上海市臨檢中心 PCR技術(shù)人員上崗培訓(xùn)班課件 核酸的化學(xué)-PCR-倪培華

核酸的生物化學(xué)與PCR上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)系倪培華第一部分

核酸化學(xué)Biochemistry

ofNucleic

Acid20世紀(jì)40年代明確了遺傳的物質(zhì)基礎(chǔ)是DNA:肺炎球菌20世紀(jì)50年代揭示了DNA分子的雙螺旋結(jié)構(gòu)模型和半保留復(fù)制半保留復(fù)制20世紀(jì)50年代末和60年代提出了“中心法則”和操縱子學(xué)說(shuō)，并成功地破譯了遺傳密碼遺傳密碼

64個(gè)密碼子61個(gè)代表各種氨基酸（AUG起始密碼）3個(gè)密碼子為終止子

（UAA、UAG、UGA）操縱子用基因表達(dá)調(diào)控的原理解釋了酶誘導(dǎo)的本質(zhì)第一節(jié)

核酸化學(xué)概述核酸（nucleicacid)核糖核酸ribonucleicacid，RNA脫氧核糖核酸deoxyribonucleic

acid，DNAmessengerribonucleicacidmRNAtransferribonucleicacidtRNAribosomeribonucleicacidrRNADNARNA腺嘌呤（A）鳥嘌呤（G）胞嘧啶（C）腺嘌呤（A）鳥嘌呤（G）胞嘧啶（C）胸腺嘧啶（T）

尿嘧啶（U）核苷中的戊糖5’碳原子上羥基被磷酸酯化第二節(jié)

核酸的分子結(jié)構(gòu)核酸的一級(jí)結(jié)構(gòu)多核苷酸鏈中核苷酸的排列順序（堿基）DNA分子結(jié)構(gòu)一級(jí)結(jié)構(gòu)二級(jí)結(jié)構(gòu)四級(jí)結(jié)構(gòu)三級(jí)結(jié)構(gòu)同種生物不同組織器官細(xì)胞中DNA分子的核苷酸排列順序相同

(無(wú)組織器官特異性)不同種生物DNA分子中的核苷酸排列順序不同(有種族特異性)任何生物DNA堿基組成都符合某一特定生物，其DNA堿基組成恒定A=T，

G=C，

A+G=T+CChargff

LawWatson-Crick

雙螺旋結(jié)構(gòu)學(xué)說(shuō)（double

helix）1.堿基對(duì)間:氫鍵2.堿基的堆積力:范氏引力、疏水鍵structure3.正負(fù)電荷作用DNA二級(jí)結(jié)構(gòu)三級(jí)結(jié)構(gòu)DNA鏈進(jìn)一步扭曲盤旋形成超螺旋結(jié)構(gòu)四級(jí)結(jié)構(gòu)一條DNA的長(zhǎng)鏈經(jīng)過(guò)一級(jí)結(jié)構(gòu)即形成核小體后,其長(zhǎng)度被壓縮了7倍?

二級(jí)結(jié)構(gòu),即形成螺旋管后,DNA長(zhǎng)度又被壓縮了6倍?

三級(jí)結(jié)構(gòu),即由螺線管形成超螺線管后,DNA的長(zhǎng)度在二級(jí)結(jié)構(gòu)的基礎(chǔ)上被壓縮了40倍?

在由三級(jí)到四級(jí)結(jié)構(gòu),即形成染色單體后,DNA的長(zhǎng)度在三級(jí)結(jié)構(gòu)的基礎(chǔ)上被壓縮了5倍Types

of

RNAncRNANon-coding

RNA.

TranscribedRNA

with

astructural,mRNAfunctional

orcatalytic

rolesnoRNASmallnucleolarRNAOtherIncluding

largeRNAwith

roles

inchromotinstructure

andimprintingtRNATransfer

RNAInterfacebetweenmRNA

&aminoacidssnRNASmallnuclearRNA-Incl.

RNA

thatform

part

ofthespliceosomemiRNAMicro

RNASmall

RNAinvolvedregulation

ofexpressionrRNARibosomal

RNAParticipate

inproteinFound

innucleolus,involved

inmodificationof

rRNAsynthesissiRNASmall

interfering

RNAActive

molecules

inRNA

interferencestRNASmalltemporalRNA.RNA

with

arole

indevelopmental

timingmRNA結(jié)構(gòu)?

占細(xì)胞中總RNA的１%

-５%?

不均一分子?

有編碼序列與非編碼序列原核生物mRNA結(jié)構(gòu)?

５’端：翻譯起始序列?

３’端：翻譯終止序列?

少量的間隔序列?

無(wú)帽無(wú)尾真核生物成熟

mRNA結(jié)構(gòu)?

５’端帽子結(jié)構(gòu):

經(jīng)甲基化修飾,以5’,5’-磷酸二酯鍵相連的GTP.

(m7G5’ppp5’Np)?

功能：與蛋白質(zhì)合成起始及保護(hù)mRNA不易被降解有關(guān)?

