免疫學(xué)檢測方法

免疫學(xué)檢測方法第一頁，共六十四頁，編輯于2023年，星期五第二頁，共六十四頁，編輯于2023年，星期五第三頁，共六十四頁，編輯于2023年，星期五檢測技術(shù)種類

一、免疫學(xué)檢測免疫凝集試驗免疫沉淀試驗酶聯(lián)免疫試驗熒光免疫技術(shù)免疫電鏡技術(shù)免疫印跡試驗第四頁，共六十四頁，編輯于2023年，星期五第五頁，共六十四頁，編輯于2023年，星期五細(xì)菌凝集反應(yīng)被廣泛應(yīng)用于細(xì)菌學(xué)的診斷。在凝集反應(yīng)中，將參與反應(yīng)的抗原稱為凝集原，抗體稱為凝集素。

凝集法測定哈維氏弧菌抗體的效價

管號1234567磷酸鹽緩沖液0.90.90.90.90.90.91.0兔抗X菌血清0.10.1(1)0.1(2)0.1(3)0.1(4)0.1(5)0.01.稀釋抗體2.玻片凝集法用1ml移液槍取6號離心管中的溶液一滴滴在載玻片的一端，另一端加一滴磷酸鹽緩沖液，然后分別加一滴準(zhǔn)備好的X菌液。牙簽混勻，至于顯微鏡下觀察，看是否有凝集塊的形成。后取5、4……1號管的溶液逐個重復(fù)1、2步驟。取有凝集塊變?yōu)闊o凝集塊時,那個有凝集反應(yīng)的試管作為抗體的效價。第六頁，共六十四頁，編輯于2023年，星期五第七頁，共六十四頁，編輯于2023年，星期五第八頁，共六十四頁，編輯于2023年，星期五第九頁，共六十四頁，編輯于2023年，星期五沉淀凝集反應(yīng)第十頁，共六十四頁，編輯于2023年，星期五第十一頁，共六十四頁，編輯于2023年，星期五第十二頁，共六十四頁，編輯于2023年，星期五第十三頁，共六十四頁，編輯于2023年，星期五第十四頁，共六十四頁，編輯于2023年，星期五雙向免疫擴散沉淀線示意圖第十五頁，共六十四頁，編輯于2023年，星期五瓊擴反應(yīng)第十六頁，共六十四頁，編輯于2023年，星期五第十七頁，共六十四頁，編輯于2023年，星期五第十八頁，共六十四頁，編輯于2023年，星期五中和實驗第十九頁，共六十四頁，編輯于2023年，星期五熒光免疫技術(shù)

熒光免疫技術(shù)又稱熒光抗體技術(shù)。它將免疫化學(xué)和血清學(xué)的高度特異性和敏感性與顯微技術(shù)的高度精確性相結(jié)合，為免疫學(xué)、臨床組織化學(xué)及實驗室診斷提供了一項其它方法尚不能取代的、并有其獨特風(fēng)格的技術(shù)。目前，該技術(shù)已廣泛應(yīng)用于細(xì)菌、病毒、原蟲以及真菌等的鑒定和相應(yīng)病的診斷，血清抗體的檢查，病理組織學(xué)抗原、抗體和補體的鑒定及定位，免疫復(fù)合物病理的研究，細(xì)菌、病毒與細(xì)胞之間抗原關(guān)系的研究等方面。其主要優(yōu)點在于：特異性強，速度快，敏感性高；其缺點在于：非特異性染色問題尚未解決，結(jié)果判定的客觀性不足，技術(shù)程序也比較復(fù)雜。第二十頁，共六十四頁，編輯于2023年，星期五1、原理

熒光免疫技術(shù)是一種以熒光物質(zhì)作為標(biāo)記物的免疫分析技術(shù)，熒光物質(zhì)的分子在特定條件下吸收激發(fā)光的能量后，分子呈激發(fā)態(tài)而極不穩(wěn)定，其迅速回到基態(tài)時，以電磁輻射形式釋放出所有的光能，發(fā)射出波長較照射光長的熒光。熒光免疫技術(shù)可分為熒光免疫組織化學(xué)技術(shù)和熒光測定技術(shù)。熒光抗體技術(shù)屬于前者，它是利用某些熒光素通過化學(xué)方法與特異性抗體結(jié)合，形成的免疫復(fù)合物在一定波長光的激發(fā)下可產(chǎn)生熒光，因此借助熒光顯微鏡檢測或定位被檢抗原。其又可分為直接熒光抗體法、間接熒光抗體法和補體熒光抗體法。第二十一頁，共六十四頁，編輯于2023年，星期五熒光色素異硫氰酸熒光素（FITC）四乙基羅丹明（RB200）四甲基異硫氰酸羅丹明（TMRITC)第二十二頁，共六十四頁，編輯于2023年，星期五1、熒光抗體染色方法

