多糖結(jié)構(gòu)解析

多糖（Polysaccharide）是天然大分子物質(zhì)，是天然化合物中最大族之一。多糖結(jié)構(gòu)的分析較蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)分析復(fù)雜，一方面是因?yàn)榻M成多糖的單糖品種繁多（目前已知的單糖有200多種）；另一方面即使只有一種單糖組成的多糖其連接方式的不同以及可能有分枝（蛋白質(zhì)沒(méi)有分枝），所以多糖的結(jié)構(gòu)種類(lèi)就很多，不容易分析。2021/10/101多糖結(jié)構(gòu)測(cè)定的意義從天然物質(zhì)中分離得到的單體多糖化合物即使具有很強(qiáng)的活性與具有較大的安全性，但如果結(jié)構(gòu)不清楚，則無(wú)法進(jìn)一步開(kāi)展其藥理學(xué)與毒理學(xué)研究，也就不可能進(jìn)行人工合成或結(jié)構(gòu)修飾改造工作，更談不上進(jìn)行高質(zhì)量的新藥開(kāi)發(fā)研究，其學(xué)術(shù)及應(yīng)用價(jià)值將會(huì)大大降低。2021/10/102結(jié)構(gòu)研究的主要程序(1)初步推斷化合物類(lèi)型1注意觀察樣品在提取、分離過(guò)程中的行為。2測(cè)定有關(guān)理化性質(zhì)，如不同pH，不同溶劑中的溶解度及層析行為，灼燒實(shí)驗(yàn)，化學(xué)定性反應(yīng)等。3結(jié)合文獻(xiàn)調(diào)研。(2)測(cè)定分子式,計(jì)算不飽和度1、元素定量分析2、分子量測(cè)定3、同位素峰法4、HI–MS等2021/10/103(3)確定分子式中含有的官能團(tuán)（基本骨架等的結(jié)構(gòu)分析）1、官能團(tuán)的定性及定量2、測(cè)定并解析化合物的有關(guān)光譜（UV,IR,MS,HNMR,CNMR等）(4)推斷并確定分子的平面結(jié)構(gòu)1、結(jié)合文獻(xiàn)調(diào)研2、結(jié)合光譜解析及官能團(tuán)定性定量分析結(jié)果。(5)推斷并確定分子的主體結(jié)構(gòu)1、測(cè)定CD或ORD譜2、測(cè)定NOE,NOESY或ZD-NMR譜3、進(jìn)行X射線晶體衍射分析或人工合成2021/10/104一、組成成分分析1、酸水解1-3N硫酸，100℃，水解6-8小時(shí)。用碳酸鋇中和，G4漏斗過(guò)濾，蒸發(fā)皿蒸干。氣相色譜分析紙層析（PG）：展開(kāi)劑：正丁醇∶乙酸∶水=4∶1∶5；正丁醇∶吡啶∶水=6∶4∶3顯色劑：常用硝酸銀顯色劑A：16%硝酸銀水溶液∶丙酮=1∶9（V/V）B：1%NaOH乙醇溶液（W/V）C：6mol/L氫氧化銨

①噴試劑A，室溫風(fēng)干；②將紙浸入B液中，待斑點(diǎn)顯色；③再浸入C中以洗去濾紙上的氧化銀；④水沖洗1小時(shí)左右，風(fēng)干，顯棕黑色斑點(diǎn)。

2021/10/1052、乙酰解冰醋酸溶液加入少許硫酸進(jìn)行乙酰解，可以生成乙?；瘑翁峭ㄟ^(guò)氣相色譜鑒定。原因：因?yàn)?-6糖苷鍵多糖對(duì)酸水解相對(duì)穩(wěn)定一些，但在乙酰解中則優(yōu)先斷裂，有利于結(jié)構(gòu)的研究。3、堿降解4、酶解2021/10/106二、糖與蛋白之間連接鍵型分析

β-消除反應(yīng)

原理：糖溫和條件下稀堿水解，可以把與肽鏈上絲氨酸的羥基或蘇氨酸的羥基相連的單糖或糖鏈水解下來(lái)。與天冬酰胺相連的N-型連鍵則不能被稀堿水解下來(lái)。所以，β-消除反應(yīng)在糖蛋白的結(jié)構(gòu)分析中，常被用來(lái)區(qū)別糖鏈的連接性質(zhì)。

方法：將糖樣品用濃度為0.2mol/L的NaOH溶解，在60℃水浴反應(yīng)1hr.。以0.2mol/L的NaOH溶液為參比，在230-270nm范圍內(nèi)掃描。

