抗癌藥物Aurora激酶抑制劑的發(fā)現(xiàn)與發(fā)展

抗癌藥物Aurora激酶抑制劑的發(fā)現(xiàn)與發(fā)展引言：細胞分裂或者有絲分裂的過程是高度復雜并且受到嚴格控制的。在一個細胞周期中，DNA被復制，并隨著紡錘體微管的形成，一起分配進入到兩個子代細胞中（見圖1）。不完全的有絲分裂導致了遺傳不穩(wěn)定性，較大頻率產(chǎn)生包含沒有雙倍體DNA內(nèi)容的細胞（少于或者多于2次復制DNA）。這些表型幾乎是人類所有癌細胞的標志。以阻塞腫瘤細胞連續(xù)分裂為目標的有絲分裂器的重要組成部分在該領域的研究中十分緊要。這項努力的成果是已將若干抗癌藥物推向市場，并為進一步達到目標提供了證據(jù)。例子包括紫杉烷類和長春花生物堿類在內(nèi)的，以有絲分裂中紡錘體的形成為首要靶點的微管組成。近來，有絲分裂器的替換部件成為研究新的抗癌藥物的努力目標。這其中包括帶有危險性信號的激酶，如Aurora、PlK，和Cdk激酶以及重要的動力蛋白比如KSP1。圖1Aurora激酶是一組三種高度同源的絲氨酸一一蘇氨酸蛋白激酶在有絲分裂過程中起到重要的調(diào)節(jié)作用。從1995年發(fā)現(xiàn)到1998年第一次應用到人體癌變組織表達的觀察，這些激酶成為腫瘤學業(yè)界學術與生產(chǎn)雙方面的緊張調(diào)研對象。這項努力取得了豐碩的成果，到目前為止，10余種Aurora抑制劑通過了早期臨床評價。這些帶有典型特征的復合物相對于其他絕大多數(shù)激酶而言具有很好的選擇性，他們中的大部分的交叉反應即激酶的一個微小設置是與腫瘤生物學有關的。這其中最顯著的代表是Abl和Flt-3激酶。Aurora激酶抑制劑可以再細分到三個普遍種類：擁有的對Aurora-A的選擇性超過Aurora-B的選擇性，擁有的對Aurora-B的選擇性超過Aurora-A的選擇性，第三種蛋白抑制劑則同時擁有對Aurora-A和Aurora-B的選擇性。迄今為止，沒有資料顯示這些替換物的選擇性在臨床上的不同。然而，在潛伏期應用這些復合物作為工具以及生物學技術的應用比如siRNA的消耗，為洞察每一個Aurora激酶的差動效應提供了大量證據(jù)。由于有使用其他靶向藥物的案例，一份詳盡的報告宣告靶向藥物在腫瘤生物學中可以起到巨大沖擊力的臨床試驗獲得成功。這份報告可以幫助解釋大部分病人可能響應去試藥，幫助解釋研究設計的終點，也能夠更好的將其他推向市場的藥物焦點結合研究。這篇文章將概述每一個Aurora激酶在有絲分裂和腫瘤生物學中扮演的角色，并且討論不同Aurora激酶選擇性差異能夠影響細胞和候選藥物活性。另外，大量Aurora激酶的生物體結構資料將被回顧。這可以用來提供一份Aurora激酶候選藥物的交叉反應性原理，并將回顧怎樣在Aurora激酶家族中選擇得以實現(xiàn)。最后，這份臨床候選靶向藥物Aurora激酶的發(fā)現(xiàn)與發(fā)展將綜述并簡要討論其顯要的構效關系（SAR）。Aurora激酶和有絲分裂為數(shù)眾多的研究利用了生物消耗和禁止技術為證實Aurora激酶在有絲分裂中起到的作用提供了見解。這些已然被到處描述和評論過。一篇睿智的個體亞型功能總結，自從各種不同選擇性的資料從各方面證實了Aurora激酶在細胞基礎上的活性探討之后，無論如何都是應該的。Aurora-A：Aurora-A是包含在有絲分裂早期活動的調(diào)節(jié)中，也包括參與有絲分裂。蛋白質(zhì)的表達和激酶活性在細胞周期G2階段的上升并在早期有絲分裂中達到頂峰（圖1）。從對單極紡錘體的頻繁觀察中發(fā)現(xiàn)，Aurora-A的消耗導致參與有絲分裂延遲，并標志著紡錘體的分裂。在分子水平，Aurora-A在有絲分裂其余過程中起到的作用被完全闡明；然而，有一些決定性的發(fā)現(xiàn)可以幫助解釋某些資料對Aurora-A的禁用并幫助鑒別其特殊的生物標志物。Aurora-A能夠使Cdc25b磷酸化，直接調(diào)節(jié)細胞周期蛋白B1-Cdk1的合成。這項合成的激活是有絲分裂進行的一個必要條件以及能夠證實Aurora-A在有絲分裂過程中起調(diào)節(jié)作用的基礎。觀察發(fā)現(xiàn)，單極紡錘體形成在Aurora-A消耗之后被認為是在中心小體成熟和分離的缺陷，也是紡錘體形成的微管組織的缺陷。Aurora-A通過減緩蛋白質(zhì)對于中心小體的補充來調(diào)節(jié)中心小體的成熟，這是自身聚集紡錘體微管成分的要素，比如Y-微管蛋白。