DB4117T 320-2021動(dòng)物病原微生物實(shí)驗(yàn)室菌種保存和活化技術(shù)指南

ICS65.020.99CCSB40UH4117駐馬馬市地方標(biāo)準(zhǔn)DB4117/T320—2021動(dòng)物病原微生物實(shí)驗(yàn)室菌種保存和活化

技術(shù)指南2021-10-29實(shí)施20212021-10-29實(shí)施駐馬店市市場監(jiān)督管理局 發(fā)布DB4117/T320DB4117/T320—2021本文件按照GB/T1.1—2020《標(biāo)準(zhǔn)化工作導(dǎo)則第1部分：標(biāo)準(zhǔn)化文件的結(jié)構(gòu)和起草規(guī)則》的規(guī)定起草。本文件由駐馬店市畜牧局提岀。本文件歸口于駐馬店市畜牧獸醫(yī)標(biāo)準(zhǔn)化技術(shù)委員會(huì)。本文件起草單位：駐馬店市獸藥飼料（動(dòng)物產(chǎn)品）質(zhì)量檢驗(yàn)監(jiān)測中心、許昌市建安區(qū)動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心、許昌市動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心、新蔡縣農(nóng)業(yè)綜合行政執(zhí)法大隊(duì)、三門峽市陜州區(qū)農(nóng)業(yè)農(nóng)村局、上蔡縣農(nóng)業(yè)綜合行政執(zhí)法大隊(duì)、許昌市建安區(qū)動(dòng)物衛(wèi)生監(jiān)督所、上蔡縣臥龍街道辦事處社區(qū)服務(wù)中心、確山縣動(dòng)物衛(wèi)生監(jiān)督所、上蔡縣農(nóng)業(yè)綜合行政執(zhí)法大隊(duì)、泌陽縣動(dòng)物衛(wèi)生監(jiān)督所、泌陽縣動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心、平頂山市畜產(chǎn)品質(zhì)量安全監(jiān)測中心、遂平縣農(nóng)業(yè)農(nóng)村局動(dòng)物衛(wèi)生監(jiān)督所、上蔡縣農(nóng)業(yè)綜合行政執(zhí)法大隊(duì)、駐馬店市農(nóng)業(yè)農(nóng)村局、西平縣農(nóng)業(yè)農(nóng)村局農(nóng)業(yè)綜合行政執(zhí)法大隊(duì)、平輿縣農(nóng)業(yè)農(nóng)村局、遂平縣農(nóng)業(yè)農(nóng)村局、駐馬店市動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心、駐馬店市質(zhì)量技術(shù)監(jiān)督檢驗(yàn)測試中心、正陽縣獸藥飼料質(zhì)量檢驗(yàn)監(jiān)測中心、西華縣動(dòng)物衛(wèi)生監(jiān)督所。本文件主要起草人：馬寧、曹世杰、葛會(huì)杰、陶相宇、李佳佳、劉建華、王建軍、侯明陽、李永峰、蘇高莉、李超、吳大會(huì)、邱孜博、時(shí)海燕、張友超、陳玉霞、張琛、張峰、王旺、鄭豐、常清華、汪景慧、孫政豪、羅少偉。本文件為首次發(fā)布。動(dòng)物病原微生物實(shí)驗(yàn)室菌種保存和活化

技術(shù)指南1范圍本文件規(guī)定了動(dòng)物病原微生物實(shí)驗(yàn)室常用的菌種保藏和活化的術(shù)語和定義、要求、標(biāo)準(zhǔn)菌株菌種獲取、菌種保存、菌種活化和記錄。本文件適用于動(dòng)物病原微生物實(shí)驗(yàn)室菌種的保存和活化。本文件所述動(dòng)物病原微生物實(shí)驗(yàn)室以下均簡稱為實(shí)驗(yàn)室。2規(guī)范性引用文件下列文件中的內(nèi)容通過文中的規(guī)范性引用而構(gòu)成本文件必不可少的條款。其中，注日期的引用文件,僅該日期對(duì)應(yīng)的版本適用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。GB19489實(shí)驗(yàn)室生物安全通用要求GB/T27025檢測和校準(zhǔn)實(shí)驗(yàn)室能力的通用要求GB/T27476.1檢測實(shí)驗(yàn)室安全第1部分：總則SN/T2660食品微生物實(shí)驗(yàn)室菌種保藏方法3術(shù)語和定義下列術(shù)語和定義適用于本文件。