結(jié)果判斷：在270nm處無(wú)明顯吸收峰增加，提示：糖與蛋白之間的連接鍵屬非O-型糖苷鍵。2021/10/107三、結(jié)構(gòu)研究的化學(xué)方法完全酸水解闡明結(jié)構(gòu)的第一步就是鑒別多糖的單糖組成。多糖酸水解是常用的方法。多糖水解的難易與其組分中單糖的性質(zhì)、單糖環(huán)的形狀和糖苷鍵的構(gòu)型等有關(guān)；含有糖醛酸或氨基糖的多糖不易水解，α型較β型易水解，吡喃型戊聚糖較吡喃型己聚糖易水解，呋喃糖苷鍵一般較吡喃糖苷鍵易水解。水解后中和水解液，然后用層析方法分析，常用的層析方法有紙層析、纖維粉薄層層析和氣相層析。近幾年這種酸水解方法分析已經(jīng)達(dá)到完全自動(dòng)化。部分酸水解控制水解條件得到幾個(gè)單糖連在一起的寡聚糖。水解得到的較低分子量的寡聚糖可用凝膠過(guò)濾、離子交換和分配層析等方法分離。其中最常用的為硅膠擠壓層析和碳柱層析以及后來(lái)發(fā)展起來(lái)的高壓液相層析。解析寡糖結(jié)構(gòu)較多糖簡(jiǎn)便的多，但需減少回復(fù)現(xiàn)象，水解時(shí)多糖的濃度小于5%。2021/10/108堿降解反應(yīng)堿降解通常發(fā)生在單糖的羥基或羧基連接的酯上。多糖還原端的單糖逐個(gè)被剝落的堿降解反應(yīng)常稱為“剝皮反應(yīng)”。分析多糖堿降解所得到的醛酸就可推斷出原來(lái)單糖的鍵型。酶降解反應(yīng)發(fā)生在分子的非還原端。過(guò)碘酸及其鹽的氧化反應(yīng)多糖的非還原末端或非末端的（1→6）鍵與鄰三元醇相似，其與過(guò)碘酸鹽作用則糖環(huán)開(kāi)裂得到一分子比例的甲酸而消耗二分子比例之過(guò)碘酸鹽。非末端的（1→2）或（1→4）鍵與鄰二元醇相似，其開(kāi)裂后產(chǎn)生二分子醛而消耗一分子比例之過(guò)碘酸鹽。對(duì)于非末端的（1→3）鍵或C-2和C-4有分枝的則不受過(guò)碘酸鹽影響。因此多糖氧化后定量測(cè)定過(guò)碘酸鹽的消耗、甲酸的生成和剩余糖的比例，就可確定多糖中各種單糖的鍵型及其比例。2021/10/109

1、過(guò)（高）碘酸氧化

原理：可選擇性斷裂糖分子中連二羥基或連三羥基，生成相應(yīng)的多糖醛、甲醛或甲酸。

結(jié)果：

12或14鍵：每個(gè)糖基僅消耗一個(gè)分子的高碘酸，無(wú)甲酸釋放。

13位鍵：不被高碘酸氧化

16位鍵：消耗兩個(gè)分子高碘酸，同時(shí)釋放一個(gè)分子甲酸。然后用0.1mol/L氫氧化鈉溶液滴定甲酸釋放量。

防止發(fā)生超氧化：控制pH3-5；避光；空白對(duì)照實(shí)驗(yàn)

2021/10/10101→、1→6鍵型以1→2位鍵合(1→2,6類(lèi)似)以1→4位鍵合(1→4,6類(lèi)似)

以1→3位鍵合(1→3,6、1→2，3、1→2，4、1→3，4、1→2，3，4類(lèi)似)2021/10/10112、Smith降解：是將氧化產(chǎn)物還原后進(jìn)行酸水解。

2位和16位鍵結(jié)合的經(jīng)Smith降解后都有甘油產(chǎn)生。（但12位結(jié)合的不產(chǎn)生甲酸，可供以區(qū)別）。

14鍵合的，最后得到的是乙二醇和丁四醇（赤蘚醇）。16鍵合的，最后得到的是甲酸、乙二醇和甘油。14鍵合的戊糖聚糖，相應(yīng)的產(chǎn)物是乙烯二醇和甘油。

操作：高碘酸氧化：多糖液加入一定量的15-20mmol/L高碘酸鈉溶液。黑暗攪拌反應(yīng)，定時(shí)取樣在222nm測(cè)定光密度值，直到光密度值下降到穩(wěn)定為止（不再下降）。

