcellsinenrichedfraction = %oftotaleventsinthedesiredcellgate(FACSprofile)%Recovery = #desiredcellsinenrichedfractionx100

#desiredcellsinstart

= (%purityinenriched)x(totalnucleatedcellsinenriched)x100 (%purityinstart)x(totalnucleatedcellsinstart)第30頁，共35頁，2023年，2月20日，星期日FACSGate第31頁，共35頁，2023年，2月20日，星期日panNK+SelectedfromMoSpleenStartNK+Selected第32頁，共35頁，2023年，2月20日，星期日Dataanalysis第33頁，共35頁，2023年，2月20日，星期日的技術(shù)要領(lǐng)細(xì)胞稀釋后，用吸管混勻細(xì)胞（不要倒置試管）倒出未標(biāo)記的細(xì)胞時，讓液體連續(xù)流淌