這些決定性的蛋白質(zhì)包括TPX-2，Ajuba，Bora，和Lats等，都能夠有效調(diào)節(jié)Aurora-A的活性，如同一個重要反饋環(huán)的一部分。除了在中心小體成熟中作用之外，Aurora-A也與中心小體的分離有關。磷酸化激酶動力蛋白Eg5,一個中心小體分離的決定性驅(qū)動器，通過Aurora-A被描述。Eg5的作用是引起兩個中心小體間相互重疊的微管分離。最后，一份關于Aurora-A在在調(diào)節(jié)紡錘體微管網(wǎng)狀系統(tǒng)中所起到的作用的非正式報告開始浮出水面。在一個模擬中，Aurora-A對于EXTAH復合蛋白鋅合成起到了決定性調(diào)節(jié)作用。這次合成包含了蛋白質(zhì)如Eg5,XMAP2154,Aurora-A，和HURP，具有微管鑲邊、交聯(lián)、激酶活性等。將其結合在一起，可以使其交聯(lián)耦合并固定在成長中的微管網(wǎng)狀系統(tǒng)中。這個復合物的許多組成部分是Aurora-A的自身基質(zhì)。任何復雜紡錘體合成的組成部分的一點破壞，導致大量單極紡錘體形成。很明顯，Aurora-A在諸多決定有絲分裂及因Aurora-A的消耗而導致有絲分裂副產(chǎn)物形成的過程中扮演了極為重要的角色。因此，可以預言，Aurora-A選擇性的抑制將對抗有絲分裂產(chǎn)生深遠的影響。抑制Aurora-A而產(chǎn)生的槽膛內(nèi)形將如預料中的延遲有絲分裂的進入繼之以由于畸變的紡錘體形成產(chǎn)生的缺陷性染色體分離，這將導致異倍體的產(chǎn)生（含有非二倍體DNA）。消耗研究同樣表明，隨之而來的有絲分裂缺陷，細胞處理Aurora-A抑制劑將隨著細胞的衰亡消除。Aurora-B:Aurora-B是催化合成染色體乘客復合體（CPC）的組成成分，決定了有絲分裂的連續(xù)進行與完成。此復合物由四種蛋白質(zhì)組成，即Aurora-B，存活素（survivin），INCENP，和borealin。該復合物的非催化組分則部分起到調(diào)節(jié)局限和激活Aurora-B的作用。該復合物任何組分的消耗，都能對其他組分產(chǎn)生負面影響，并且破壞有絲分裂的連續(xù)進行。存活素（survivin），INCENP，和borealin都是Aurora-B的已知基質(zhì)，盡管存活素（survivin）和borealin對磷酸化的影響還是未知的，但就INCENP而言，似乎在反饋環(huán)中是起到了積極的作用。CPC最初是在沿著染色體臂集中于著絲點之前，染色體結構復制的區(qū)域內(nèi)即姊妹染色單體連接的地方形成的。它最終固定在細胞質(zhì)分裂的紡錘體中間（見圖2）。CPC的局限與有絲分裂的倍數(shù)一致。這包括染色體凝結，兩極紡錘體的形成，有絲分裂紡錘體中染色體附著物，調(diào)節(jié)紡錘體檢驗點，以及完成細胞質(zhì)分裂。monote^ic synteiic merotelic amphrtelrc圖2染色體凝結是分離復制DNA的前提。組蛋白是已知的凝結過程的決定性中介物質(zhì)，Aurora-B調(diào)節(jié)活性，再通過Ser10和Ser28磷酸化，形成關鍵的組蛋白H3。在Ser10上磷酸化的組蛋白H3相當于標示Aurora-B體外活性的生物標記。一旦染色體都凝結，并和中心體分離，就形成了一個雙極主軸。CPC在促進紡錘體形成的過程中起了重要的作用。明確的是，Aurora-B的磷酸化和對微管負面調(diào)節(jié)將破壞19KDa磷蛋白。此外，Aurora-B的蛋白磷酸化可以使MCAK解聚；阻止該行為將導致細胞無法形成兩極紡錘體。一旦有絲分裂紡錘體開始形成，兩個姊妹染色單體就要從兩極對立的主軸上連接到微管。這種連接是通過一個存在于每一個染色單體中間如著絲點一般的多蛋白復合物實現(xiàn)的。失敗的著絲點固定在準確的紡錘體上會導致染色體異常。為了避免不恰當?shù)倪B接，細胞同時破壞了不正確的附著物和穩(wěn)定正確的附著物“amphitelic”。CPC在這些過程中都起到重要的調(diào)節(jié)作用。在不適當?shù)倪B接發(fā)生時，Aurora-B使一個稱為KMN的多蛋白復合物磷酸化。這一復合物使微管與著絲點結合。Aurora-B的磷酸化干擾其固定到微管，導致著絲點釋放。相反地，在吸引正確的著絲點過程中，Aurora-B使微管解聚酶MCAK磷酸化，抑制其活性，從而使紡錘體固定。