醫(yī)院檢驗(yàn)科學(xué)習(xí)培訓(xùn)課件（梅毒的實(shí)驗(yàn)室檢測）

梅毒的實(shí)驗(yàn)室檢測

醫(yī)院檢驗(yàn)科

病原體梅毒是一種幾乎可以侵犯全身所有器官，而產(chǎn)生多種癥狀和體征的慢性傳染性疾病。引起人類梅毒的病原體是梅毒螺旋體，屬于密螺旋體屬蒼白螺旋體蒼白亞種。

蒼白亞種梅毒蒼白螺旋體地方亞種地方性梅毒極細(xì)亞種雅司病密螺旋體屬

品他螺旋體品他病梅毒螺旋體的生物學(xué)特性1、直徑0.10~0.15μm，有8~14個(gè)致密而規(guī)則的小螺旋，兩端尖直。2、原生質(zhì)圓柱體上緊繞著3~4根周漿鞭毛，故運(yùn)動(dòng)活躍，運(yùn)動(dòng)方式多樣。3、G-，但不易著色。鍍銀染色呈棕褐色。4、在無活細(xì)胞的人工培養(yǎng)基中難培養(yǎng)，生長慢。5、抵抗力極弱，溫度(50℃時(shí)5分鐘死亡)和離體在外環(huán)境中干燥1-2小時(shí)即死亡，在溫度4℃3天后可死亡，因此4℃血庫存放3天以上的血液無傳染梅毒的危險(xiǎn)，對青霉素、四環(huán)素、紅霉素等抗生素敏感。肥皂水和一般消毒劑以及加溫42℃以上均極易將其殺滅。梅毒螺旋體傳播途徑

性接觸是主要的傳染途徑未經(jīng)治療的患者在感染后的1年內(nèi)最具有傳染性隨著病期的延長，傳染性越來越小到感染后2年，通過性接觸一般無傳染性母嬰傳播在妊娠7周時(shí)，梅毒螺旋體即可通過胎盤傳染未經(jīng)治療者，雖已無性傳播（病期>2年），但妊娠時(shí)仍可傳染給胎兒病期越長，傳染性越小;輸血傳染間接傳播：日常用品、接吻、哺乳、醫(yī)療器械等途徑（接觸部位附有梅毒螺旋體）。梅毒的分期梅毒的診斷梅毒的診斷早期梅毒（一期、二期和早期隱性梅毒）和晚期梅毒（三期和晚期隱性梅毒）必須依靠病史、癥狀及實(shí)驗(yàn)檢查進(jìn)行綜合分析梅毒的實(shí)驗(yàn)室檢查結(jié)果對診斷有決定性意義常用梅毒實(shí)驗(yàn)室檢測方法病原學(xué)檢測血清學(xué)檢測病原學(xué)檢查取材方法一期、二期梅毒時(shí)，取硬下疳、扁平濕疣、黏膜斑等皮損部位組織液或淋巴結(jié)穿刺術(shù)得到的組織液暗視野顯微鏡、鍍銀染色法和直接熒光法將上述組織液置于玻片上在暗視野顯微鏡下檢查，如見有呈現(xiàn)運(yùn)動(dòng)活潑，沿其長軸滾動(dòng)、屈伸、旋轉(zhuǎn)的螺旋體既有診斷意義。熒光顯微鏡下可見結(jié)合了熒光體而發(fā)光的梅毒螺旋體。病原學(xué)檢查的臨床意義病原學(xué)方法直接鏡檢到梅毒螺旋體，在臨床可確診梅毒，且具有快速、方便、易操作的特點(diǎn)。螺旋體檢查是診斷早期現(xiàn)癥梅毒的最佳方法，對于患者的早期診斷、及時(shí)治療、預(yù)后和盡早切斷傳染源都有十分重要的意義。如未見到梅毒螺旋體，并不能排除患梅毒的可能性。梅毒血清學(xué)檢測方法梅毒血清學(xué)檢測分類非梅毒螺旋體抗原血清學(xué)試驗(yàn)（非特異性梅毒抗體）梅毒螺旋體抗原血清學(xué)試驗(yàn)（特異性梅毒抗體）非梅毒螺旋體抗原血清學(xué)試驗(yàn)原理（抗心磷脂抗體）：人體感染了梅毒螺旋體后，組織受到破壞，釋放出來的一種類脂成分，與梅毒螺旋體結(jié)合形成完全抗原，刺激機(jī)體產(chǎn)生類脂質(zhì)抗體（反應(yīng)素）。主要是IgM和IgG混合抗體?？贵w產(chǎn)生時(shí)間感染3周-4周，硬下疳出現(xiàn)1周-2周一般在感染后5～7周（或硬下疳出現(xiàn)后2～3周）產(chǎn)生?？贵w作用無保護(hù)作用，治療監(jiān)測。未經(jīng)治療的病人，其血清內(nèi)的反應(yīng)素可長期存在。經(jīng)正規(guī)治療后，反應(yīng)素可以逐漸減少至轉(zhuǎn)為陰性。原理和方法反應(yīng)原理抗原抗體結(jié)合形成復(fù)合物，凝集成網(wǎng)狀沉淀顆粒被肉眼所見抗原基本成分心磷脂、卵磷脂和膽固醇方法包括：快速血漿反應(yīng)素環(huán)狀卡片試驗(yàn)(RPR)不加熱血清反應(yīng)素(USR)甲苯胺紅不加熱血清試驗(yàn)（TRUST）性病研究實(shí)驗(yàn)室試驗(yàn)(VDRL)等。四種非特異性試驗(yàn)方法比較VDRLUSRRPRTRUST抗原成分心磷脂、卵磷脂、膽固醇同前+EDTA+氯化膽堿同前+EDTA+氯化膽堿+活性炭同前+EDTA+氯化膽堿+甲苯胺紅抗原穩(wěn)定性不穩(wěn)定,1天穩(wěn)定4℃～8℃保存12個(gè)月穩(wěn)定4℃～8℃保存12個(gè)月穩(wěn)定4℃～8℃保存12個(gè)月血清試驗(yàn)前處理需滅活不需滅活不需滅活不需滅活反應(yīng)板及結(jié)果判斷玻片，肉眼或顯微鏡玻片，肉眼或顯微鏡紙卡片，肉眼紙卡片，肉眼注釋唯一用于檢查腦脊液的試驗(yàn)，診斷神經(jīng)梅毒結(jié)果容易判斷結(jié)果容易判斷一期敏感性（未經(jīng)治療）74%-87%77%-88%77%-99%77%-99%二期敏感性（未經(jīng)治療）100%100%100%100%晚期敏感性（未經(jīng)治療）98%99%98%99%RPR/TRUST檢測流程試驗(yàn)前期準(zhǔn)備RPR儀(水平旋轉(zhuǎn)儀器)必須滴?。≡噭?/p>