直接法間接法

2、熒光抗體技術(shù)的應(yīng)用

在細(xì)菌學(xué)診斷中的應(yīng)用

在病毒感染診斷中的應(yīng)用

其它方面的應(yīng)用第二十三頁，共六十四頁，編輯于2023年，星期五間接熒光抗體法（IFAT）操作步驟如下：

（1）單層血細(xì)胞滴片，室溫晾干，放入丙酮中固定10min。室溫晾干。

（2）以小白鼠抗血清（或雜交瘤細(xì)胞上清液）為第一抗體，加在血細(xì)胞抗原上。37℃濕盒中孵育45min。

（3）0.01MPBS洗三次，每次5min。

（4）加第二抗體IgG-FITC，37℃濕盒中孵育45min。

（5）0.01MPBS洗三次，每次5min。

（6）甘油封片，熒光鏡下觀察，拍照。第二十四頁，共六十四頁，編輯于2023年，星期五間接免疫熒光法檢測對蝦白斑癥病毒病第二十五頁，共六十四頁，編輯于2023年，星期五間接免疫熒光法檢測淋巴囊腫病毒第二十六頁，共六十四頁，編輯于2023年，星期五第二十七頁，共六十四頁，編輯于2023年，星期五第二十八頁，共六十四頁，編輯于2023年，星期五第二十九頁，共六十四頁，編輯于2023年，星期五直接ELISA第三十頁，共六十四頁，編輯于2023年，星期五間接ELISA第三十一頁，共六十四頁，編輯于2023年，星期五間接酶聯(lián)免疫吸附試驗操作步驟如下：（1）分別以不同單抗為第一抗體，加在血細(xì)胞抗原上。37℃濕盒中孵育60min。（2）0.01MPBS洗三次，每次5min。（3）加AP-IgG為第二抗體，37℃濕盒中孵育45min。（4）0.01MPBS洗三次，每次5min。（5）加NBT/BCIP底物緩沖液發(fā)色10min，（6）出現(xiàn)顏色加終止液終止反應(yīng)。

（7）用酶標(biāo)分析儀在405nm,處測定各孔的吸光度，計算P／N（樣品光吸收值與陰性對照的值），判定ELISA反應(yīng)結(jié)果。大于2.1時可判斷為陽性。以最大顯色至陽性的顯色孔50%反應(yīng)孔的抗體稀釋倍數(shù)為抗體效價。

第三十二頁，共六十四頁，編輯于2023年，星期五第三十三頁，共六十四頁，編輯于2023年，星期五圖

DOTBLOT方法篩選結(jié)果圖。第三十四頁，共六十四頁，編輯于2023年，星期五免疫組織化學(xué)方法定扇貝血細(xì)胞分布第三十五頁，共六十四頁，編輯于2023年，星期五細(xì)胞免疫化學(xué)法檢測病毒感染第三十六頁，共六十四頁，編輯于2023年，星期五四、Westernblot

是蛋白水平檢測，研究基因表達與功能的一種方法。原理及步驟樣品

聚丙烯酰胺凝膠電泳，分離蛋白（SDS)