1菌種可以培養(yǎng)的有一定科學(xué)意義或?qū)嵱脙r(jià)值的細(xì)菌、真菌、病毒、細(xì)胞等代表株。3.2樣本人工采集的、經(jīng)鑒定具有保藏價(jià)值的含有動(dòng)物病原微生物的體液、組織、排泄物、分泌物、污染物等物質(zhì)。3.3病原微生物能夠使人或者動(dòng)物致病的微生物。3.4菌種保存將微生物菌種用各種適宜方法妥善保存，避免死亡、污染，保持其原有性狀基本穩(wěn)定。3.5菌種活化菌種活化就是將保藏狀態(tài)的菌種放入適宜的培養(yǎng)基中培養(yǎng)，逐級(jí)擴(kuò)大培養(yǎng)得到純而壯的培養(yǎng)物。1DB4117/T320DB4117/T320—2021223.6標(biāo)準(zhǔn)菌株直接從有資質(zhì)的菌種保藏機(jī)構(gòu)獲得并至少定義到屬或種的水平的菌株，按菌株特性進(jìn)行分類和描述。3.7代將微生物接種至新鮮培養(yǎng)基上或其中，每萌發(fā)一次即稱一代，未開啟原包裝的標(biāo)準(zhǔn)菌株通常視為第0代。4基本要求4.1動(dòng)物病原微生物的保存和活化應(yīng)符合《實(shí)驗(yàn)室生物安全通用要求》等國家強(qiáng)制標(biāo)準(zhǔn)及相關(guān)政策法規(guī)要求。4.2針對(duì)動(dòng)物病原微生物菌種特性選擇適宜的保存方法，宜采用兩種或兩種以上的方法保存，以保持菌種的原有性狀穩(wěn)定和避免損失。4.3動(dòng)物病原微生物菌種保存所使用的器皿要求清潔、透明、無破損、無裂痕。4.4根據(jù)動(dòng)物病原微生物菌種保存需要選擇適合培養(yǎng)基。4.5動(dòng)物病原微生物菌種保存過程中應(yīng)注意無菌操作，避免污染。4.6動(dòng)物病原微生物菌種培養(yǎng)至穩(wěn)定期或成熟期后進(jìn)行保存。4.7動(dòng)物病原微生物菌種保存期間，要定期檢查菌種存放設(shè)施的溫度和濕度、菌株有無污染、綿塞有無霉變，如有異常應(yīng)重新移植培養(yǎng)后更換。8動(dòng)物病原微生物菌種保存工作不能對(duì)周圍環(huán)境造成污染和危害。5標(biāo)準(zhǔn)菌種獲取1獲取途徑5.1.1標(biāo)準(zhǔn)菌種的獲取可通過國家級(jí)菌種保藏中心或省級(jí)保藏中心獲取。5.1.2從上級(jí)機(jī)構(gòu)下發(fā)的質(zhì)控盲樣中分離岀的菌株，被證明結(jié)果是正確的、且從考核機(jī)構(gòu)獲得該菌種的保藏機(jī)構(gòu)名稱縮寫及菌種編號(hào)的/也可作為標(biāo)準(zhǔn)菌株使用。5.1.3從其他有效的，經(jīng)過資質(zhì)認(rèn)證的商業(yè)機(jī)構(gòu)獲得原包裝的標(biāo)準(zhǔn)菌種。5.2驗(yàn)收實(shí)驗(yàn)室應(yīng)制定標(biāo)準(zhǔn)菌株驗(yàn)收控制程序，確認(rèn)供貨商資質(zhì)及來源，確保所獲取的標(biāo)準(zhǔn)菌株滿足要求。3標(biāo)準(zhǔn)菌種保存通常情況下，應(yīng)按照制造商提供的使用說明進(jìn)行保存。6工作菌種保存方法6.1定期移植法1.1適用范圍適用于大多數(shù)細(xì)菌和真菌。DB4117/T320DB4117/T320—2021#6.1.2操作步驟定期移植方法操作步驟如下：a） 接種：以無菌操作將菌株純培養(yǎng)物接種到固體培養(yǎng)基（斜面）或液體培養(yǎng)基中，接種固體培養(yǎng)基可采用點(diǎn)接、劃線或穿刺等方法。b） 培養(yǎng)：在所保存菌種的最適培養(yǎng)條件下將細(xì)胞培養(yǎng)至穩(wěn)定期或成熟期，并進(jìn)行純度檢查。c） 保存：培養(yǎng)好的菌種于4°C?6°C保存，需室溫保存的菌種在室溫（25°C）下保存。保存培養(yǎng)基一般含較多的有機(jī)氮，糖分總量不超過2%?6.1.3保存周期每3-6個(gè)月移植一次。有特殊要求的按其規(guī)定移植。易保存于相對(duì)濕度為50%?70%的環(huán)境中。6.2液體石蠟法6.2.1適用范圍適用于部分在有氧狀態(tài)下生產(chǎn)良好的細(xì)菌、酵母、霉菌及放線菌。