2021/10/1012（1）高碘酸消耗量：用0.01mol/L標(biāo)準(zhǔn)碘液滴定高碘酸消耗量（2）甲酸成：將樣品溶液加少量乙二醇，放置10分鐘后（以中止反應(yīng)還原剩余的高碘酸），然后用0.01mol/L氫氧化鈉滴定甲酸的釋放量。（3）降解：上述反應(yīng)物加入1ml乙二醇、對(duì)蒸餾水透析24小時(shí)。減壓濃縮至小體積，加硼氫化鈉還原。用2N硫酸水解（100℃，6hr），碳酸鋇中和

紙層析（需標(biāo)樣）、薄層色譜層析、氣相層析2021/10/10133、甲基化（單糖殘基的連接方式）

是用甲基化試劑將糖分子中的游離羥基甲基化成甲醚，然后水解，檢識(shí)這些甲基糖產(chǎn)物，就可能推測(cè)組成多糖分子中單糖間連接的位置（羥基所在的位置，即為原來(lái)單糖殘基的連接點(diǎn)）。（氫化鈉、碘甲烷）（1）制備負(fù)碳離子：無(wú)水二甲亞砜30ml于100ml試劑瓶中，通入氮?dú)鈳追昼姾?，加?.5gNaH，漸漸加溫，然后恒溫在65-70℃4-6小時(shí)。最終顏色為墨綠色。整個(gè)過(guò)程通氮，并攪拌。

2021/10/1014（2）多糖甲基化精確稱取純多糖200mg，加35ml無(wú)水二甲亞砜，通氮下攪拌至完全溶解后，加入18-20ml制備的負(fù)碳離子液，通氮下攪拌4-6小時(shí)，然后加入8ml碘甲烷，通氮條件下攪拌1-2小時(shí)后，停止通氮，繼續(xù)攪拌過(guò)夜。注：糖液加入負(fù)碳離子后，液漸變?yōu)槌赛S色；加碘甲烷后液由混濁變清徹。2021/10/1015（3）透析產(chǎn)物加蒸餾水稀釋一倍，蒸餾水透析2-3天（換水）（4）真空干燥（或凍干），得部分甲基化多糖，需進(jìn)一步甲基化（5）進(jìn)一步甲基化：

重復(fù)1-4的Hakomorimethods氧化銀法（6）產(chǎn)物：甲基化產(chǎn)物用氯仿溶解，萃取，收集氯仿層，干燥得甲基化糖。

甲基化產(chǎn)物分析氣相色譜法。

2021/10/1016（7）水解、還原和乙?；偎?。完全甲基化的多糖真空干燥后，加85%甲酸1ml，充N(xiāo)2封管，100℃水解4小時(shí)，然后加甲醇蒸除甲酸，至pH為67，真空干燥，再加入2mol/L三氟乙酸2ml，100℃水解6小時(shí)，然后用無(wú)水乙醇趕除三氟乙酸至中性，再用蒸餾水趕除乙醇。②還原。加入NaBH460mg還原24小時(shí)，室溫磁力攪拌；然后加入半匙陽(yáng)離子交換樹(shù)脂，磁力攪拌2小時(shí)，定量濾紙過(guò)濾，向?yàn)V液中加入甲醇蒸除硼酸，真空干燥;③乙?；＜右音?、無(wú)水吡啶各0.5ml，封管，100℃乙?；?小時(shí)，然后移入蒸發(fā)皿，再反復(fù)加無(wú)水乙醇趕除乙酐，然后真空干燥;(8)樣品分析。產(chǎn)物干燥后，用少許氯仿溶解，進(jìn)行GC分析及GCMS分析。2021/10/10171

（二甲基亞砜）（二甲基亞砜磺酰陰離子）

（糖）（糖羥基-醇鈉）

（碘甲烷）（甲醚甲基化糖）以(1→4)葡聚糖為例:

（甲基化）2342021/10/1018

（水解、還原）

(2,3,4,6-O-四甲基Glc)(2,3,6-O-三甲基Glc)(2,3,6-O-三甲基Glc)2021/10/1019(1)各種單糖甲基化衍生物的基峰均為43，為CH3CO+;(2)被甲基化，乙酰化的單糖分子中，帶有甲氧基的碳原子容易與相鄰碳原子間發(fā)生斷鍵，形成正離子。斷裂方式如下:主要碎片(m/e)為：45.117.161.205由161、205進(jìn)一步裂解為71.87.101.129.145。實(shí)際所得碎片為:45.71.87.101.117.129.145.161.2052021/10/10204、多糖中的乙酰基定位

