顯微鏡直接計數(shù)法

第二節(jié)顯微鏡直接計數(shù)法顯微鏡直接計數(shù)法是將小量待測樣品的懸浮液置于一種特別的具有確定面積和容積的載玻片上（又稱計菌器），于顯微鏡下直接計數(shù)，然后推算出含菌數(shù)的一種方法。血球計數(shù)板是常用的計菌器之一。血球計數(shù)板是一種專門用于計算較大單細胞微生物的一種儀器，由一塊比普通載玻片厚的特制玻片制成的玻片中有四條下凹的槽，構成三個平臺。中間的平臺較寬，其中間又被一短橫槽隔為兩半，每半邊上面刻有一個方格網(wǎng)。方格網(wǎng)上刻有9個大方格，其中只有中間的一個大方格為計數(shù)室。這一大方格的長和寬各為1mm，深度為0.1mm，其容積為0.1mm3，即1mm×1mm×0.1mm方格的計數(shù)板；大方格的長和寬各2mm，深度為0.1mm，其容積為0.4mm3，即2mm×2mm×0.1mm方格的計數(shù)板。在血球計數(shù)板上，刻有一些符號和數(shù)字，其含義是：XB-K-25為計數(shù)板的型號和規(guī)格，表示此計數(shù)板分25個中格；0.1mm為蓋上蓋玻片后計數(shù)室的高；1/400mm2表示計數(shù)室面積是1mm2，分400個小格，每小格面積是1/400mm2。一、血球計數(shù)板的使用原理計數(shù)室通常也有兩種規(guī)格：一種是16×25型，即大方格內分為16中格，每一中格又分為25小格；另一種是25×16型，即大方格內分為25中格，每一中格又分為16小格。但是不管計數(shù)室是哪一種構造，它們都有一個共同的特點，即每一大方格都是由16×25=25×16=400個小方格組成。1．16×25型的計數(shù)板

將計數(shù)室放大，可見它含16中格，一般取四角：1、4、13、16四個中方格（100個小方格）計數(shù)。將每一中格放大，可見25個小格。計數(shù)重復3次，取其平均值。計數(shù)完畢后，依下列公式計算：酵母細胞個數(shù)／1mL=100個小方格細胞總數(shù)/100×400×10000×稀釋倍數(shù)2．25×16型的計數(shù)板

中央大方格以雙線等分成25個中方格，每個中方格又分成16個小方格，供細胞計數(shù)用。一般計數(shù)四個角和中央的五個中方格（80個小方格）的細胞數(shù)。計數(shù)重復3次，取其平均值。計數(shù)完畢后，依公式計算：酵母細胞個數(shù)／1mL＝80個小方格細胞總數(shù)/80×400×10000×稀釋倍數(shù)二、血球計數(shù)板的使用方法步驟使用血球計數(shù)板計數(shù)時，按照如下的實驗步驟進行：1．鏡檢計數(shù)室。在加樣前，先對計數(shù)板的計數(shù)室進行鏡檢。若有污物，則需清洗，吹干后才能進行計數(shù)；2．加樣品。將清潔干燥的血球計數(shù)板的計數(shù)室上加蓋專用的蓋玻片，用吸管吸取稀釋后的酵母菌懸液，滴于蓋玻片邊緣，讓培養(yǎng)液自行緩緩滲入，一次性充滿計數(shù)室，防止產(chǎn)生氣泡，充入細胞懸液的量以不超過計數(shù)室臺面與蓋玻片之間的矩形邊緣為宜；多余培養(yǎng)液可用濾紙吸去。3．計數(shù)。稍待片刻（約5min），待酵母菌細胞全部沉降到計數(shù)室底部后，將計數(shù)板放在載物臺的中央，先在低倍鏡下找到計數(shù)室所在位置后，再轉換高倍鏡觀察、計數(shù)并記錄。調節(jié)顯微鏡光線的強弱適當，對于用反光鏡采光的顯微鏡還要注意光線不要偏向一邊，否則視野中不易看清楚計數(shù)室方格線，或只見豎線或只見橫線。4.在計數(shù)前若發(fā)現(xiàn)菌液太濃或太稀，需重新調節(jié)稀釋度后再計數(shù)。一般樣品稀釋度要求每小格內約有5~10個菌體為宜。每個計數(shù)室選5個中格(可選4個角和中央的一個中格)中的菌體進行計數(shù)。位于格線上的菌體一般只數(shù)上方和右邊線上的。如遇酵母出芽，芽體大小達到母細胞的一半時，即作為兩個菌體計數(shù)。計數(shù)一個樣品要從兩個計數(shù)室中計得的平均數(shù)值來計算樣品的含菌量。三、血球計數(shù)板的使用注意事項1．從試管中吸出培養(yǎng)液進行計數(shù)之前，要將試管輕輕震蕩幾下，這樣使酵母菌分布均勻，防止酵母凝聚沉淀，提高計數(shù)的代表性和準確性，求得的培養(yǎng)液中的酵母菌數(shù)量誤差小。2．如果一個小方格內酵母菌過多，難以數(shù)清，應當對培養(yǎng)液進行稀釋以便于酵母菌的計數(shù)。具體方法是：搖勻試管，取1mL酵母菌培養(yǎng)液，加入成倍的無菌水稀釋，稀釋n倍后，再用血球計數(shù)板計數(shù)，所得數(shù)值乘以稀釋倍數(shù)。以每小方格內含有4—5個酵母細胞為宜。特別是在培養(yǎng)后期的樣液需要稀釋后計數(shù)。3．活酵母有芽殖現(xiàn)象，若芽體達到母細胞大小的一半時，即可作為兩個菌體計數(shù)，若芽體小于母細胞一半時為1個酵母細胞。4．對于壓在方格界線上的酵母菌應當計數(shù)同側相鄰兩邊上的菌體數(shù)，一般可采取“數(shù)上線不數(shù)下線，數(shù)左線不數(shù)右線”的原則處理，另兩邊不計數(shù)。計數(shù)時，如果使用16格×25格規(guī)格的計數(shù)室，要按對角線位，取左上、右上、左下、右下4個中格(即100個小格)的酵母菌數(shù)；如果規(guī)格為25格×16格的計數(shù)板，除了取其4個對角方位外，還需再數(shù)中央的一個中格(即80個小方格)的酵母菌數(shù)。5．計數(shù)一個樣品要從兩個計數(shù)室中計得的平均數(shù)值來計算，對每個樣品可計數(shù)三次，再取其平均值。計數(shù)時應不時調節(jié)焦距，才能觀察到不同深度的菌體。按公式計算每1ml（或10mL）菌液中所含的酵母菌個數(shù)。6．血球計數(shù)板的清潔：血球計數(shù)板使用