6.2.2操作步驟液體石蠟法操作步驟如下：a） 灌入石蠟：將無菌的液體石蠟在無菌條件下注入剛培養(yǎng)好的新鮮培養(yǎng)斜面培養(yǎng)物上，液面高于斜面頂部1cm左右，使菌體與空氣隔絕。b） 保存：注入液體石蠟的菌種斜面以直立狀態(tài)置低溫（4。?6°C）干燥處保存，需室溫保存的菌種在室溫（25°C）下保存。6.2.3保存周期保存時(shí)間為2T0年。保存期間應(yīng)定期檢查，當(dāng)液體石蠟減少露岀培養(yǎng)基斜面時(shí)，應(yīng)及時(shí)補(bǔ)充滅菌的液體石蠟。如發(fā)現(xiàn)異ME重新培養(yǎng)后補(bǔ)上空缺。6.3冷凍干燥保存法6.3.1 適用范圍本方法適用于大多數(shù)細(xì)菌、放線菌、病毒、噬菌體、立克次氏體、部分絲狀真菌和酵母菌等的保存。6.3.2操作步驟冷凍干燥保存法操作步驟如下：a） 菌種準(zhǔn)備：在所保存菌種的最適培養(yǎng)條件下將細(xì)胞采用斜面培養(yǎng)、液體培養(yǎng)等方式培養(yǎng)至穩(wěn)定期或成熟期，進(jìn)行純度檢查后與保護(hù)劑混合均勻，分裝。b） 分裝：分裝菌液應(yīng)在無菌條件下操作。采用較長的滴管，直接將菌液滴本安甑管或凍存管底部，每管分裝量約0.1mL?0.2mL?若是球形安甑管，裝量為半個(gè)球部。分裝后用脫脂棉堵住安甑管管口，注意不要過緊或過松。分裝時(shí)間盡量要短，最好在1h?2h內(nèi)分裝完畢并預(yù)凍。c） 預(yù)凍：一般預(yù)凍2h以上，溫度達(dá)到-40°C左右。d） 冷凍干燥：將預(yù)凍后的樣品安甑瓶迅速置于已充分預(yù)冷的冷凍干燥機(jī)樣品艙內(nèi)按照程序冷凍干燥。完畢后取岀樣品管置于干燥器內(nèi)，備用。冷凍干燥時(shí)間一般為8h?20h。e） 安甑管封口及真空檢驗(yàn)：從干燥器中取岀冷凍干燥完全的安甑管，在距管口5cm左右用噴射火焰將管拉細(xì)后將管口連接到與真空安甑管泵相連的橡皮管上，打開真空泵，在真空下用噴射火焰對(duì)準(zhǔn)管細(xì)頸部加熱熔封。熔封后的干燥管可采用高頻電火花真空測定儀檢驗(yàn)真空度。f） 保存：封口完全的冷凍干燥管保存于4°C?10°C。6.3.3保存周期一般在10年左右。6.4瓷珠保存法6.4.1適用范圍適用于大多數(shù)微生物，如噬菌體、放線菌、絲狀真菌、霉菌等的保存。6.4.2操作步驟瓷珠保存法操作步驟如下：a） 將直徑為2mm?3mm的瓷珠分裝到小螺帽瓶中制成冷凍管，高壓滅菌。b） 在無菌狀態(tài)下打開冷凍管，在所保存菌種的最適培養(yǎng)條件下降細(xì)胞培養(yǎng)至穩(wěn)定期或成熟期，進(jìn)行純度檢查后，將菌種新鮮培養(yǎng)物加入到培養(yǎng)基中制成混懸液，無菌操作將混懸液轉(zhuǎn)入到冷凍管中。c） 封好冷凍管顛倒四至五次乳化菌種培養(yǎng)基混懸液。切勿渦旋振蕩。d） 菌種吸附于瓷珠上后，將多余的混懸液吸岀；如使用商業(yè)化的細(xì)胞凍存管，此時(shí)應(yīng)按照產(chǎn)品說明書進(jìn)行操作。e） 保存：將冷凍管存于-70°C。4.3保存周期可保存10年。7菌種活化1標(biāo)準(zhǔn)菌種活化將標(biāo)準(zhǔn)菌種按說明書要求轉(zhuǎn)種于適當(dāng)?shù)呐囵B(yǎng)基內(nèi)，于適當(dāng)溫度下培養(yǎng)適當(dāng)時(shí)間，進(jìn)行復(fù)蘇。宜將標(biāo)準(zhǔn)菌種懸浮于營養(yǎng)肉湯中進(jìn)行復(fù)蘇。7.2保存菌種活化7.2.1定期移植法保存菌種取樣后直接接種于固體培養(yǎng)基或適量的液體培養(yǎng)基中進(jìn)行活化。7.2.2液體石蠟法保存菌種恢復(fù)培養(yǎng)時(shí)，挑取少量菌體轉(zhuǎn)接在適宜培養(yǎng)基上，生長繁殖獲得第1代菌種后，挑取單菌落再重新轉(zhuǎn)接一次。7.2.3冷凍干燥法保存的菌種復(fù)蘇先用70%酒精棉擦拭管的上部，用玻璃刀劃開管頂端，用滅菌水或培養(yǎng)液溶解菌塊，使用無菌吸管移入新鮮培養(yǎng)基，進(jìn)行培養(yǎng)。DB4117/T320DB4117/T320—20217.2.4瓷珠保存法保存菌株在無菌條件下打開冷凍管，用無菌針或接種環(huán)取岀一粒瓷珠。封好冷凍管并盡快將其送回低溫條件下保存。將瓷珠直接接種于固體培