植物功能基因組研究技術(shù)進展課件

植物功能基因組研究引言結(jié)構(gòu)基因組學(xué)代表基因組分析的早期階段，以建立生物體高分辨率遺傳、物理和轉(zhuǎn)錄圖譜為主功能基因組學(xué)代表基因分析的新階段，是利用結(jié)構(gòu)基因組學(xué)提供的信息系統(tǒng)地研究基因功能，它以高通量、大規(guī)模實驗方法以及統(tǒng)計與計算機分析為特征基因的功能

生物學(xué)功能，如作為蛋白質(zhì)激酶對特異蛋白質(zhì)進行磷酸化修飾；細胞學(xué)功能，如參與細胞間和細胞內(nèi)信號傳遞途徑；發(fā)育上功能，如參與形態(tài)建成等。

突變體是研究基因功能的傳統(tǒng)方法

promotorexoninonT-DNA插入突變機理terminator獲得突變體的方法物理因素；指某些射線，如Y射線、X射線、B射線和中子流等；化學(xué)誘變劑:指某些烷化劑，堿基類似物，抗生素等化學(xué)藥物。由重組DNA技術(shù)衍生出的插入突變:它是人為地造成某一待研究基因的突變體，并根據(jù)由此帶來的表型特征的改變來分析該基因的功能，然后再進行基因等分子水平上的研究，水稻突變體多柱頭巨胚米雙胚苗水稻突變體庫研究進展1998年，國際水稻遺傳協(xié)會報告了571個定位的突變體基因2005年6月，Gramene網(wǎng)站報道了1488個水稻突變體，Oryzabase網(wǎng)站公布了約1698個水稻突變體和基因(含數(shù)量性狀基因)，突變體的缺陷這主要表現(xiàn)在突變必須被測序或者做圖以證明他們的位置，并且突變材料的大規(guī)模收集必須要通過對整個基因組進行篩選。這些限制也就意味著基因組規(guī)模上的突變：技術(shù)含量底，工作量過大。而且突變具有很大的隨機性，經(jīng)常給實驗帶來不便，反義RNA反義RNA作用機理B、光合作用的Lhca4基因功能的研究Lhca1和Lhca4編碼LHCⅠ蛋白,該蛋白是光合系統(tǒng)ⅠPSⅠ的葉綠素a

Pb結(jié)合蛋白。通過反義技術(shù),

Zhang等研究Lhca4的功能。實驗表明,在轉(zhuǎn)基因株系中,Lhca4蛋白的減少并未引起Lhca1蛋白的降低,由于Lhca4蛋白的減少,低溫熒光發(fā)射光譜明顯地改變了,而且發(fā)射最大值向藍光偏移了6nm,說明與Lhca4相關(guān)的葉綠素分子與長波長熒光發(fā)射光譜有關(guān)。C、番茄的pTOM5基因功能鑒定

利用反義RNA技術(shù)對基因表達部分抑制可以產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因株系。pTOM5基因是番茄果實成熟過程中類胡蘿卜素的合成基因。pTOM5反義基因轉(zhuǎn)入番茄中,果實呈黃色,花呈淡黃色,類胡蘿卜素合成受阻,含量減少了97%。由此推測pTOM5是控制果實成熟及類胡蘿卜素合成的一個基因。RNAiRNAi作用機理由于擬南芥是目前植物基因組資源研究最深入的植物種類,所以RNAi技術(shù)在植物功能基因組中的研究主要體現(xiàn)在擬南芥功能基因組的研究上,