Aurora-B除了在促進著絲點到微管附著物中起作用之外，CPC在維持附著物通過細胞的準確性方面也扮演著一個十分重要的角色。這一過程中，被稱為紡錘體檢驗點的物質(zhì)，起到了阻塞深入連續(xù)通過有絲分裂直到所有著絲點都正確的固定作用。檢驗點阻塞了一個無所不在的被稱為后期促進復合物（APC）連接酶的催化作用，同時也阻塞了分離蛋白酶的催化。以上一起分開兩個姊妹染色單體的連接。由CPC調(diào)節(jié)的檢驗點，由未連接的著絲點激活。檢驗點本身包含了多種蛋白質(zhì)；其中大部分是知名的如BubRl和Bubl激酶以及Mad蛋白質(zhì)（Mad1和Mad2）。綜上，這些固定了未連接的著絲點并直接抑制APC。Aurora-B已經(jīng)顯示出作為檢驗點的主要調(diào)節(jié)作用，從它使Bubr1磷酸化，激活其激酶活性，并使其直接定位到未連接的著絲點。之后BubR1作為補充和激活其他檢驗點的催化劑。直到所有著絲點都正確的連接到對應的檢驗點并且激活APC。在接近有絲分裂終點時，Aurora-B集中在紡錘體中心，作為卵裂溝的一個組分，細胞質(zhì)分裂的決定性條件。雖然在分子水平上，Aurora-B對于細胞質(zhì)分裂和卵裂溝中的功能的并不清楚，但眾所周知Aurora-B可以使蛋白質(zhì)磷酸化是一個重要工序。這些基質(zhì)包括了動力蛋白MKPL上的激酶和肌間線蛋白和波形蛋白中間體。與在細胞質(zhì)分裂中重要角色一致的，細胞中Aurora-B活性喪失而過早的退出有絲分裂，將導致細胞中含有多倍體細胞核，也包括多次復制的DNA。一些所謂的研究誣陷了Aurora-B在細胞分裂中的影響。假設Aurora-B在有絲分裂中為數(shù)眾多的特性，這個成果將成為幫助預測其對小分子Aurora-B抑制劑全部影響的手段。這些實驗經(jīng)常依賴于激酶死蛋白的表達，所有蛋白中siRNA的消耗，或者中和抗體的顯微注射。最常見的是著絲點微管的相互作用的破壞，使染色體失調(diào)，導致細胞出現(xiàn)多核或者多倍體。這可以歸因于廢除的有絲分裂紡錘體檢驗點，未能改正不適當?shù)闹z點微管附著物，以及未能完成細胞質(zhì)分裂。紡錘體檢驗點的覆蓋已經(jīng)證實了實驗中Aurora-B的消耗或者中和抗體的抑制是能夠繞開有絲分裂的過程，包括微管靶向藥物噻氨酯噠唑（Nocodazole）及紫杉醇類藥物的誘導。雖然這些研究清楚的表明，Aurora-B活性消耗導致重大缺陷，如有絲分裂和多倍體細胞的產(chǎn)生，但這種不正常的細胞命運命運普遍的評估。Aurora-C:Aurora-C是Aurora激酶中研究最少的，而且其在有絲分裂中的具體作用并沒有明確的定義。Aurora-C在較低水平的大多數(shù)體細胞組織中的表現(xiàn)，明顯不及Aurora-A或者Aurora-B。Aurora-C在睪丸組織中的高度表達是唯一的例外。與此表達譜相一致的，通過純合子與雜合子對比小鼠實驗確定了其在細胞核減數(shù)分裂中的關鍵作用。這些小鼠表現(xiàn)出一個很正常的生理機能，但由有缺陷精子導致的低生育力。這些與畸變?nèi)旧w凝結和多倍性有關。Aurora-C的定位有高度不定性。在有絲分裂前期，它的位置在著絲點裝配到中間區(qū)以前，最后發(fā)現(xiàn)在卵裂溝周圍。這與Aurora-C作為一個染色體乘客復合體蛋白一致。為了與此相符，Aurora-C與Aurora-B一起通過有絲分裂并且與其他CPC組分INCENP、survivn和borealin相互作用。Aurora-C突變形式的超表達導致了高頻率的出現(xiàn)擁有多個細胞核的多倍體細胞。此外，激酶死Aurora-C的表達導致廣泛的細胞機制凋亡。這些發(fā)現(xiàn)讓我們回想到Aurora-B耗損研究。有趣的是，野生型Aurora-C的超表達可以挽救Aurora-B消耗而出現(xiàn)的多核表現(xiàn)型。綜上所述，這些數(shù)據(jù)顯示了與Aurora-B的重疊作用，以及可能顯示了兩種蛋白之間的冗余度。Aurora激酶與癌細胞從20世紀90年代發(fā)現(xiàn)以來，豐富的科學與臨床數(shù)據(jù)已然顯示了Aurora激酶與人類癌癥進展之間的強烈聯(lián)系。Aurora-A有20q13基因組領域即與人類癌癥有緊密聯(lián)系的基因圖譜。在許多癌細胞中葉觀察到超表達的Aurora-A蛋白。