50μl移液器、吸頭記號(hào)筆工作服一次性手套、口罩、帽子生物安全柜梅毒自動(dòng)旋轉(zhuǎn)儀測速:100轉(zhuǎn)/MIN（±2轉(zhuǎn)）檢測流程（定性）加樣：吸取50μl血清（漿）放在卡片圈中，并均勻地涂布在整個(gè)圈內(nèi)。加抗原：將抗原輕輕搖勻，用試劑盒提供的針頭加1滴抗原。反應(yīng)：將卡片置梅毒自動(dòng)旋轉(zhuǎn)儀8分鐘立即在亮光下觀察結(jié)果。檢測流程（定量）稀釋液準(zhǔn)備：在圈內(nèi)加入50μl生理鹽水（根據(jù)需要確定稀釋度），勿將鹽水涂開。加樣：吸取50μl血清(漿)與各圈中鹽水作系列稀釋，并涂布滿整個(gè)圈內(nèi)。重復(fù)定性試驗(yàn)后兩步。凝集反應(yīng)強(qiáng)度分級(jí)：3+～4+：圓圈內(nèi)出現(xiàn)中到大的紅色絮狀物，液體清亮。2+：圓圈內(nèi)出現(xiàn)小到大的紅色絮狀物，液體較清亮。1+：圓圈內(nèi)出現(xiàn)小的紅色絮狀物，液體渾濁?！簣A圈內(nèi)僅見紅色集中于中央一點(diǎn)或均勻分散。RPR定量試驗(yàn)中等至大的凝塊為陽性（圈4和7）有明確但很小的凝塊為弱陽性（圈2和3）顆粒均勻分布（圈1,5,8-10）或稍粗糙（圈6）為陰性臨床意義早期梅毒（一期、二期）經(jīng)足量規(guī)則抗梅毒治療后3個(gè)月，試驗(yàn)抗體滴度下降2個(gè)稀釋度，6個(gè)月下降4個(gè)稀釋度。一期梅毒1年后轉(zhuǎn)為陰性二期梅毒2年后轉(zhuǎn)為陰性。晚期梅毒治療后血清滴度下降緩慢，2年后約50%病人血清反應(yīng)仍為陽性早期梅毒硬下疳出現(xiàn)1周-2周后，血清可呈陽性。經(jīng)治療后血清滴度可下降并陰性，故可作為療效觀察、判愈、復(fù)發(fā)或再感染的指征。假陽性問題假陽性：非梅毒患者的血清反應(yīng)呈陽性①技術(shù)性假陽性由于標(biāo)本的保存不當(dāng)（如細(xì)胞污染或溶血）、試劑質(zhì)量差或過期、或?qū)嶒?yàn)室操作錯(cuò)誤所造成。②生物學(xué)假陽性是由于患者有其他疾病或生理狀態(tài)發(fā)生變化，使梅毒血清試驗(yàn)出現(xiàn)陽性急性生物學(xué)假陽性反應(yīng)的疾病風(fēng)疹水痘傳染性單核細(xì)胞增多癥傳染性肝炎上呼吸道感染肺炎球菌性肺炎病毒性肺炎牛痘疹慢性生物學(xué)假陽性反應(yīng)的疾病系統(tǒng)性紅斑狼瘡自身免疫性溶血性貧血盤狀紅斑狼瘡結(jié)節(jié)性多動(dòng)脈炎類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎橋本氏甲狀腺炎風(fēng)濕性心臟病干燥綜合征毒品癮者慢性腎炎肝硬化老年麻風(fēng)(是唯一產(chǎn)生慢性生物學(xué)假陽性的感染性疾病)妊娠的假陽性反應(yīng)這是一種生理情況下的生物學(xué)假陽性

