基因組測序與序列組裝

基因組測序與序列組裝基因組測序與序列組裝第1頁主要內(nèi)容:什么是基因組什么是基因DNA測序方法DNA序列組裝人類基因組計(jì)劃水稻基因組計(jì)劃后基因組學(xué)基因組測序與序列組裝第2頁1.什么是基因組

基因組就是一個物種中全部基因整體組成?；蚪M有兩層意義：遺傳物質(zhì)和遺傳信息。要揭開生命奧秘，就需要從整體水平研究基因存在、基因結(jié)構(gòu)與功效、基因之間相互關(guān)系。基因組測序與序列組裝第3頁Zeamays8,000Homosapiens3,000Oryzasativa400Drosophilamelanogaster165Arabidopsisthaliana100Saccharomycescerevisiae12E.coli4.6GenomeSize(Mb)基因組測序與序列組裝第4頁什么是C值？通常是指一個生物單倍體基因組DNA總量.

在真核生物中，C值普通伴隨生物進(jìn)化而增加，高等生物C值普通大于低等生物。

C值悖理：生物復(fù)雜性與基因組大小并不完全成百分比增加基因組測序與序列組裝第5頁細(xì)菌真菌等動物陰影個別為一個門內(nèi)C-值范圍基因組測序與序列組裝第6頁重復(fù)次序高度重復(fù)次序：長度：幾個——幾千個bp

拷貝數(shù)：幾百個——上百萬個首尾相連，串聯(lián)排列集中分布于染色體特定區(qū)段（如端粒，著絲粒等）也稱衛(wèi)星DNA中度重復(fù)次序：普通分散于整個基因組中；長度和拷貝數(shù)差異很大單一次序：基因主要位于單一次序動物中單一次序約占50％植物中單一次序約占20％基因組測序與序列組裝第7頁

是遺傳信息物理和功效單位，包含產(chǎn)生一條多肽鏈或功效RNA所必需全部核苷酸序列。

基因分類：編碼RNA基因，如rRNA基因，snRNA基因等；編碼蛋白質(zhì)基因2.什么是基因？基因組測序與序列組裝第8頁基因不連續(xù)性Intron和Exon:大多數(shù)真核生物蛋白質(zhì)基因編碼次序(Exon)都被或長或短非編碼次序(Intron)隔開基因組測序與序列組裝第9頁基因家族

一群含有一致或相同次序基因,有還擔(dān)負(fù)類似生物學(xué)功效,能夠相互賠償,比如:E2ftranscriptionfactorMousesymbolHumanOrthologE2f1E2F1E2f2E2F2E2f3E2F3E2f4E2F4E2f5E2F5E2f6E2F6基因組測序與序列組裝第10頁假基因(Pseudogene)起源于功效基因但已失去活性DNA序列產(chǎn)生假基因原因有:由重復(fù)產(chǎn)生假基因;加工假基因,由RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA后再整合到基因組中;殘缺基因(Truncatedgene)基因組測序與序列組裝第11頁重合基因:同一段DNA能攜帶兩種不一樣蛋白信息.

重迭基因有以下幾個情況：*一個基因完全在另一個基因內(nèi)部*個別重合*兩個基因共用少數(shù)堿基對基因組測序與序列組裝第12頁*一個基因完全在另一個基因內(nèi)部如：B和A，E和D

其讀碼結(jié)構(gòu)互不相同---ATG-----//------AATGCC----//---ATAACG---//--TAA----A*BATGCCN----NNATAA基因組測序與序列組裝第13頁*個別重合如：K和C*兩個基因共用少數(shù)堿基對如：D和J-------TAATG-------D終止密碼子J起始密碼子基因組測序與序列組裝第14頁3.DNA測序方法鏈終止法測序化學(xué)降解法測序自動化測序非常規(guī)DNA測序基因組測序與序列組裝第15頁3.1鏈終止法測序(thechainterminationmethod)

基礎(chǔ)原理:

經(jīng)過合成與單鏈DNA互補(bǔ)多核苷酸鏈，因?yàn)楹铣苫パa(bǔ)鏈可在不一樣位置隨機(jī)終止反應(yīng)，產(chǎn)生只差一個核苷酸DNA分子，從而來讀取待測DNA分子次序?；蚪M測序與序列組裝第16頁技術(shù)路線與要求制備單鏈模板↓將單鏈模板與一小段引物退火↓加入DNA多聚酶

4種脫氧核苷酸分別加入少許4種雙脫氧核苷酸

↓將4種反應(yīng)產(chǎn)物分別在4條泳道電泳↓依據(jù)4個堿基在4條泳道終止位置讀出基因序列

A克隆于質(zhì)粒中DNA→用堿或熱變性BM13克隆單鏈DNAC噬粒克隆DNADPCR產(chǎn)生單鏈DNAA高酶活性B無5’→3′外切酶活性C無3′→5′外切酶活性ddATP/ddCTP/ddGTP/ddTTP3’碳原子連接是氫原子,不是羥基基因組測序與序列組裝第17頁基因組測序與序列組裝第18頁基因組測序與序列組裝第19頁3.2化學(xué)降解法測序基礎(chǔ)原理:

在選定核苷酸堿基中引入化學(xué)基團(tuán)，再用化合物處理，使DNA分子在被修飾位置降解。基因組測序與序列組裝第20頁技術(shù)路線

將雙鏈DNA樣品變?yōu)閱捂湣總€單鏈同一方向末端都用放射性同位素標(biāo)識，方便顯示DNA條帶↓分別用不一樣方法處理，取得只差一個核苷酸降解DNA群體↓電泳，讀取DNA核苷酸次序基因組測序與序列組裝第21頁Maxam-Gilbert法所用化學(xué)技術(shù)