CATMA

(CompleteArabidopsistranscrip2tiomemicroarray)計劃以及AGRIKOLA

(ArabidopsisgenomicRNAiknock-outlineanalysis)都在應(yīng)用RNAi進行大規(guī)模的擬南芥功能基因組的分析。除此之外,RNAi技術(shù)在其它植物功能基因分析中也得到嘗試.例如Kenichi等(2004)應(yīng)用RNAi技術(shù)分析并證實phEIN2基因在牽?；ㄖ幸蚁┬盘杺鲗?dǎo)中具有重要作用,Senthil等(2005)用RNAi技術(shù)分析了異黃酮合成酶基因在大豆子葉及根部的作用效果及其對異黃銅積累的影響,證實大豆子葉對基于RNAi的基因功能分析有效。李小平等（2006）根據(jù)植物中hpRNA(hairpinRNA)的原理，以大豆類受體蛋白激酶基因rlpk2為靶基因，成功敲減((knock-down)rlpk2基因，并且發(fā)現(xiàn)敲減大豆葉片中的rlpk2基因表達明顯改善大豆葉片的光合能力。Godfrey等（2005）用RNAi的方法研究了MPK6基因使植物對臭氧比對照敏感，而MPK3對臭氧也有相似的反應(yīng)，從而推斷這兩個MAPKs在對臭氧的調(diào)節(jié)方面的機理是相似的?；虮磉_的系統(tǒng)分析(原理)從轉(zhuǎn)錄本的3′端特定位置分離出的該轉(zhuǎn)錄本特異的標簽(tag)包含有足夠的能代表該轉(zhuǎn)錄本所需之信息,依SAGE方法之不同,這一標簽的長度通常在9～14個核苷酸之間變化。將多個短序列標簽串連在一個克隆中，通過測序以連續(xù)的方式同時分析多個標簽及其代表的轉(zhuǎn)錄子，明顯提高了分析效率。根據(jù)測序結(jié)果，計算某一標簽出現(xiàn)的次數(shù)來確定相應(yīng)轉(zhuǎn)錄子的拷貝數(shù)與表達水平。用p1和p2為引物PCR再次用錨定酶酶切基因表達的系統(tǒng)分析(步驟)用PAGE膠分離把30-50個這樣的標簽連接起來克隆到pZE1O-1

測序錨定酶的性質(zhì)NlaIII是一種非常廣泛的限制性內(nèi)切酶,平均每250bp就有一個NlaIII的識別位點,此酶可識別CATG四核苷酸的回文序列,因此經(jīng)此酶切割后所得之cDNA的3′端含有一個懸垂在外的GTAC四核苷酸GTACCATGCATGGGGACCATGGGGACAp1Bp2接口A、B的結(jié)構(gòu)及其連接與酶切生物素生物素SAGE技術(shù)在鑒定植物基因功能中的應(yīng)用水稻和酵母等模式生物的研究中發(fā)揮了重要的作用。此外,Matsumura等(1999)還從水稻秧苗中分離出10122個標簽并發(fā)現(xiàn)其中的23.1%可與1367個水稻的cDNA、EST匹配。其中許多高表達的基因均屬編碼核糖體蛋白、或與新陳代謝和細胞結(jié)構(gòu)有關(guān)的管家基因。孫亮先（2006）對水稻幼苗SAGE文庫的構(gòu)建也進行了探索試驗?；蛐酒脑韺ふ倚禄?并推測一些已知基因的功能SekiMetal利用各種發(fā)育時期,經(jīng)不同處理(干旱、冷害及未經(jīng)脅迫處理)的擬南芥構(gòu)建cDNA文庫,從中得到了1300個全長的cDNA,并制作成cDNA芯片,與特異探針進行雜交,結(jié)果1300種cDNA中有44種是受干早誘導(dǎo),19種受冷害誘導(dǎo),其中30種和10種是從未報道過的脅迫誘導(dǎo)基因,并且12種脅迫誘導(dǎo)基因被鑒定為受DREB1調(diào)控的靶基因,其中6個是未報道過的新基因(MotoakiS,etal,2001)。ArumugamKathiresan,H.R等（2006）用基因芯片技術(shù)研究了水稻在干旱脅迫的條件下，mRNA的表達情況。由于其干旱時有一個或多個基因變化，因此用基因芯片技術(shù)有較大的優(yōu)勢。問題與展望物理、化學(xué)誘變、基因沉默以及插入突變等方法都可以用