假陽性發(fā)生率較低有報(bào)告為0.4%，滴度低。假陽性問題梅毒假陽性反應(yīng)的處理技術(shù)性假陽性反應(yīng)一般是由于操作錯(cuò)誤引起的假陽性反應(yīng)，經(jīng)過重復(fù)試驗(yàn)即可除外。對急性生物學(xué)假陽性反應(yīng)，應(yīng)做TPHA（TPPA）等試驗(yàn)進(jìn)行排除。前帶現(xiàn)象原理指二期梅毒患者非梅毒螺旋體抗原血清試驗(yàn)中，有時(shí)血清中存在高濃度的抗體時(shí)出現(xiàn)的弱陽性、不典型或陰性反應(yīng)的結(jié)果。處理將血清稀釋后再進(jìn)行試驗(yàn)。血清固定耐血清性（血清固定）指經(jīng)抗梅毒治療后，非梅毒螺旋體抗原血清試驗(yàn)在一定時(shí)期內(nèi)不轉(zhuǎn)陰。早期的耐血清性常與治療量不足或不規(guī)則治療、復(fù)發(fā)、再感染或有神經(jīng)系統(tǒng)梅毒等因素有關(guān)。梅毒螺旋體抗原血清學(xué)試驗(yàn)試驗(yàn)原理檢測血中特異性抗梅毒螺旋體特異蛋白為抗原的抗體（IgG和IgM）。特異性IgM型抗梅毒螺旋體抗體，感染2周后即可測出。實(shí)驗(yàn)方法梅毒螺旋體顆粒凝集試驗(yàn)(TPPA)

梅毒螺旋體血球凝集試驗(yàn)(TPHA)

梅毒酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（TP-ELISA）梅毒免疫層析法-梅毒快速檢測(RT)

熒光螺旋體抗體吸收試驗(yàn)（FTA-ABS）化學(xué)發(fā)光免疫分析法（CLIA）梅毒螺旋體蛋白印跡試驗(yàn)（WB）TPPA/TPHA原理TPPA試驗(yàn)原理與TPHA試驗(yàn)基本相同TPPA試驗(yàn)用梅毒螺旋體致敏明膠顆粒TPHA試驗(yàn)中梅毒螺旋體致敏羊紅細(xì)胞特點(diǎn)梅毒螺旋體(Nichols株)全抗原操作步驟1.試劑準(zhǔn)備：試驗(yàn)前將試劑和待檢標(biāo)本恢復(fù)到室溫。