原理：利用甲基乙烯醚將多糖結(jié)構(gòu)上的游離羥基保護(hù)起來(lái)，脫去乙?；菇Y(jié)合的羥基游離。對(duì)游離羥基進(jìn)行甲基化，去除保護(hù)基團(tuán)并完全水解。單糖上甲基化的位置即是原始多糖中的乙酰位置。

2021/10/1021

操作：保護(hù)自由羥基：多糖樣品（93mg），懸浮于二甲亞砜（12ml）加入P-甲苯磺酸（20mg），15℃混勻。將冷至-10℃的甲基乙烯醚（5ml）滴加于上述液中，讓在15℃條件下反應(yīng)4hr。自來(lái)水透析

40℃下減壓濃縮至干，（以上步驟重復(fù)三次）上SephadexLH-20柱，丙酮洗脫，10ml/管收集，合并10-17管。濃縮至干，紅外檢測(cè)，樣品在3400cm-1有吸收峰。

2021/10/1022脫乙?；鲜鎏茄苌锶苡?5ml甲醇，攪拌條件下加入15ml0.2mol/L甲醇鈉的甲醇液?；旌弦涸?5℃回流4hr，濃縮后上SephadexLH-20柱，甲醇洗脫，10ml/管收集，合并14-24管，濃縮干燥。紅外光譜結(jié)果顯示無(wú)乙?；鶊F(tuán)（1260與1730cm-1無(wú)吸收峰）2021/10/1023甲基化去乙酰基多糖衍生物溶于5mlN，N-二甲基甲酰胺，在攪拌下相繼加入2ml碘甲烷和0.4g氧化銀。室溫暗處攪拌反應(yīng)20小時(shí)。過(guò)濾，殘?jiān)寐确孪?，合并濾液，濃縮至干，重復(fù)甲基化6次。最后的濾液加20ml水和4ml10%氰化鈉，氯仿萃取5次（水洗）。干燥后上柱，氯仿-甲醇洗脫，3ml/管收集，合并9-15管，濃縮至干。紅外光譜表明甲基化反應(yīng)完全。2021/10/1024甲基化產(chǎn)物分析

氣相色譜分析。2021/10/1025四、糖苷酶（酶水解）酶水解是多糖控制降解的另一種方法，它主要根據(jù)特定的酶才能降解特定結(jié)構(gòu)多糖的特性以闡明多糖的部分結(jié)構(gòu)。

α-淀粉酶；β-淀粉酶

2021/10/1026五、光譜法糖苷鍵的測(cè)定：除上述酶法外比旋：較大的比旋正值常是α型（α型糖苷鍵）；較大的比旋負(fù)值常是β-糖苷鍵。紅外光譜：（紫外光譜測(cè)核酸、蛋白質(zhì)）

890cm-1吸收峰是β-吡喃糖苷鍵的特征840cm-1吸收峰是α-吡喃糖苷鍵的特征在1100-1010cm-1：有三個(gè)強(qiáng)吸收峰是吡喃糖苷；只有二個(gè)峰是呋喃糖苷810、870cm-1是甘露糖的特征吸收峰1260與1730cm-1是酯基或O-乙?；奶卣魑辗?。

2021/10/1027原理：紅外光譜又稱為分子振動(dòng)轉(zhuǎn)動(dòng)光譜，也是一種分子吸收光譜。不僅能進(jìn)行定性和定量分析，而且從分子的特征吸收可以鑒定化合物和分子結(jié)構(gòu)。分析依據(jù)：官能團(tuán)具有特征吸收頻率基本頻率區(qū)和指紋區(qū)儀器：色散型紅外光譜儀組成部分：光源吸收池單色器檢測(cè)器記錄系統(tǒng)KBr壓片法：玻璃、石英等材料不能透過(guò)紅外光，紅外吸收池要用可透過(guò)紅外光的NaCl、KBr、CsI等材料制成窗片，固體試樣常與純KBr混勻壓片，然后直接進(jìn)行測(cè)定。將1-2mg試樣與200mg純KBr研細(xì)混勻，置于模具中，用（5-10）×107Pa壓力在油壓機(jī)上壓成透明薄片，即可用于測(cè)定。試樣和KBr都應(yīng)經(jīng)干燥處理，研磨到粒度小于2μm，以免散射光影響。KBr在4000-40