Aurora-A在體外的異位超表達導致細胞顯示諸如中心體擴增、非整倍體、染色體不穩(wěn)定、端粒延長等多種癌細胞特征。觀察發(fā)現(xiàn)，Aurora-A自身表達，或者激活搭檔TPX-2,與人類癌細胞染色體不穩(wěn)定有關。此外，Aurora-A與腫瘤抑制的決定性主因有關并對此產(chǎn)生負面調(diào)節(jié)?；蛟S其中最引人注目的一點是p53由于Aurora-A促進mdm2-mediated而退化并抑制其轉(zhuǎn)錄活性。無論如何，Aurora-A并不堅持細胞在體外的轉(zhuǎn)化和超表達位置不在通常的活躍腫瘤細胞中，因此不是一個常規(guī)的蛋白質(zhì)。綜合來看，這些觀察表明Aurora-A通常要求其他無規(guī)則的致癌基因被轉(zhuǎn)化。這個的潛在影響是，Aurora-A的選擇性抑制作用可能只對特定的癌細胞顯示抗癌活性或者在與其他藥物結合時才能達到最好的使用效果。前述的耗損研究中去除Aurora-A經(jīng)常導致有絲分裂重大缺陷，似乎與此形成了鮮明的對比。出現(xiàn)這種差異的原因可能是由于這些研究使用的癌細胞株數(shù)量相對較少。很可能Aurora-A抑制劑的真正影響只被顯露一次而選擇性抑制性則已被廣泛的應用到癌細胞中。與假設相一致的，Aurora-A抑制與其他療法相結合可能的好處已經(jīng)有某些團隊作出了說明，Aurora-A有消耗對于敏感癌細胞由于化療藥物如紫杉烷類、順鉑和電離輻射等產(chǎn)生的細胞毒素的作用。Aurora-B在17p13.1基因組區(qū)域的基因圖譜在某些人類癌癥區(qū)域有變化。Aurora-B的mRNA和蛋白質(zhì)本身在癌癥和在蛋白質(zhì)表達與一些有報道類型的嚴重疾病腫瘤上頻繁超表達。Aurora-B與癌癥之間除了這些直接聯(lián)系外，更需要注意CPC蛋白質(zhì)，其與Aurora-B合作表現(xiàn)，或由Aurora-B調(diào)節(jié)，也常被過度表達或者被夸張為癌癥。盡管癌癥的關鍵與Aurora-B在細胞分裂過程中的聯(lián)系并不十分緊密，它不在體外轉(zhuǎn)錄且并不會普遍在體內(nèi)形成腫瘤。一個重要的例外是在Aurora-B已經(jīng)在p53細胞突變形式上超表達腫瘤發(fā)生的行為.。從這些實驗結果表明，雖然Aurora-B本身并不是癌基因，但它可以充當其他致癌基因

突變形成腫瘤的合作伙伴。與此一致的概念是，Aurora-B可增強Ras-mediated的轉(zhuǎn)化，但Aurora-B與短束RNA的耗損可以抑制Ras的轉(zhuǎn)變。對于Aurora-B作為一個重要的抗癌物質(zhì)的目標還需要進一步研究，包括Aurora-B耗損對于敏感癌細胞的療法，例如烷化劑和電離輻射的細胞毒作用。最近的數(shù)據(jù)表明，在許多有絲分裂過程中，Aurora-B與Aurora-C的作用重疊。雖然Aurora-C在人類癌細胞株數(shù)量上觀察，但Aurora-C在腫瘤的發(fā)生具有明顯作用的說法尚未確定。Aurora激酶小分子抑制劑作為化學探針Aurora激酶活性的消耗使用諸如siRNA和激酶失活蛋白的表達技巧，有助于預測Aurora抑制劑的生物輪廓。然而，這些技術不容易區(qū)分抑制蛋白酶的催化活性和功能，任何結構的蛋白質(zhì)都有可能。為此，選擇性小分子抑制劑是必需的。Aurora-A與Aurora-B的雙重抑制劑。在2003年，第一個Aurora小分子抑制劑被披露（ZM4474391與橘皮苷2；見圖3）。復合物1能夠比其他不相關激酶（不包括與之密切相關的Aurora-C）更有效的抑制Aurora-A和Aurora-B（IC50分別在110nm和130nm處）。這一選擇度是對其廣泛應用于化學探針的大力支持。復合物2據(jù)稱是一種對Aurora-B（IC50在250nm處）的抑制劑，擁有對抗其他六種激酶（沒有資料顯示這其中包括Aurora-A或者Aurora-C）的重要交叉反應。兩中抑制劑都在多倍體細胞上顯示了相似的全顯性：抑制組蛋白H3磷酸化（Ser10）和缺乏細胞分裂的核內(nèi)復制。在某些多達N-NH1(ZM447439)2(Hesperadin)1(ZM447439)2(Hesperadin)3(MK-04.57,VX-6R0)44(MLN8054)5(AZD1152)

