異氟醚減少離體鼠肝缺氧-復(fù)氧損傷與枯否細胞有關(guān)

異氟醚減少離體鼠肝缺氧－復(fù)氧損傷與枯否細胞有關(guān)【摘要】目的明確異氟醚減少離體鼠肝缺氧－復(fù)氧損傷的作用主要發(fā)生在哪一階段，以及與枯否細胞的關(guān)系。方法將大鼠肝臟取下，置于離體鼠肝灌流儀中，以經(jīng)95%O2/5％CO2飽和的改良克－林氏碳酸氫鹽緩沖液恒壓灌流，維持生理pH值和溫度，實時監(jiān)測灌流液中LDH變化。2MAC異氟醚分別用于缺氧期、復(fù)氧期和缺氧－復(fù)氧期。用GdCl3選擇性抑制枯否細胞活性。結(jié)果(1)2MAC異氟醚用于缺氧－復(fù)氧期和單純用于復(fù)氧期均可抑制LDH升高，而單純用于缺氧期則無明顯作用。(2)2MAC異氟醚和(或)GdCl3組均可抑制肝臟缺氧－復(fù)氧后LDH升高。結(jié)論異氟醚保護缺氧－復(fù)氧肝臟免受損傷的作用主要發(fā)揮在復(fù)氧期，異氟醚在復(fù)氧期發(fā)揮保護作用可能與抑制復(fù)氧引起的氧自由基爆發(fā)有關(guān)，其作用與枯否細胞活性密切相關(guān)。

【關(guān)鍵詞】異氟醚；離體鼠肝；缺氧－復(fù)氧損傷；枯否細胞

【Abstract】ObjectiveToinvestigatewhichstageisthemostimportantandtherelationshipwithkupffercell，duringisofluranedecreaseanoxia-reoxygenationinjuryinisolatedratWeestablishedthemodelofisolatedratincludedartificiallung，pump，pressuremeter，flowmeter，thermostat，humidifierandliverswereharvestedandplacedinthewereflushedwithmodifiedKrebs’buffer，whichweresaturatedwith95%O2/5%CO2andwereaddedwith10mMglucoseand1%perfusionpressureswerecontrolledconstantlyatkPa(oxygenation)orkPa(anoxia).PHandtemperatureweremaintainedproperly，andoxygenpressureorliverflowwereisofluranewereusedintheperiodsofanoxia，reoxygenationoranoxia-reoxygenationwasusedtoinhibittheactivationofkupffer(1)2MACisofluraneinhibitedLDHreleaseintheperiodsofbothanoxia-reoxygenationandreoxygenationinisolatedratliver，whileitwasnoteffectiveintheperiodofanoxia.(2)Both2MACisofluraneandGdCl3decreasedLDHreleaseobviouslyafteranoxiaandreoxygenationinisolatedratReoxygenationstageisthemostimportantduringisofluranedecreaseanoxia-reoxygenationinjuryinisolatedratmayprotecthepaticfunctionbyinhibitingoxygenstressoutsidecells，whichisrelatedtokupffercell.

【Keywords】isoflurane；isolatedratliver；anoxia-reoxygenationinjury；kupffercell

研究表明肝臟缺血－再灌注損傷分為兩相［1］：第一相是以枯否細胞介導(dǎo)為主的早期再灌注損害。第二相是以中性粒細胞介導(dǎo)為主的后期再灌注損傷。本研究以離體無血灌流鼠肝為模型，研究異氟醚如何保護肝臟缺氧－復(fù)氧損傷，以及與枯否細胞的關(guān)系，排除中性粒細胞可能帶來的影響。

1材料和方法

材料實驗動物選用雄性健康Wister大白鼠，重約200～250g，所有動物實驗前禁食24h。三氯化锝處理組在實驗前24h經(jīng)尾靜脈注射GdCl3/kg，對照組注射等量的生理鹽水。

建立離體鼠肝灌流模型用戊巴比妥鈉腹腔麻醉后開腹，小心分離肝周韌帶和血管，經(jīng)下腔靜脈注入肝素50u，然后迅速完成肝下下腔靜脈插管，門靜脈插管，并結(jié)扎肝上下腔靜脈，開始非循環(huán)灌流，可見肝臟即刻呈均勻土黃色，取下鼠肝置于離體鼠肝灌流儀中，開始循環(huán)灌流。離體鼠肝灌流儀經(jīng)米氏灌流儀包括人工肺、動力泵、測壓表、流量計、恒溫保濕系統(tǒng)和監(jiān)測系統(tǒng)組成。灌流液選用改良的克－林氏緩沖液，包括：NaCl117mM，KCl，CaCl2，KH2PO4，MgSO4，NaHCO3，另外加入葡萄糖10mM維持營養(yǎng)，加入1％牛血清白蛋白維持膠體滲透壓，有氧灌流用，缺氧灌流用，根據(jù)pH監(jiān)測調(diào)節(jié)pH在±范圍內(nèi)。實時監(jiān)測灌流液中LDH水平。