３

’端尾結(jié)構(gòu)

３’端：20-250個(gè)多聚腺苷酸結(jié)構(gòu)（poly

A）。poly

A不是轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物?

功能：

穩(wěn)定mRNATypes

of

RNAncRNANon-coding

RNA.

TranscribedRNA

with

astructural,mRNAfunctional

orcatalytic

rolesnoRNASmallnucleolarRNAOtherIncluding

largeRNAwith

roles

inchromotinstructure

andimprintingtRNATransfer

RNAInterfacebetweenmRNA

&aminoacidssnRNASmallnuclearRNA-Incl.

RNA

thatform

part

ofthespliceosomemiRNAMicro

RNASmall

RNAinvolvedregulation

ofexpressionrRNARibosomal

RNAParticipate

inproteinFound

innucleolus,involved

inmodificationof

rRNAsynthesissiRNASmall

interfering

RNAActive

molecules

inRNA

interferencestRNASmalltemporalRNA.RNA

with

arole

indevelopmental

timing轉(zhuǎn)錄后基因沉默(PTGS)的發(fā)現(xiàn)目的：1990年美國(guó)人納波里利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)將一種催生紅色素的CHS基因插入牽牛花中，期望得到更艷麗的花朵轉(zhuǎn)錄后基因沉默(PTGS)的發(fā)現(xiàn)目的：1990年美國(guó)人納波里利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)將一種催生紅色素的CHS基因插入牽?；ㄖ?，期望得到更艷麗的花朵意大利的Cogoni等，將外源類胡蘿卜素基因?qū)腈滄呙梗Y(jié)果轉(zhuǎn)化細(xì)胞中內(nèi)源性的類胡蘿卜素基因也受到抑制1995年，SuGuo博士利用反義RNA技術(shù)特異性地阻斷線蟲par-1基因的表達(dá)；同時(shí)在對(duì)照實(shí)驗(yàn)中給線蟲注射正義1998年，AndrewFire等首次將正義鏈反義鏈RNA混合注入線蟲C.elegans中，觀察到更強(qiáng)的基因表達(dá)抑制。首次提出了RNARNA，以期觀察到基因表達(dá)的增強(qiáng)interference的概念A(yù)

control:notstainedB:

wtC:

wt

+antisense

RNAD:wt+ds

RNAMex-3

mRNA

detection

inembryosby

insitu

hybridization2000年，RNA的研究進(jìn)展被美國(guó)《科學(xué)》雜志評(píng)為重大科技突破2001年“RNA干擾”作為當(dāng)年最重要的科學(xué)研究成果之一，再次入選“十大科技突破”2002年12月20日，Science雜志將“Small

RNA

&RNAi”評(píng)為2002年度最耀眼的明星。Nature雜志亦將Small

RNA評(píng)為年度重大科技成功之一2003年，小核糖核酸的研究第四次入選“十大科技突破”，排在第四位沉默是金微RNA（microRNA,

miRNA）The

mechanism

of

miRNA

silencingPrecursor

ofmiRNAantisense

miRNADicermiRNPLin-4分解

mRNA抑制mRNA的翻譯Grisbok,Pasquinelli.Cell

,106:23-34,2001.第三節(jié)

核酸的理化性質(zhì)大小水解化學(xué)法1、低pH發(fā)生磷酸二酯鍵水解2、高pH

RNA的磷酸酯鍵易被水解，DNA則不易被水解DNA：人單倍體細(xì)胞中為2.9109bp酶法RNA：分子較小1、按底物專一性2、按對(duì)底物作用方式核酸的變性、復(fù)性與雜交變性（denaturation）熔解曲線，melting

curveTm

—在DNA熱變性時(shí)，其A260的升高達(dá)最大值一半時(shí)的溫度復(fù)性(renaturation)變性DNA經(jīng)過(guò)一定處理重新形成雙螺旋的過(guò)程DNA濃度DNA片段的大小DNA片段復(fù)雜性合適的復(fù)性溫度適當(dāng)?shù)碾x子強(qiáng)度兩條來(lái)源不同，但具有互補(bǔ)序列的核酸，按堿基配對(duì)原則復(fù)性形成一個(gè)雜交體，這個(gè)過(guò)程即雜交，或稱分子雜交雜交（）第二部分

聚合酶鏈反應(yīng)(Polymerase

Chain

Reaction

,PCR)PCR技術(shù)的誕生與發(fā)展1985年

美國(guó)PE-cetus公司人類遺傳研究室的Karymullis發(fā)明了具有劃時(shí)代意義的PCR技術(shù)1988年

美國(guó)PE-cetus公司推出世界上第一臺(tái)PCR熱循環(huán)儀，從而使PCR反應(yīng)自動(dòng)化1993年

Kary

Mullis因發(fā)明PCR技術(shù)獲得諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)1995年

定量PCR儀誕生，使定量研究DNA靶序列成為現(xiàn)實(shí)PCR反應(yīng)的特點(diǎn)靈敏度高

簡(jiǎn)便、快速整個(gè)PCR操對(duì)標(biāo)本的純度要求低特異性強(qiáng)指數(shù)增長(zhǎng)，從pg

(10-12)可擴(kuò)增至mg(10-6)水平作過(guò)程，從標(biāo)本處理、PCR擴(kuò)增到產(chǎn)物分析，可在4h內(nèi)完成全部實(shí)驗(yàn)引物與模板結(jié)合的特異性及聚合酶的忠實(shí)性DNA

粗制品及總RNA均可作為擴(kuò)增模板PCR反應(yīng)原理和反應(yīng)過(guò)程DNA的體外復(fù)制的步驟變性（denaturation）退火（annealing）延伸（extension）PCR基本組成其他DNA聚合模板酶引物脫氧核糖核苷酸DNA體內(nèi)復(fù)制DNA的體外復(fù)制30次循環(huán)后靶序列擴(kuò)增的數(shù)量No.

of

No.