圖332次DNA復制的巨細胞案例中可以觀察到。某實驗顯示了一個細胞G1被阻塞在復合物1中而未能完成細胞質(zhì)分裂。在這種條件下，進入和退出有絲分裂正常進行，但細胞無法分裂。這兩種酶抑制劑引起明顯的染色體失調(diào)，常與染色體并列連接在非兩性著絲點微管的主軸上。盡管有這些畸變，兩個姊妹染色單體的分離依然存在。二者合一，這些活動都有力的表明，抑制Aurora激酶活性會導致紡錘體檢驗點的廢除和染色體附著物在適當情況下退出有絲分裂。這兩中復合物由紫杉烷類微管穩(wěn)定劑引發(fā)的覆蓋有絲分裂阻滯的表現(xiàn)證實了這一點。更詳細的分析表明，許多紡錘體檢驗點的組分包括BurR1、Mad2和CENP-

E都是不固定的。毫不奇怪的，由缺陷型有絲分裂觀察發(fā)現(xiàn)，由復合物1處理的細胞生存能力下降。在2004年首次披露了復合物3對體內(nèi)潛在Aurora激酶抑制劑的表征。（MK-0457（VX-680），見圖3）。復合物3是一種對所有三種Aurora激酶有效的強有力的抑制劑，同時對其他激酶具有選擇性。和Aurora-A與Aurora-B雙重抑制劑相一致（復合物1和2），復合物3迅速的誘導多倍性并阻滯增生。最值得注意的是，由Aurora介導的無規(guī)則有絲分裂足以導致細胞凋亡。這個案例是經(jīng)復合物3處理的整個細胞周期包括癌細胞系、非癌細胞系和原發(fā)性腫瘤細胞采樣。與此細胞周期的細胞死亡機制對應的是觀察發(fā)現(xiàn)在非周期內(nèi)的細胞沒有喪失生存能力。在人類癌癥嚙齒動物模型中復合物3非常有效的阻塞腫瘤生長甚至引起某些腫塊復原。復合物3的免疫組織化學分析顯示出明顯的抑制腫瘤治療組蛋白H3磷酸化，與Aurora-B抑制相一致，可顯著減少細胞凋亡。有效劑量的復合物3耐受性良好，但觀察發(fā)現(xiàn)嗜中性粒細胞數(shù)量顯著可逆減少（＞50%降低到最低點）。臨床觀察發(fā)現(xiàn)，在非癌癥細胞循環(huán)機制與形式的基礎上，Aurora激酶對一般中性粒細胞有抑制作用。復合物3可以引起可以誘導形成單極紡錘體，一種表現(xiàn)型為隨著Aurora-A消耗及沒有報導的Aurora-A與Aurora-B雙重抑制劑復合物1的替代物。因此，復合物3能抑制除Aurora-B基質(zhì)組蛋白H3之外的特定Aurora-A基質(zhì)磷酸化。因此，復合物3在有絲分裂和細胞生存能力方面可以同時抑制Aurora-A和Aurora-B。雖然它Aurora激酶抑制劑會導致有絲分裂異常和阻滯周期內(nèi)細胞增殖已被廣泛的報導，但不少研究組織現(xiàn)在證明細胞的最終宿命似乎是與基因背景有關。在復合物1或者3處理的細胞中，缺乏p53基因功能的細胞經(jīng)過繁殖與大量核內(nèi)復制后缺少細胞因子，緊接著細胞衰亡。另一方面，p53功能全面的細胞則較少進行核內(nèi)復制。這一結果表明了p53在G1四倍體檢驗點的作用。這將使人們對此情況能否通過臨床觀察有興趣。該機制的出現(xiàn)將導致腫瘤化療抵抗現(xiàn)象經(jīng)常出現(xiàn)。在許多情況下，阻力與藥泵的表達有關，但在藥物靶向本身的突變中葉可以觀察到。已經(jīng)觀察到少量的人類Aurora基因的多形性，盡管這些對激酶活性或者對藥物敏感性的影響并非典型。最近的一項研究表明，在復合物1的長期存在下培養(yǎng)的癌細胞可以產(chǎn)生對此復合物由抵抗作用的無性繁殖。詳細的分析表明，這種抗性是由于一定數(shù)目的Aurora-B蛋白產(chǎn)生突變。這些突變Aurora-B蛋白的表達在細胞上的影響超過了復合物1在組蛋白H3磷酸化、細胞周期和紡錘體檢驗點。這非常清楚的表明復合物1對抗有絲分裂的影響與抑制Aurora-B有關而非Aurora-A。這些Aurora-B的突變也阻滯了復合物3在細胞周期和菌落的形成。再一次說明了復合物3的抗癌特性是與Aurora-B的抑制有關而不是Aurora-A或Aurora-C。這與Aurora-A的消耗影響抗有絲分裂相比有些出人意料。這表明在本試驗中，用復合物1和3不能完全的抑制Aurora-A，或者說抑制Aurora-A的催化活性，只對其自身有微弱的影響。將這些觀察的數(shù)據(jù)結果予以統(tǒng)計發(fā)現(xiàn)，Aurora-A通常不會轉(zhuǎn)化或者腫瘤化，結論是當Aurora-A與其他癌癥療法結合時可能產(chǎn)生最好的療效。當然更重要的是，這項研究使Aurora激酶抑制劑潛在的臨床阻力更為突出。這將使Aurora激酶抑制劑通過臨床受到更為嚴酷的監(jiān)測。