實驗處理步驟待循環(huán)灌流20min模型穩(wěn)定后開始從零計時，2MAC異氟醚分期給藥缺氧期：缺氧前20min至再灌注前10min；復(fù)氧期：再灌注前10min至實驗結(jié)束；缺氧－復(fù)氧期：缺氧前20min至實驗結(jié)束。

統(tǒng)計學(xué)方法所有數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準差(x±s)表示，應(yīng)用t檢驗或方差分析，以P≤為統(tǒng)計學(xué)差異有顯著性。

2結(jié)果

比較2MAC異氟醚用于缺氧－復(fù)氧各期對肝損傷的不同影響異氟醚用于缺氧－復(fù)氧期和單獨用于復(fù)氧期均可明顯抑制LDH水平，同樣發(fā)揮保護肝細胞的作用，說明異氟醚保護肝臟免受缺氧－復(fù)氧損傷的關(guān)鍵是作用在復(fù)氧期(見圖1)。

比較2MAC異氟醚與GdCl3對肝臟缺氧－復(fù)氧損傷的影響異氟醚組、GdCl3組及異氟醚＋GdCl3組均明顯抑制LDH水平，說明GdCl3可通過抑制KC活性保護肝臟缺氧－復(fù)氧損傷，而2MAC異氟醚可能也有類似作用(見圖2)。

復(fù)氧0～45min內(nèi)LDH的釋放量(IU/min)

處理組與缺氧—復(fù)氧對照組相比，*P＜，n=7

圖12MAC異氟醚用于肝細胞缺氧-復(fù)氧

各期對肝損傷的不同影響

復(fù)氧0～15min內(nèi)LDH的釋放量(IU/min)

處理組與缺氧—復(fù)氧對照組相比，*P＜，n=7

圖22MAC異氟醚和GdCl3對肝細胞缺氧-復(fù)氧損傷的影響

3討論

根據(jù)研究結(jié)果，我們認為：異氟醚保護肝臟免受缺氧－復(fù)氧損傷的關(guān)鍵是對復(fù)氧期發(fā)揮了作用，這種作用可能與抑制KC活性有關(guān)。

如圖1所示：2MAC異氟醚單獨用于復(fù)氧期所產(chǎn)生的效果和用于缺氧－復(fù)氧全期所產(chǎn)生的效果一樣明顯，而異氟醚單獨用于缺氧期則無明顯效果，這充分說明了異氟醚的保護作用是發(fā)揮在復(fù)氧期，而與缺氧期關(guān)系不大。有人認為異氟醚降低肝細胞氧耗的原因是抑制了某些耗能反應(yīng)，從而異氟醚可能通過此機制來增強肝細胞乏氧耐受力。如果此觀點成立，那么異氟醚就應(yīng)該在缺氧期保護了肝細胞活性，降低了LDH水平，顯然這一點與本實驗結(jié)果不一致。因為本實驗使用了禁食24h的大鼠肝臟，所以無法觀察異氟醚對缺氧期糖酵解的影響。

異氟醚在復(fù)氧期發(fā)揮保護作用可能與抑制復(fù)氧引起的氧自由基爆發(fā)有關(guān)，有人發(fā)現(xiàn)麻醉藥可抑制中性粒細胞中產(chǎn)生氧自由基及其損傷［2，3］，又有人證明氟烷可抑制單核細胞產(chǎn)生H2O2［4］，所以我們推測異氟醚有降低復(fù)氧期氧應(yīng)激的作用。

如圖2所示，GdCl3抑制了KC細胞活性后，肝臟缺氧－復(fù)氧損傷程度明顯下降，可見肝臟缺氧－復(fù)氧早期損傷中KC的重要作用。而2MAC異氟醚發(fā)揮了類似作用，所以我們認為異氟醚的保護作用可能與抑制KC活性有關(guān)。近來的研究發(fā)現(xiàn)：蛋白激酶C的活性能被吸入麻醉藥抑制［5］，而PKC－NADPH氧化酶途徑是KC產(chǎn)生細胞外O2-的關(guān)鍵途徑［6，7］，所以異氟醚可能通過抑制KC中PKC介導(dǎo)的信號途徑來減少O2-產(chǎn)生，抑制肝臟復(fù)氧損傷，更直接的證據(jù)有待在進一步研究中得到?！緟⒖嘉墨I】

1JaeschkeH，Anwarandkupffercell-inducedoxidantstressandischemia-reperfusioninjuryinratJPhsiol，1991，260：G355-362.

2曹云飛，俞衛(wèi)鋒.異丙酚對中性粒細胞活性氧生成及細胞內(nèi)游離Ca2+濃度的影響.臨床麻醉學(xué)雜志，2000，16(2)：96-98.

3曹云飛，薛惠斌，俞衛(wèi)鋒.異丙酚對紅細

胞自由基損傷的保護作用.臨床麻醉學(xué)雜志，2000，16(2)：90-92.

4StevensinGW，HallS，RudnickST，etanesthesiadecreaseshumanmonocytehydrogenperoxidegeneration：protectionofmonocytesbyactivationwithgammaImmunotoxicol，1987，9：489-510.

5SlaterST，CoxKJA，LombardiJV，etofproteinkinaseCbyalcoholsand，1993，364：82-84.

6PooleAW，PulaG，HersI，etprote