2.加稀釋液：每份樣本做4孔，加標(biāo)本稀釋液加至微量反應(yīng)板孔內(nèi)，第1孔100微升，第2～4孔各25微升。3.樣本稀釋：取血清25微升加至第1孔，混勻后取25微升至第2孔，混勻后取25微升至第3孔，混勻后取25微升至第4孔，混勻后棄去25微升。4.加對照液：第3孔加未致敏顆粒25微升，第4孔加致敏顆粒25微升。5.混合：將反應(yīng)板置振蕩器振蕩30秒。6.反應(yīng)：置有蓋濕盒，孵育2h，或放4℃冰箱過夜觀察結(jié)果。

結(jié)果判斷1.觀察加未致敏顆粒的第3孔，不出現(xiàn)凝集為有效試驗(yàn)。

2.觀察凝集反應(yīng)強(qiáng)度：分級(jí)如下。

4+：顆粒光滑覆蓋整個(gè)孔底，有時(shí)邊緣有折疊。

3+：顆粒光滑覆蓋大部分孔底。

2+：顆粒光滑集聚覆蓋孔底，周圍有一顆粒環(huán)。

1+：

顆粒光滑集聚覆蓋孔底，周圍有一明顯顆粒環(huán)。

±：顆粒沉集孔底，中央形成一小點(diǎn)。

一：顆粒緊密沉積孔底中央。熒光螺旋體抗體吸收試驗(yàn)

（FTA-ABS）原理將有完整形態(tài)的梅毒螺旋體作為抗原，加上經(jīng)吸收劑（用Reiter螺旋體制備而成）吸收過的梅毒患者血清形成抗原抗體復(fù)合物，再加入異硫氰酸熒光素（FTIC）標(biāo)記的抗人免疫球蛋白，與抗梅毒螺旋體抗體結(jié)合，形成熒光的抗原抗體復(fù)合物。在熒光顯微鏡下，螺旋體顯出蘋果綠色的熒光，即為陽性反應(yīng)。曾經(jīng)認(rèn)為FTA-ABS試驗(yàn)是檢測梅毒的“金標(biāo)準(zhǔn)”試驗(yàn)。我院檢驗(yàn)科梅毒實(shí)驗(yàn)檢測概況

發(fā)報(bào)告流程(僅供參考)1.快速法陽性，非酶(RPR或TRUST)陰性，即單陽性，轉(zhuǎn)免疫室做酶法，給臨床醫(yī)生打電話進(jìn)一步復(fù)查，把非酶陰性報(bào)告發(fā)出去，第二天報(bào)酶法陰或陽性報(bào)告單.2.快速法陽非酶陽，要做定量滴度，即雙陽不需再轉(zhuǎn)免疫室直接報(bào)結(jié)果。不同醫(yī)院結(jié)合實(shí)際情況做好一套方案。

艾滋檢測簡要檢測注意事項(xiàng)---HIV抗體檢測工作應(yīng)該按照2015版《全國艾滋病檢測技術(shù)規(guī)范》，在合格的艾滋病檢測實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行---為了減少檢測的錯(cuò)誤和誤差，應(yīng)采取嚴(yán)格的質(zhì)量保證、質(zhì)量控制和質(zhì)量評價(jià)措施---注意實(shí)驗(yàn)室生物安全防護(hù)和職業(yè)暴露預(yù)防---嚴(yán)格遵守實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)操作程序（SOP），按照試劑盒說明書操作，注意防止樣品間交叉污染樣品篩查檢測一陰一陽均陽性反應(yīng)陰性報(bào)告送初篩實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行復(fù)檢重復(fù)檢測均陰性反應(yīng)陽性反應(yīng)原有試劑＋另一種篩查試劑篩查試劑陰性反應(yīng)檢測點(diǎn)篩查試驗(yàn)流程圖新生兒艾滋病感染的有關(guān)早期診斷55艾滋早診總目標(biāo)加強(qiáng)全省嬰兒早期診斷工作，提高嬰兒早期診斷服務(wù)能力和可及性，盡早明確艾滋病感染孕產(chǎn)婦所生嬰兒艾滋病感染狀況，使感染艾滋病的嬰兒得到及時(shí)治療。嬰兒早期診斷的適用范圍HIV感染產(chǎn)婦所生嬰幼兒，在其出生后

6周及

3個(gè)月采血

進(jìn)行艾滋病感染早期診斷檢測母親HIV感染狀態(tài)不詳，出現(xiàn)HIV相關(guān)臨床表現(xiàn)，臨床懷疑HIV感染者。