植物轉基因技術原理及要點

關于植物轉基因技術原理及要點第1頁，課件共27頁，創(chuàng)作于2023年2月第2頁，課件共27頁，創(chuàng)作于2023年2月1.技術路線目的基因分離植物表達載體的構建受體材料的準備遺傳轉化轉化組織組織脫分化轉化植株篩選煉苗第3頁，課件共27頁，創(chuàng)作于2023年2月1.目的基因的分離（1）已知基因的獲得①化學合成法②PCR擴增（2）未知基因的獲得①構建基因組文庫，篩選目的基因②構建cDNA文庫，篩選目的基因③mRNA差異顯示技術篩選差異表達基因④差異蛋白質譜表達技術篩選功能基因……第4頁，課件共27頁，創(chuàng)作于2023年2月①②pGEM-T③④⑤⑥⑥⑦⑧①銀杏葉RNA提?、诜崔D錄cDNA③chs全長cDNA的克?、躎A克隆及測序⑤向chs兩端引入酶切位點⑥雙酶切⑦定向克隆⑧導入農桿菌

2.植物表達載體的構建第5頁，課件共27頁，創(chuàng)作于2023年2月例pBI121-chs構建pBI121圖譜第6頁，課件共27頁，創(chuàng)作于2023年2月銀杏chs基因植物表達載體構建示意圖chs

β-glucuronidose

NOSter

CaMV35Pchs第7頁，課件共27頁，創(chuàng)作于2023年2月3.受體材料的準備細胞的全能性：分化細胞脫分化再分化第8頁，課件共27頁，創(chuàng)作于2023年2月4.遺傳轉化（1）間接轉化法——農桿菌介導轉化法

（2）直接轉化法

A、基因槍轉化法

B、電擊法

C、花粉管通道法

D、PEG介導基因轉化法第9頁，課件共27頁，創(chuàng)作于2023年2月根癌農桿菌

(Agrobacteriumtumefaciens),是一種革蘭氏陰性土壤桿菌,它含有Ti質粒,能誘導被侵染的植物細胞形成腫瘤,即誘發(fā)冠癭瘤.Ti質粒(包括Ri質粒)上有一段轉移DNA,在農桿菌侵染宿主植物時,這段DNA可以轉移進植物細胞,并穩(wěn)定地保留在植物細胞染色體中,變?yōu)橹参锛毎略黾拥囊蝗夯?最終能通過有性世代遺傳給子代。返回第10頁，課件共27頁，創(chuàng)作于2023年2月基因槍轉化法由美國Cornell大學的Sanfor(1987)提出,它的主要原理是將包含目的基因的載體包被在微小的金屬微粒(鎢粒或金粒)表面,通過高壓驅動力加速微粒穿透植物細胞壁,導入受體組織細胞內,然后通過組織培養(yǎng)再生出完整的植株.微粒上的外源DNA進入細胞后,整合到染色體上并得到表達,從而實現基因的轉化.。返回第11頁，課件共27頁，創(chuàng)作于2023年2月電擊法的主要原理是將原生質體在溶液中與DNA混合,然后利用高壓電脈沖作用,使原生質體膜的某些部位被擊穿而產生可回復的小孔,外源DNA可通過小孔進入原生質體內,而且不影響經電擊處理的原生質體再生植物的能力.返回第12頁，課件共27頁，創(chuàng)作于2023年2月花粉管通道法是利用開花植物授粉后形成的花粉管通道,直接將外源目的基因導入尚不具備正常細胞壁的卵、合子或早期胚胎細胞,實現目的基因轉化.返回第13頁，課件共27頁，創(chuàng)作于2023年2月PEG介導基因轉化的主要原理是聚乙二醇(PEG)、多聚-L-鳥核苷酸(pLO)、磷酸鈣及高pH值條件下誘導原生質體攝取外源DNA分子.PEG可促使細胞膜與DNA間接觸與粘連,并通過引起膜表面電荷的紊亂及干擾細胞間的識別,利于細胞膜間的融合以及外源DNA進入原生質體.返回第14頁，課件共27頁，創(chuàng)作于2023年2月表1幾種植物轉基因方法比較

轉基因方法轉化的優(yōu)點轉化的缺點DNA間接轉化法農桿菌介導基因轉移受體種類，可以在原生質體、蛋細胞和細胞團、組織器官或整株等多級水平上進行，方法成熟可靠，簡便易行，周期短，轉化率高；轉化雙子葉植物為主。大多數單子葉植物和裸子植物對農桿菌的侵入不敏感，限制了該法在禾谷類作物中的應用。轉化體常出現“嵌合”現象，需在嚴格條件下加以選擇以淘汰未轉化細胞DNA直接轉化法（1）基因槍轉化法（2）電擊法（3）PEG介導基因轉化法（4）花粉管通道法無宿主限制，適用于各種單、雙子葉植物，操作簡單轉化效率低，需要專門設備（電擊儀、顯微操作儀或基因槍），多數需要原生質體與愈傷組織，周期太長（電擊法）第15頁，課件共27頁，創(chuàng)作于2023年2月5.轉化組織——農桿菌介導之葉盤轉化法帶有轉化基因的農桿菌活化受體植物葉盤侵染共培養(yǎng)篩選培養(yǎng)誘導成苗預培養(yǎng)葉盤，或愈傷組織第16頁，課件共27頁，創(chuàng)作于2023年2月第17頁，課件共27頁，創(chuàng)作于2023年2月第18頁，課件共27頁，創(chuàng)作于2023年2月遺傳轉化主要的影響因素：1.預培養(yǎng)時間：一般0~3天，過長不利于侵染2.農桿菌濃度：用MS（pH=7.0）鹽溶液調OD值（一般在0.2~1.0）3.侵染時間：時間應適中，太短轉化率低；太高則后期農桿菌難以除凈，毒害材料。4.共培養(yǎng)時間5.乙酰丁香酮（AS）處理：處理方式及濃度

(A)僅共培養(yǎng)基中加AS(B)僅菌液中加AS(C)菌液和共培養(yǎng)基中均加ASAS使用濃度：50μM~200μM實驗結論：A與C效果最好且差異不明顯第19頁，課件共27頁，創(chuàng)作于2023年2月6.煉苗第20頁，課件共27頁，創(chuàng)作于2023年2月7.轉基因苗的篩選與鑒定培養(yǎng)過程中利用標記基因篩選標記基因選擇標記基因(Slectivegene)報告基因(Reportgene)抗生素類選擇基因抗除草劑類選擇基因生物安全性標記類選擇基因……β-D-葡萄糖酸苷酶基因(Gus)熒光素酶基因(Luc)氯霉素乙酰轉移酶基因(Cat)綠色熒光蛋白基因(Gfp)……第21頁，課件共27頁，創(chuàng)作于2023年2月例Gus檢測原理：β－Ｄ－葡萄糖酸苷酶基因（Gus），催化β－葡萄糖苷酯類物質水解。其中很多水解產物具有發(fā)色團或形成熒光物質。例：組織化學法測定Gus活性作用底物為X-gluc,產物是一種不可溶的5,5-二溴，4,4-二氯靛藍；第22頁，課件共27頁，創(chuàng)作于2023年2月轉基因植物的PCR檢測外源基因整合的PCR-Southern雜交檢測外源基因拷貝的IPCR檢測外源基因表達的RT-PCR第23頁，課件共27頁，創(chuàng)作于2023年2月雜交鑒定

外源基因整合的Southern雜交鑒定外源基因轉錄的Northern雜交