除了個別藥物對Aurora激酶雙重抑制劑的影響，一些團體以及表明，這些復合物能夠使細胞對其他治療方法更為敏銳。當與Aurora-A/B雙重抑制劑聯(lián)合評估時，地塞米松、鏈霉素、依托泊苷、長春新堿、道諾霉素和電離輻射的作用都有所增強。其中某些組合效應可以歸因為Aurora激酶對關鍵有絲分裂過程的抑制，其他情況下所觀察到的協(xié)同作用的機理尚不明確。不過，這些臨床觀察有可能對臨床研究的設計有很大的作用。AuroraA的選擇性抑制劑。第一個對Aurora-A有選擇性的Aurora激酶抑制劑，復合物4（MLN8054，圖3），近期已經(jīng)投入臨床實驗。這種復合物在酶化驗（IC50分別為4nm和172nm）中對Aurora-A的選擇性超過對Aurora-B的40倍，并且在細胞（IC50在34nm處抑制Aurora-A自體磷酸化及IC50在4pm處抑制組蛋白H3磷酸化）中顯示對Aurora-A的選擇性明顯超過Aurora-B。在生化分析中，這種復合物在226種其他激酶中只顯示了對Aurora-A的選擇性（只有七種激酶在1pm處顯現(xiàn)出〉50%的抑制作用）。沒有數(shù)據(jù)顯示復合物4與Aurora-C有交叉反應。復合物4在低濃度多細胞系中抑制Aurora-A但最低限度抑制Aurora-B導致了對細胞增殖的穩(wěn)定性抑制作用（IC50值通常在低于1pm處）。詳細的分析顯示，由4NDNA標記的染色體積聚物，嚴重缺陷型染色體在中期位置線性增多。這些表型似乎與Aurora-B的消耗研究更一致。與Aurora-A預言的作用一致的，復合物4處理的細胞在尋常觀察中出現(xiàn)高頻率的單極或者多極異常紡錘體。此外，與Aurora-A在中心小體成熟分離中的功能一致，細胞中只有一個中心小體的現(xiàn)象經(jīng)常發(fā)生。有趣的是，盡管有中心小體分離缺陷，依然能發(fā)現(xiàn)多極紡錘體細胞，雖然其中一極會缺少一個中心小體。并不奇怪的是，對于所有偏差，有絲分裂的進行都被推遲。經(jīng)過復合物處理細胞從分裂前期到末期的平均耗時從67分鐘延長到131分鐘。這一特性與Aurora-A的生物消耗相一致。復合物4使在小鼠異種移植物模型中單一藥物抑制腫瘤長大成為可能。在能夠抑制腫瘤長大劑量的復合物4生物標記研究中，顯示了在持續(xù)抑制Aurora-A但短暫抑制Aurora-B的早期，復合物曝光度最高。這種Aurora-B抑制可能成為復合物4的抗癌抗菌素活性因素。Aurora-B的交叉反應性對復合物4的抗癌性影響在Aurora-B細胞表達突變異種被證實對Aurora-A/B的雙重抑制劑復合物1和3有抵抗力。在體外，復合物4的濃度被預言能夠完全抑制Aurora-A和部分抑制Aurora-B（5pm），含有4NDNA積聚物和G1缺失的細胞完全被阻滯在Aurora-B細胞突變異種形式表達。然而，這種阻滯菌落形成的能力不受影響。這暗示了Aurora-B的交叉反應性對復合物4在細胞上想某些影響有責任，但細胞毒性與抑制Aurora-B不相關；這相當可能與Aurora-A有關或是一種不切題的活性。盡管許多復合物4處理后的顯性觀察結果與Aurora-A的預期能力相一致，正確的選擇Aurora-A抑制劑的精確影響依舊被報導。AuroraB的選擇性抑制劑。復合物5（AZD1152，圖3）是第一張進入臨床試驗的Aurora-B選擇性抑制劑。這種復合物是一個在血漿中迅速轉(zhuǎn)換為活性劑AZD1152-HQPA（復合物7）的二氫磷酸鹽前藥。經(jīng)20余種其他激酶試驗（IC50>1nm對19/20激酶遮蔽；IC50在170nm處Lck被抑制）發(fā)現(xiàn)，這一活性劑是對Aurora-B強有效的抑制劑（Ki<1nm），適度抑制Aurora-C（Ki在17nm處），及微弱抑制Aurora-A（Ki在1.4nm處）。復合物7的生物特性與Aurora-A/B雙重抑制劑如復合物3相似。這可能使Aurora-A/B雙重抑制劑對抗有絲分裂的影響在Aurora-B在細胞抗藥型突變異種中的表達被阻滯變得并不令人驚訝。復合物7在細胞中誘導產(chǎn)生廣泛的多倍性和細胞凋亡，并阻滯組蛋白H3在Ser10的磷酸化。值得注意的是，經(jīng)復合物7處理的細胞不影響有絲分裂動力學，因為細胞能夠按比得上控制的比率進入或者退出有絲分裂。近似物ZM2（復合物6）（圖3）的長期研究，顯示出這種對有絲分裂的破壞與不正確的微管著絲點附著物（復合物6與復合物7的選擇性相似，生化分析中，IC50值在7.5nm處防御Aurora-B且在800nm處防御Aurora-A）有關。