轉(zhuǎn)移（印跡）于硝酸纖維素膜

加抗體檢測某種特異性蛋白質(zhì)第三十七頁，共六十四頁，編輯于2023年，星期五WestBlot第三十八頁，共六十四頁，編輯于2023年，星期五圖：淋巴囊腫病毒與抗血清的Westernblotting結(jié)果第三十九頁，共六十四頁，編輯于2023年，星期五第四十頁，共六十四頁，編輯于2023年，星期五免疫電鏡技術(shù)免疫電鏡技術(shù)（immuneelectronmicroscopictechnique）是一種將免疫學(xué)技術(shù)與電子顯微鏡技術(shù)相結(jié)合的血清學(xué)方法，能使抗原在分子水平上進行定位。它實際上是將細(xì)胞水平的熒光抗體技術(shù)的基本原理應(yīng)用于分子水平上。這一技術(shù)的發(fā)明使抗原和抗體的定位研究達到了亞細(xì)胞或分子水平。主要有以下幾種技術(shù)。鐵蛋白抗體法酶標(biāo)記抗體法重金屬標(biāo)記抗體法第四十一頁，共六十四頁，編輯于2023年，星期五圖膠體金標(biāo)記免疫電鏡結(jié)果[(A)(D)bar=200nm;(B)(C)bar=100nm]第四十二頁，共六十四頁，編輯于2023年，星期五膠體金免疫技術(shù)膠體金是氯金酸在還原劑如白磷、抗壞血酸等作用下的水溶液，具有高電子密度，并能與多種大分子發(fā)生物理吸附，因此，不但所有的大分子物質(zhì)都可被金標(biāo)記，而且標(biāo)記后大分子物質(zhì)活性不發(fā)生改變。當(dāng)抗原和金標(biāo)抗體反應(yīng)時，肉眼可見紅色或粉紅色斑條（點）,在顯微鏡下觀察，抗原抗體結(jié)合處為黑褐色的顆粒。第四十三頁，共六十四頁，編輯于2023年，星期五

斑點免疫金滲濾法（DIGFA）的應(yīng)用與研究進展是20世紀(jì)八十年代發(fā)展起來的一種免疫學(xué)檢測方法，具有簡便、快速、準(zhǔn)確等優(yōu)點。目前在醫(yī)學(xué)檢驗中主要應(yīng)用于檢測HBsAg、HCG和HIV等。第四十四頁，共六十四頁，編輯于2023年，星期五斑點免疫金滲濾法原理：

NCM為固相載體通過滲濾抗原與抗體在膜上快速反應(yīng)標(biāo)記的膠體金堆積顯色。膠體金抗體抗原NCM吸水墊第四十五頁，共六十四頁，編輯于2023年，星期五

臨床應(yīng)用：間接法測抗體：

NCM抗原樣品抗體金標(biāo)抗抗體顯色夾心法測抗原：

NCM多抗樣品抗原金標(biāo)單抗顯色。第四十六頁，共六十四頁，編輯于2023年，星期五

直接法檢測抗原

NCM病毒金標(biāo)單抗顯色

DIGFA步驟簡化、時間縮短。

第四十七頁，共六十四頁，編輯于2023年，星期五DIGFA檢測操作程序2μl檢測樣品NCM直徑2mm點晾干；

100μl封閉液，滲入；

100μl的金標(biāo)抗體，滲入；100μl的0.01MPBS-T（含0.05%Tween-20），滲入；檢測結(jié)果：紅色斑點的為陽性，無紅色斑點的為陰性。陽性代表檢測樣品中有病毒，陰性則無。第四十八頁，共六十四頁，編輯于2023年，星期五DIGFA檢測結(jié)果,紅色斑點的為病毒陽性,無紅色斑點的為病毒陰性。TheresultofDIGFA,reddotshowsthereisWSSV,otherwise,thereisnoWSSV.

第四十九頁，共六十四頁，編輯于2023年，星期五

免疫金標(biāo)層析法的應(yīng)用與研究進展

免疫金層析法快速診斷試紙條是20世紀(jì)90年代以來在單克隆抗體技術(shù)、膠體金免疫層析技術(shù)和新材料技術(shù)基礎(chǔ)上發(fā)展起來的一項新型體外診斷技術(shù)