AmpliconCycles

Copies

of

Target1cycle=2

Amplicon122

cycle

=4Amplicon3

cycle

=8

Amplicon244

cycle=16

Amplicon384165

cycle

=

32

Amplicon5326

cycle

=64

Amplicon66420301,048,5761,073,741,8247

cycle

=

128

AmpliconPCR擴(kuò)增過(guò)程圖示122434567898163264160000000014000000001200000000100000000080000000060000000040000000020000000001282565121,0242,0484,0968,19216,3841011121314151617181920212223242526272829303132333432,76865,53605101520253035PCR

CYCLE

NUMBER131,072262,144524,2881,048,5762,097,1524,194,3048,388,60816,777,21633,554,43267,108,864134,217,728268,435,456536,870,9121,073,741,8241,400,000,0001,500,000,0001,550,000,0001,580,000,00010000000000100000000010000000010000000100000010000010000100010010105101520253035PCR

CYCLE

NUMBERCYCLE

AMOUNT

OF

DNA

AMOUNT

OF

DNA

AMOUNT

OF

DNA

AMOUNT

OF

DNA100%

EFFICIENCY

90%

EFFICIENCY

80%

EFFICIENCY

70%

EFFICIENCY012312481612471312361012358AFTER1CYCLE45632642547193414

100%

=

2.00x2490%

=

1.90x80%

=1.80x70%

=1.70x789128256512891703236136111019835741701192023431011121314151617181920212223242526272829301,0242,0484,0968,1921,1652,2134,2057,9906431,1572,0823,7486,74758399016,38432,76865,536131,072262,144524,2881,048,5762,097,1524,194,3048,388,60816,777,21633,554,43267,108,864134,217,728268,435,456536,870,9121,073,741,8241,6842,8624,8668,27215,18128,84454,804104,127197,842375,900714,2091,356,9982,578,2964,898,7639,307,65017,684,53433,600,61563,841,168121,298,220230,466,61812,14421,85939,34670,824127,482229,468413,043743,4771,338,2592,408,8664,335,9597,804,72614,048,50625,287,31145,517,16014,06323,90740,64269,092117,456199,676339,449577,063981,0071,667,7112,835,1094,819,6868,193,466?

以PCR擴(kuò)增所需的下游引物作為逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)的引物?

以oligo(dT)作為引物，mRNA3’末端polyA尾與之互補(bǔ)逆轉(zhuǎn)錄生成cDNA方式?

以人工合成的隨機(jī)序列(6

bp)混合物作為引物ddTTPDNA鏈中的戊糖在3’位碳原子上有-OH基團(tuán)，在

DNA合成、鏈的延長(zhǎng)過(guò)程中，新?lián)饺氲拿撗鹾塑账?’-p與前一核苷酸的戊糖3’-OH以磷酸二酯鍵相連DNA序列分析雙脫氧鏈終止法(Sanger)Sanger法是在反應(yīng)體系中加入

2’,3’

-ddNTP，由于其沒(méi)有3’-OH而不能與下一個(gè)核苷酸相連，于是DNA鏈的合成便終止設(shè)計(jì)沙眼衣原體引物（Chlamydiatrachomatis，CT）確定擬要研究的基因:CTGenbank中找到相應(yīng)的基因序列

采用引物設(shè)計(jì)軟件進(jìn)行引物的設(shè)計(jì)/確保引物的特異性，將設(shè)計(jì)好的序列在www.ncbi.nlm.nih/blast

中核實(shí)第三部分實(shí)時(shí)熒光定量PCR(real-time

quantitative

PCR)熒光定量PCR與常規(guī)PCR的區(qū)別常規(guī)PCR技術(shù)熒光定量PCR技術(shù)?

實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)PCR擴(kuò)增反應(yīng)中每一個(gè)循環(huán)的產(chǎn)物對(duì)PCR擴(kuò)增的終產(chǎn)物進(jìn)行定性及定量分析?

定量分析PCR即每個(gè)循環(huán)后擴(kuò)增子增加一倍。當(dāng)原料和酶相對(duì)于模板大大減少，PCR的效率就會(huì)降低，直至為0。所以實(shí)際的擴(kuò)增曲線是“S”型，而不是“J”型Real

time

PCR

同樣不能直接測(cè)出初始DNA

的分子數(shù)，但采用的數(shù)據(jù)是