染色體不能排列在赤道板上，反而經(jīng)常平行排列在紡錘體上。觀察發(fā)現(xiàn)這些藥物退出有絲分裂是因為需要一個過載的紡錘體檢驗點而缺乏正確的染色體附著物。這個過載的紡錘體檢驗點隨著Aurora-B的抑制被證實與復合物6有關，因為它制止紫杉醇處理細胞誘導有絲分裂。復合物6和7的數(shù)據(jù)與Aurora-B喪失活性利用技術比如siRNA和證實Aurora-B的催化抑制導致不適當?shù)挠薪z分裂及體外磷酸化的生物研究完全一致。前藥復合物5顯著的抑制體內(nèi)腫瘤生長并在部分特殊案例中使腫瘤復原。組蛋白H3磷酸化的減少，4N在細胞中增多，或者DNA含量更高，并與大量復核細胞的增長和細胞凋亡的增多一起，在經(jīng)復合物處理的動物腫瘤組織中被觀察發(fā)現(xiàn)。在骨髓細胞中也觀察到一個短暫卻明顯的下降，盡管已經(jīng)在5天內(nèi)維持同一劑量的復合物。深度研究顯示了嗜中性粒細胞最大程度的影響細胞數(shù)量而引起的短暫的骨髓抑制。這非腫瘤細胞的影響可與Aurora-A/B的雙重抑制劑相媲美。許多研究使用了活性劑或前藥（分別為復合物7或5）去探測對敏感癌細胞和化療藥物與電離輻射對腫瘤有效的潛在的Aurora-B抑制劑。復合物7在體外和長春新堿（一種使微管蛋白解聚的藥物）的細胞毒素活性以及道諾霉素（一種局部異構酶II抑制劑）協(xié)同提高抗增殖能力。有活性的復合物5在具有白血病單沒有增加其毒性的小鼠異種移植物模型中隊兩種藥物具有潛在影響力。另外，用復合物7預處理，優(yōu)先致電離輻射，導致了細胞死亡明顯增多以及抑制細胞體外生長。這在p53有缺陷的細胞中最為明顯。Aurora-C的選擇性抑制劑。沒有關于對Aurora-C選擇性抑制劑的報導。催化作用機制和蛋白質(zhì)構象在Aurora激酶抑制劑設計中的考慮在藥物發(fā)現(xiàn)的努力成果中，最大的挑戰(zhàn)之一是個別蛋白激酶實現(xiàn)適當?shù)倪x擇性。這一成就是因為將共同戰(zhàn)略用于設計位點。大多數(shù)復合物與ATP基質(zhì)競爭并將高度同源的多達500種甚至更多的蛋白激酶家族捆綁在一起。鑒于這一挑戰(zhàn)，在談及具體配合基的合理設計時，詳細的了解ATP靶向結合位點的結構構造成為重要的優(yōu)勢?，F(xiàn)在普遍認為許多蛋白激酶存在兩種不同的構象：“封閉”，通常對應于一種無效的形式；以及“開放”，與前者相應的活性形式。活化的蛋白激酶催化作用通常涉及的關鍵殘基的活性部位，與正確組織位置的蛋白質(zhì)，一起固定

到底物結合區(qū)。在多數(shù)情況下，該回路的關鍵殘基磷酸化是足夠驅(qū)動這些構象變化的。然而，在某些情況下，與其他激活因子共同作用是必要的。也行這個是最佳例子就是研究由細胞周期蛋白家族的蛋白質(zhì)激活CDKs。一系列生化與結構的研究表明，Aurora-A與Aurora-B需要與激活回路上綁定的蛋白質(zhì)磷酸化。這其中，Aurora-A需要的是TPX-2,Aurora-B則需要INCENPoThr288在激活回路上的自體磷酸化與TPX-2綁定需要完全激活Aurora-A。Aurora-A的晶體結構是否綁定在TPX-2上的問題現(xiàn)在已經(jīng)解決了，并幫助解釋aC-helixdisordered(smaltATPpacket)(fullyformedATPpocket}&AshiftofT288/257了完全激活的分子機制。當Aurora-A綁定在TPX-2上時，其構造與許多已知的活性激酶構造十分相似；所有重要的催化殘余物與催化作用相對應（Lys162對應于磷酸鹽轉(zhuǎn)移，Asp271對應于將Mg2+離子整合到催化基質(zhì)Asp256），激活回路被固定于一個提供捆綁ATP的開放式平臺的延長構象。此外，在激活回路中磷酸化的蘇氨酸被埋葬而非被溶劑暴露。這種行為通過負控調(diào)節(jié)阻滯磷酸酶PP1的脫磷酸化。在TPX-2的情況下，分離晶體結構出現(xiàn)了很多干擾，尤其在激活回路區(qū)域。盡管如此，激活回路與ATP綁定的重疊部分可以被清楚的看到。其結果是一個小口袋與入丁？的結合不一致。另外，當Aurora-A結構沒有結合到TPX-2并接觸到大量溶劑時比較，殘余的Pi-Thr288將經(jīng)歷與8A的置換。