醫(yī)學(xué)：乙肝表面抗原、心肌肌鈣蛋白T、

HCG

獸醫(yī)：豬瘟抗體

食品：克倫特羅（瘦肉精）、氯霉素

其他：飼料中的磺胺類藥物殘留物、轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品

第五十頁，共六十四頁，編輯于2023年，星期五檢測試紙的原理是：采用夾心免疫層析原理，即由金標(biāo)單抗同檢測樣品液中的抗原反應(yīng)，形成由金標(biāo)單抗-抗原復(fù)合物，當(dāng)該復(fù)合物層析至硝酸纖維素膜上預(yù)先包被在檢測線上的另一種單抗處時，此處的抗體會識別該復(fù)合物中抗原，反應(yīng)的結(jié)果便形成了金標(biāo)單抗+抗原+包被單抗的夾心結(jié)構(gòu)，最終是金標(biāo)單抗上的膠體金顆粒在此固定并累積出現(xiàn)肉眼可見的紅色線，未反應(yīng)的金標(biāo)單抗則仍繼續(xù)層析前行,當(dāng)?shù)竭_點預(yù)先包被在質(zhì)控線羊抗鼠抗體處時，金標(biāo)單抗被其結(jié)合住，從而在此處也出現(xiàn)由膠體金顆粒固定并累積而顯現(xiàn)出肉眼可見的紅色線，結(jié)果是：檢測線顯示紅色表示樣品陽性；檢測線不顯示紅色，表示樣品陰性。質(zhì)控線顯示紅色，表示試紙有效；質(zhì)控線處不顯示紅色，說明試紙失效，即或是金標(biāo)單抗、或是羊抗鼠抗體失活，檢測結(jié)果無效。第五十一頁，共六十四頁，編輯于2023年，星期五該試紙條構(gòu)成:載體板7；在該載體板7的兩端部，分別設(shè)有加樣端4吸水層和手持端1吸水層；在該載體板7中部段設(shè)有硝酸纖維膜的檢測層2，在該檢測層2與加樣端4吸水層交界處，設(shè)有載有金標(biāo)單抗E的玻璃纖維層塊3，該層塊3一端部分設(shè)置在加樣端4吸水層之下，其另一端部分設(shè)置在檢測層2之上；在與該層塊3延續(xù)的檢測層2上設(shè)有檢測線6和質(zhì)控線5，該檢測線6和質(zhì)控線5處分別包被有抗病毒單抗和羊抗鼠IgG。第五十二頁，共六十四頁，編輯于2023年，星期五

用吖啶酯直接標(biāo)記抗體(抗原)，與待測標(biāo)本中相應(yīng)的抗原(抗體)發(fā)生免疫反應(yīng)后，形成固相包被抗體-待測抗原-吖啶酯標(biāo)記抗體復(fù)合物，這時只需加入氧化劑（H2O2）和NaOH使成堿性環(huán)境，吖啶酯在不需要催化劑的情況下分解、發(fā)光。由集光器和光電倍增管接收、記錄單位時間內(nèi)所產(chǎn)生的光子能，這部分光的積分與待測抗原的量成正比，可從標(biāo)準(zhǔn)曲線上計算出待測抗原的含量。

直接化學(xué)發(fā)光免疫分析第五十三頁，共六十四頁，編輯于2023年，星期五發(fā)光YYY磁微粒被測抗原+抗體+帶丫啶酯標(biāo)記物抗體YYYYYYYYYYY沖洗后

夾心法（1）加入H2O2（pH<10）（2）加入堿（pH>10）直接化學(xué)發(fā)光的機理第五十四頁，共六十四頁，編輯于2023年，星期五磁微粒模式圖YYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYY特點已結(jié)合的抗原和抗體與未結(jié)合部分的易分離磁微粒技術(shù)第五十五頁，共六十四頁，編輯于2023年，星期五五、聚合酶鏈反應(yīng)（polymerasechainreaction,PCR）

PCR是模擬體內(nèi)DNA復(fù)制條件，應(yīng)用DNA聚合酶反應(yīng)，特異性擴增某一DNA片段的技術(shù)。體外程序化的DNA合成技術(shù)。KaryB.Mullis第五十六頁，共六十四頁，編輯于2023年，星期五第五十七頁，共六十四頁，編輯于2023年，星期五PCR第五十八頁，共六十四頁，編輯于2023年，星期五ACGTAGTAGCATAGCAATGTACATCATCAGATAGACGATTGACAGTGATCTCGACGATGCATCTTGCATCATCGTATCGTTACATGTAGTAGTCTATCTGCTAACTGTCACTAGAGCTGCTACGTAAStep3:Extension延伸72°CCGTAGTAGCAGCTGCTACGTAGTaqPolymeraseTaqPolymeraseTAGCAATGTACATCATCAGATAGACGATTGACAGTGATCTCGACGATGCATCGCATCATCGTATCGTTACATGTAGTAGTCTATCTGCTAACTGTCACTAGA第五十九頁，共六十四頁，編輯于2023年，星期五原理：1)合成待擴增區(qū)域兩端已知序列，與模板DNA互補的寡核苷酸特異性引物，引物的序列決定擴增片段的長度；2)反應(yīng)體系：DNA模板，dNTP，TaqDNA聚合酶，buffer3)反應(yīng)程序：

變性(94~95oC)