堿基特異修飾方法GPh8.0,用硫酸二甲酯對N7進(jìn)行甲基化,使C8-C9鍵對堿基裂解有特殊敏感性A+GpH2.0哌啶甲酸可使嘌呤環(huán)N原子化,從而造成脫嘌呤,并所以消弱腺嘌呤和鳥嘌呤糖苷鍵C+T肼可打開嘧啶環(huán),后者重新環(huán)化成五元環(huán)后易除去C1.5mol/LNaCl存在時,可用肼除去胞嘧啶基因組測序與序列組裝第22頁化學(xué)法測序?qū)嵗哙せ蚪M測序與序列組裝第23頁3.3自動化測序基礎(chǔ)原理與鏈終止法測序原理相同,只是用不一樣熒光色彩標(biāo)識ddNTP,如ddATP標(biāo)識紅色熒光,ddCTP標(biāo)識藍(lán)色熒光,ddGTP標(biāo)識黃色熒光,ddTTP標(biāo)識綠色熒光.因?yàn)槊糠NddNTP帶有各自特定熒光顏色,而簡化為由1個泳道同時判讀4種堿基.基因組測序與序列組裝第24頁基因組測序與序列組裝第25頁3.4非常規(guī)測序毛細(xì)管電泳

用毛細(xì)管電泳取代聚丙烯凝膠平板電泳，節(jié)約時間，加緊測序進(jìn)程，其它程序同鏈終止法或化學(xué)測序法。

基因組測序與序列組裝第26頁DNA芯片測序基礎(chǔ)原理將各種排列次序寡核苷酸點(diǎn)播在芯片上,每個點(diǎn)播寡核苷酸在排列方陣中都有指定位置.待檢測DNA分子與芯片溫浴,凡是能雜交寡核苷酸都會在確定位置發(fā)出信號,然后依據(jù)獲取信息將寡核苷酸次序進(jìn)行對比組裝,拼接成完全DNA次序.基因組測序與序列組裝第27頁利用基因芯片進(jìn)行雜交測序原理基因組測序與序列組裝第28頁4序列組裝4.1隨機(jī)測序與序列組裝

隨機(jī)測序也稱”鳥槍法”。序列組裝原理：直接從已測序小片段中尋找彼此重合測序克隆，然后依次向兩側(cè)鄰接序列延伸。優(yōu)點(diǎn):不需預(yù)先了解任何基因組情況.ABCABCABCABC小片段測序計(jì)算機(jī)拼裝基因組測序與序列組裝第29頁ABC小片段測序計(jì)算機(jī)拼裝鳥槍法(Shotgun)測序問題CAATGCATTA……GCAGCCAATGCGAP錯裝基因組測序與序列組裝第30頁實(shí)例:流感嗜血桿菌基因組測序及序列組裝超聲波打斷純化基因組DNA↓瓊脂糖電泳搜集1.6～2.0Kb區(qū)段、純化

↓構(gòu)建到質(zhì)粒載體中↓隨機(jī)挑選19687個克隆,進(jìn)行28643次測序,得到可讀次序?yàn)?1631485bp↓組裝成140個覆蓋全基因組范圍獨(dú)立次序重合群,↓基因組測序與序列組裝第31頁

各重合群間仍有間隙

次序間隙物理間隙

↓↓

載體或宿主菌選取不妥而被丟失次序測序時遺漏測序處理方法:經(jīng)過相鄰已知次序作為探針篩選已經(jīng)有基因組文庫處理方法:利用其它宿主菌與載體重新構(gòu)建文庫基因組測序與序列組裝第32頁4.2

限制測序

限制測序：是指將一段染色體區(qū)段DNA序列進(jìn)行組裝.

一些已繪制了遺傳圖與物理圖微生物基因組測序中也采取這一方法.

如高等植物擬南芥基因組測序完全依據(jù)克盛大疊群，先進(jìn)行各個BAC克隆隨機(jī)測序，再進(jìn)行序列組裝；

水稻基因組測序計(jì)劃采取策略與此相同.基因組測序與序列組裝第33頁4.3

指導(dǎo)測序與序列組裝

建立在基因組圖譜基礎(chǔ)上”鳥槍法”,即所謂”指導(dǎo)鳥槍法”或”指導(dǎo)測序”。在人類基因組進(jìn)入測序組裝階段就采取此方法，其基礎(chǔ)步驟以下:A構(gòu)建平均為2Kb人類基因組質(zhì)粒文庫,進(jìn)行雙向測序;B構(gòu)建平均10Kb人類基因組質(zhì)粒文庫,進(jìn)行雙向測序,讀取2個端部次序;C參考人類基因組圖,尤其是大量STS位標(biāo)作為基點(diǎn),進(jìn)行序列組裝，排成重合克隆群.基因組測序與序列組裝第34頁

先將染色體打成比較大片段(幾十-幾百Kb),利用分子標(biāo)識將這些大片段排成重合克隆群(Contig),分別測序后拼裝.這種策略叫基于克隆群(contig-based)策略.ABCABC大片段contig小片段測序拼裝基因組測序與序列組裝第35頁兩種策略比較鳥槍法策略

指導(dǎo)測序策略不需背景信息構(gòu)建克隆群

(遺傳、物理圖譜)時間短需要幾年時間需要大型計(jì)算機(jī)得到是草圖(Draft)得到精細(xì)圖譜基因組測序與序列組裝第36頁4.5

其它測序路線主要區(qū)域優(yōu)先測序大家對感興趣基因或與疾病相關(guān)基因優(yōu)先測序.如:人類主要組織相容性復(fù)合區(qū)位于第6號染色體,與人類免疫系統(tǒng)相關(guān)，因而優(yōu)先測序.基因組測序與序列組裝第37頁EST(Expressedsequencetag)測序