圖4是Aurora-AaC-helixdisordered(smaltATPpacket)(fullyformedATPpocket}&AshiftofT288/257Activationoopfoldedhac<overtheATPsocket圖4一個將Aurora-A綁定到pan-Aurora抑制劑，復合物3，復雜晶體結構被公開發(fā)表。這一結構采用了蛋白質(zhì)封閉不激活的狀態(tài)，詳細的觀察表明這一形式與其他已經(jīng)公開的激酶結構很不相同。比如，一個疏水的小口袋在ATP綁定苯丙氨酸殘余物的鄰近區(qū)域內(nèi)是很明顯的，最近似結構的相同性質(zhì)是能夠形成封閉的構象中形成類似于Flt-3和Abl激酶的疏水小口袋。假設這個不活動形式的Aurora-A特殊結構類型和附加的疏水小口袋的存在，一種有吸引力的戰(zhàn)略是針對這種引進選擇性酶的形式。Aurora-B的完全激活需要兩個工序：Thr288在激活回路上的自體磷酸化（相同于Thr288在Aurora-A）及綁定到CPC蛋白質(zhì)INCENP。生化研究已經(jīng)顯示了INCENP綁定將Aurora-B活性提高了10倍。有趣的是，在該過程中INCENP本身在多種位置被Aurora-B磷酸化。這反過來也令Aurora-B得到了充分激活。一種Aurora-B的激活模式已被計劃加入Aurora-B與INCENP的絡合物；然后繼INCENP被Aurora-B磷酸化之后，Aurora-B發(fā)生自體磷酸化。接下來，這些會導致Aurora-B結構的改變以及激酶完全激活。根據(jù)這一機制，Aurora-B綁定到一個INCENP被截形式的晶體結構，缺乏關鍵殘基磷酸化，Aurora-B只部分處于激活形態(tài)。當這個復合物與完全激活狀態(tài)的Aurora-A/TPX-2復合物相比較，兩個關鍵的區(qū)別是顯而易見的。首先，活性部位的磷酸鹽殘基整合到在ATP上并不在最佳磷酸鹽轉(zhuǎn)移位置，其次催化的裂縫接受比Aurora-A結構多一個的開放結構，也不在綁定到ATP的最佳位置。雖然完全激活Aurora-B的結構還沒有得到解決，綁定磷酸化的INCENP計劃將反映在一個封閉的催化裂縫，于關鍵催化部位聯(lián)結，并產(chǎn)生一個完全積極開放的Aurora-B構型。一旦缺乏Aurora-B構型的綜合描述，就不可能由機會全面得表示出為了獲得靶向選擇性的獨有構造的典型。然而，假設復合物3能同時有效的抑制Aurora-A和Aurora-B，隨著其他激酶被一個封閉的形式接受，Aurora-B就很可能與Aurora-A類似的去接受一個不活動構型。沒有關于Aurora-C結構的報導。綜上所述，Aurora-A和Aurora-B的構象研究都突出了多種機會和設計擁有良好效用與選擇性的抑制劑的戰(zhàn)略。不活動Aurora-A這種不尋常的結構構象，包括將疏水小口袋綁定到ATP位置，令這種形式的酶擁有非常有吸引力的靶向，性，尤其是獲得的選擇性高于其他激酶。此外，大量的蛋白質(zhì)重排也顯示了高度的靈活性。這似乎是特別為了讓激活回路與ATP綁定到小口袋中。Aurora激酶的這種屬性可能很有用，如果抑制劑可以被設計成在由蛋白質(zhì)引起構象變化（包括積極與消極兩種構象）的這些區(qū)域相互作用的話。舉個例子，配合基可能由刺激疏水在復合物周圍瓦解而使一個特殊蛋白質(zhì)構型固定。另外就是抑制劑可以推動蛋白質(zhì)而導致地域構象變化，不可能容忍沒有相似靈活度的激酶。Aurora激酶抑制劑的發(fā)現(xiàn)與發(fā)展自從發(fā)現(xiàn)了Aurora激酶和他們與癌癥的聯(lián)系，經(jīng)過不懈的努力，終于確定了選擇性抑制劑作為潛在藥物的研究方向。迄今為止，已有10余種小分子進入了臨床研究，所有這些回顧如下。Vertex與Merck為獲得Pan-Aurora抑制劑 復合物3。在Vertex與Merck之間合作中，對Aurora激酶抑制劑研究可能是最廣泛的，且對階段II倍數(shù)試驗作出了評價。這一復合物是基于一種氨基毗唑綁定為主題從而用一個2-苯基代替?？蜻I導來完善Aurora-A（復合物15）。用4-氨基苯基代替苯基組（復合物16）的主題提供了一個在潛能超過Aurora-A的顯著的改善，尤其在選擇性方面（由交叉反應性超過Src和Gsk30激酶斷定）。這種極好的選擇性為實現(xiàn)Aurora-A超越Src和Gsk38似乎是由于在Aurora-A上的乙酰胺到疏