細(xì)胞技術(shù)第六次課

第六次課細(xì)胞的復(fù)蘇、細(xì)胞周期測(cè)定、真核細(xì)胞轉(zhuǎn)染一、原理在不加任何條件下直接凍存細(xì)胞時(shí)，細(xì)胞內(nèi)和外環(huán)境中的水都會(huì)形成冰晶，能導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)發(fā)生機(jī)械損傷、電解質(zhì)升高、滲透壓改變、脫水、PH改變、蛋白變性等，能引起細(xì)胞死亡。如向培養(yǎng)液加入保護(hù)劑，可使冰點(diǎn)降低。在緩慢的凍結(jié)條件下，能使細(xì)胞內(nèi)水份在凍結(jié)前透出細(xì)胞。貯存在－130℃以下的低溫中能減少冰晶的形成。細(xì)胞復(fù)蘇時(shí)速度要快，使之迅速通過細(xì)胞最易受損的－5～0℃，細(xì)胞仍能生長(zhǎng)，活力受損不大。目前常用的保護(hù)劑為二甲亞砜（DMSO）和甘油，它們對(duì)細(xì)胞無毒性，分子量小，溶解度大，易穿透細(xì)胞。實(shí)驗(yàn)七細(xì)胞的復(fù)蘇二、操作步驟1、準(zhǔn)備一個(gè)37℃水浴箱（或一只茶缸或1000ml的燒壞，內(nèi)裝2/3杯37℃的溫水）。2、從液氮中取出凍存管、迅速置于溫水中并不斷攪動(dòng)。使凍存管中的凍存物在1分鐘之內(nèi)融化。3、打開凍存管，將細(xì)胞懸液吸到離心管中（預(yù)先加有10ml完全培養(yǎng)液），吹打均勻。4、1000rpm離心5分鐘，棄去上清液。5、沉淀加適當(dāng)培養(yǎng)基吹打均勻后，將細(xì)胞轉(zhuǎn)移至培養(yǎng)瓶中，37℃培養(yǎng)，第二天觀察生長(zhǎng)情況。流式細(xì)胞術(shù)（FlowCytometry簡(jiǎn)稱FCM）是一種快速測(cè)定單個(gè)細(xì)胞物理、化學(xué)、生物特性的儀器。商品儀器的測(cè)量速度約每秒1000—3000個(gè)細(xì)胞，這種技術(shù)與現(xiàn)代一系列高技術(shù)的發(fā)展有密切關(guān)系。目前已可測(cè)量細(xì)胞的大小、體積、DNA含量、總蛋白、RNA含量、表面抗原、染色體、膜的完整性、DNA合成速率等。已廣泛用于細(xì)胞學(xué)、腫瘤學(xué)、遺傳學(xué)、免疫學(xué)、血液學(xué)和若干臨床的領(lǐng)域中，其應(yīng)用的范圍有不斷擴(kuò)大的趨勢(shì)。實(shí)驗(yàn)七細(xì)胞周期測(cè)定什么是細(xì)胞周期

？由細(xì)胞分裂結(jié)束到下一次細(xì)胞分裂結(jié)束所經(jīng)歷的過程，叫細(xì)胞周期。分為4個(gè)期：G1期(gap1)，指從有絲分裂完成到期DNA復(fù)制之前的間隙時(shí)間。S期(synthesisphase)，指DNA復(fù)制的時(shí)期。G2期(gap2)，指DNA復(fù)制完成到有絲分裂開始之前的一段時(shí)間。M期又稱D期(mitosisordivision)，細(xì)胞分裂開始到結(jié)束。EucaryoticCellCycle

Atypicalmammaliancellhasacellcycletimeof24hours,with12hrG1,6-8hrS,3-4hrG2,and1hrM（一）原理細(xì)胞通過用DNA結(jié)合染料進(jìn)行染色，如PI。DNA圖示：能夠作出對(duì)細(xì)胞在細(xì)胞周期G1/G2，S和G2/M階段的產(chǎn)量的評(píng)估；不能很好地提供有關(guān)細(xì)胞通過細(xì)胞周期的運(yùn)動(dòng)信息；能夠較易地進(jìn)行免疫熒光結(jié)合染色。碘化丙錠（PropidiumIodide，簡(jiǎn)稱PI），為核酸嵌入型染料，可嵌入雙股螺旋多核苷酸結(jié)構(gòu)，故DNA和RNA均可著色。PI不能穿過活細(xì)胞膜，故活細(xì)胞拒染；但能穿過死細(xì)胞膜，使之著色。（二）試劑和器材

RNA酶APIC6細(xì)胞流式細(xì)胞儀

（三）操作步驟1．單細(xì)胞懸液用計(jì)數(shù)器計(jì)數(shù)后，取總數(shù)約2×106個(gè)細(xì)胞，用70%冷酒精，在4℃固定1天。2．離心1500轉(zhuǎn)/分，10分鐘，去上清，用PBS沖洗，打散、搖勻。3．再次離心，去上清，留0.2ml左右，加入RNA酶A，每個(gè)樣品要求加入3000—5000單位，37℃孵育30分鐘。4．將樣品放入冰中，冷卻后每個(gè)樣品加入大約1.5ml的PI（PI濃度為50μg/ml，用PBS溶解），再次放入冰中避光染色20分鐘。5．染色后的樣品在4小時(shí)內(nèi)上機(jī)測(cè)量，測(cè)試結(jié)果以DNA直方圖表示。6．有計(jì)算機(jī)軟件時(shí)，可做進(jìn)一步的DNA分布分析。流式細(xì)胞儀測(cè)定細(xì)胞周期分期實(shí)驗(yàn)結(jié)果一、原理將外源性基因(或基因組DNA)采用分子生物學(xué)技術(shù)人工地導(dǎo)入細(xì)胞，觀察它在細(xì)胞中的表達(dá)，研究其生物學(xué)特性和功能，這種把基因?qū)爰?xì)胞中的技術(shù)稱為基因轉(zhuǎn)導(dǎo)(genetransfer)或稱基因轉(zhuǎn)移，也簡(jiǎn)稱為導(dǎo)入。是研究基因表達(dá)、結(jié)構(gòu)和功能的重要研究手段。主要方法有：磷酸鈣沉淀法、電擊法、脂質(zhì)體法、顯微注射法、逆轉(zhuǎn)錄病毒等病毒介導(dǎo)法等。實(shí)驗(yàn)八真核細(xì)胞轉(zhuǎn)染

脂質(zhì)體(lipofectinregeant,LR)試劑是陽離子脂質(zhì)體N-[1-2，3-Dioleyoxy,Propyl]-n,n,n-TrimethylammoniumChloride(DOTMA)和Dioleoylphotidye-thanolamine(DOPE)的混合物[1:1(w/w)]。它適用于把DNA轉(zhuǎn)染入懸浮或貼壁培養(yǎng)細(xì)胞中，是目前條件下最方便的轉(zhuǎn)染方法之一。轉(zhuǎn)染率高，優(yōu)于磷酸鈣法，比它高5～100倍，能把DNA和RNA轉(zhuǎn)染到各種細(xì)胞。二、實(shí)驗(yàn)材料

1、宿主細(xì)胞C6（貼壁細(xì)胞）2、脂質(zhì)體LIPOFECTAMINE2000（invitrogen公司）3、96孔細(xì)胞培養(yǎng)板4、無血清培養(yǎng)基OPTI-MEM（GIBICO）5、轉(zhuǎn)染級(jí)質(zhì)粒三、操作步驟1、轉(zhuǎn)染前一天，以合適的細(xì)胞密度接種到培養(yǎng)板上。（接種密度是3~4×105/ml.）轉(zhuǎn)染時(shí)，細(xì)胞要達(dá)到90~95%的融合。2、溶液1：25ul無血清培養(yǎng)基+0.5ullipofectamine2000perwell（總體積25ul）（溫育5min）3、溶液2：Xul無血清培養(yǎng)基+0.2ug質(zhì)粒perwell（總體積25ul）4、將溶液1與溶液2混合，室溫下置20min。5、與此同時(shí)，將細(xì)胞用無血清培養(yǎng)基沖洗細(xì)胞兩遍后，加入100ul無血清培養(yǎng)基。6、將溶液1與溶液2的混合液逐滴加入孔中，搖動(dòng)培養(yǎng)板，輕輕混勻。在37℃，5％的CO2中保溫5~6小時(shí)。7、6小時(shí)后，更換含有血清的全培養(yǎng)基，在37℃，5％的CO2中48~72h檢測(cè)轉(zhuǎn)染水平。四、注意事項(xiàng)1.細(xì)胞的狀態(tài)：有文獻(xiàn)說傳代不要超過17代。在細(xì)胞復(fù)蘇后的3代左右做，那時(shí)細(xì)胞狀態(tài)最好，不要用傳了很多代的細(xì)胞去做，細(xì)胞的形態(tài)都會(huì)發(fā)生變化了。2.細(xì)胞的融合度：細(xì)胞的融合度必須要達(dá)到90%才能做，細(xì)胞太少，容易死。3.注意洗的時(shí)候要輕，靠邊緣緩緩加入液體，然后不要吹吸細(xì)胞，而是轉(zhuǎn)動(dòng)培養(yǎng)板讓液體滾動(dòng)在細(xì)胞表面。如果洗的太厲害，細(xì)胞又損失一部分，加了脂質(zhì)體后，細(xì)胞受影響就更大了，死亡細(xì)胞會(huì)增多。

4.加入寬無血僵清培府養(yǎng)基司后5~酬6小時(shí)貪更換郵全培懂養(yǎng)基歌。無灣血清酷培養(yǎng)爆基培鵲養(yǎng)時(shí)驅(qū)間過梨長(zhǎng)，辱對(duì)細(xì)商胞是游有毒伍性的豪。5.轉(zhuǎn)染悠的質(zhì)挽粒一俱定純渡度好裹、濃方度高匯、無舍內(nèi)毒該素。啄濃度將不要?dú)У陀?.星35喇ug移/u旁l。低桃濃度置的質(zhì)劈燕粒，蜜做的受結(jié)果物都不寄好。6.遺48小時(shí)m